專利名稱：一種豬瘟疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種豬瘟疫苗及其制備方法，尤其涉及豬瘟疫苗制備中重組質粒和重組病毒的制備，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
豬瘟(hogcholera, HC)又稱古典豬瘟(classical swine fever, CSF)，是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性熱性傳染病，死亡率高達90%以上。1984年世界動物衛生組織(OIE)將其列入A類傳染病，也是世界糧農組織和各國政府密切關注的主要傳染
病之一。1908年匈牙利HutyraK-oves制成豬瘟高免血清后，人們一直用高免血清一血毒同時肌注來免疫豬群。但由于高免血清價格昂貴，獲取困難，加之血毒有散毒的危險，因此各國學者在以后的60年間相繼研制出許多滅活疫苗，其中福爾馬林和結晶紫滅活疫苗曾被廣泛應用。滅活疫苗雖然安全，但是保存期短。1955年，周泰沖等人將CSFV石門強毒株經兔體214次傳代后成功制備出兔化弱毒株。繼續傳代480次，成為商品化的標準疫苗株。后來被命名為中國疫苗株(C-strain) 或豬瘟兔化弱毒(HCLV)株，很多商品化的疫苗株都由其衍生而來。1957年以來廣泛用于世界許多國家，是目前世界上使用最廣泛的弱毒苗，對控制CSF流行起到了關鍵作用。相比其它商品化的疫苗，它的安全性更高，菌毒在豬體內持續存在不超過3周，且不會引起仔豬和懷孕母豬發病；免疫效果更好，免疫一次就能產生完全的保護，保護時間長達一年甚至終生。常規弱毒疫苗盡管安全有效，但存在免疫抗體與感染抗體不能區分的問題，不能通過血清學方法來檢測一個免疫豬群中的野毒感染，這對于豬瘟的防制與凈化非常不利，也正因為這個原因，采取豬瘟免疫政策國家的豬及其制品的出口受到嚴格限制，這就使得開發能用血清學方法區分免疫豬與感染豬的新型疫苗成為當務之急。亞單位疫苗是一類能通過血清學方法方便的區分免疫動物與感染動物的疫苗。目前已有2種亞單位疫苗在歐盟獲得了注冊，這2種疫苗均是以桿狀病毒表達的CSFV E2蛋白作為免疫原。但這種疫苗也存在一些缺陷，試驗表明E2蛋白亞單位疫苗在免疫14d后才能產生對野毒感染的保護；同時，如果免疫時機體內有低水平母源抗體存在，至少要免疫兩次才可誘導臨床保護，即使如此，大多數已經產生臨床保護的豬在攻毒時仍會有發熱、白細胞減少和病毒血癥的情況出現。另外，E2蛋白亞單位疫苗能否預防水平傳播和垂直傳播也有待證實。重組活載體疫苗是最先開始研究的標記疫苗，活載體疫苗能引起體液免疫和細胞免疫，且能在體內復制，能誘導長期和高效的免疫保護。用于豬瘟標記疫苗的病毒載體有痘病毒、偽狂犬病病毒(PRV)、豬腺病毒(PAV)等。但是它們都有明顯的缺陷重組痘苗病毒可能對未接種過痘苗的人具有潛在的感染性；重組痘苗病毒傳播到環境中可能與野生型痘苗病毒發生重組，出現毒力返強現象；痘苗病毒對豬的感染性較低，必須注射高劑量的重組痘苗病毒才能誘導有效的保護；基于PRV載體疫苗不適用于偽狂犬病流行地區，因為PRV抗體對于免疫及血清學檢測有一定影響；而rPAV-E2和rPRV-E2雖然高效而且安全，但是沒有得到具體的疫苗試驗或者田間實驗證實。DNA疫苗具備很多優勢，發展非常迅速，但也存在潛在的安全隱患，如質粒DNA是否會整合到宿主基因組中、是否會引起免疫耐受等問題尚不清楚，且存在一定的安全隱患， 此外DNA疫苗免疫效力尚有待進一步提高。基于以上各種情況，研究新型、有效的豬瘟疫苗已為研究者的努力方向，而且E2、 EO蛋白是豬瘟病毒的主要抗原位點，是豬瘟疫苗研制的主要靶點。桿狀病毒表面展示系統是近幾年發展起來的一種新的真核展示系統，可彌補原核展示系統的不足，并保持表面展示系統的優點，通過篩選表達特異蛋白的重組桿狀病毒粒子即便于外源蛋白的純化，可用來展示需糖基化、二硫鍵異構化等翻譯后修飾才表現功能活性的復雜真核蛋白，在高親和力抗體及多肽藥物的篩選、蛋白質抗原表位分析等方面具有廣闊的應用前景。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種克服上述缺陷的豬瘟疫苗。本發明通過構建一種重組家蠶桿狀病毒，并運用桿狀病毒表面展示技術將豬瘟病毒的主要抗原基因E2、 EO融合展示在家蠶桿狀病毒囊膜表面，以家蠶蛹作為生物反應器生產重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為豬瘟疫苗原進行生產，相比于傳統豬瘟疫苗生產具有安全性好、生產成本低、產量高、易于操作、適用于大規模生產的特點。為達到上述目的，本發明采用的技術方案如下
一種家蠶重組桿狀病毒angp64-E2-2A-E0，該病毒于2011年12月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為家蠶核型多角體病毒 Qiombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5604。上述家蠶重組桿狀病毒的制備方法，包括以下步驟
(a)由PCR擴增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列SP和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列TM，通過I/ EcoR I和煬ο I/Hind III雙酶切插入 PFastBacI載體多克隆位點上下游兩端，構建表面展示系統轉移載體pFaStBaCI-gp64 ；
(b)采用pvL1393-E2-2A-E0 重組質粒為模板，以 SEQ ID: NO. 6 和 SEQ ID: NO. 7 為引物進行PCR擴增，構建融合基因E2-2A-E0 ；
(c)將步驟(b)所得的融合基因E2-2A-E0雙酶切產物克隆至步驟(a)所得表面展示系統轉移載體pFaStBacI-gp64上，并篩選陽性克隆，獲得轉移重組質粒 pFastBacI-gp64-E2-2A-E0；
(d)將步驟(c)所得轉移重組質粒pFastBacI-gp64-E2-2A-E0轉化大腸桿菌DHlOBac 感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養板上進行藍白斑篩選，避光培養40-4 后挑取白斑，培養16-20h后菌液稀釋IO6重新涂板做篩選，挑取白斑至LB培養基搖菌培養16-20h后，用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定；
(e)取步驟(d)所鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞，發病后獲得零代病毒懸液0-4°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0。上述重組桿狀病毒angp64-E2-2A-E0表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID: NO. 11 所示。
上述蛋白的制備方法，包括以下步驟
(a)將上述重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；
(b)以穿刺接種法接種家蠶五齡幼蟲、蛹；
(c)收集表達的上述蛋白。本發明進一步提供上述家蠶重組桿狀病毒aiigp64-E2-2A-E0在豬瘟疫苗制備中的應用。本發明還提供上述蛋白在豬瘟疫苗制備中的應用。本發明具有以下有益效果
本發明利用家蠶蛹、五齡幼蟲為生物反應器，高效表達豬瘟病毒主要抗原蛋白E2和 E0，通過將桿狀病毒gp64蛋白的N端信號肽和C端跨膜區與E2-2A-E0基因融合，使豬瘟病毒主要抗原重組融合蛋白展示于桿狀病毒囊膜表面形成一個帶有外源病毒主要抗原的桿狀病毒偽病毒，該偽病毒具有外源病毒的免疫原性，可以作為重組基因工程疫苗，而且家蠶桿狀病毒表達系統屬于真核表達系統，具有翻譯后的加工修飾功能，是表達的外源蛋白具有更接近于天然的生物活性。由于家蠶蛹中蛋白對人畜無毒無害，所以本發明以蠶蛹為生物反應器生產的基因工程疫苗對人畜產生的副作用小，而且適用于大規模生產，生產成本低。此外，本發明使用家蠶桿狀病毒表面展示技術表達豬瘟病毒重組融合蛋白E2-2A-E0用于豬瘟疫苗的研制也尚屬首例。
圖1是本發明中構建的桿狀病毒表面展示系統轉移載體pFaStBaCI-gp64的圖譜；
圖2是本發明構建的重組轉移質粒pFastBaCI-gp64-E2-2A-E0的圖譜示意圖； 圖3是本發明構建的重組桿狀病毒angp64-E2-2A-E0的模式圖。
具體實施例方式應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發明提供進一步的發明。除非另有說明，本文使用的所有科學和技術術語具有與本發明所屬技術領域人員通常理解的相同含義。
下面結合實施例詳細說明本發明的具體內容。實施例1 融合基因E2-2A-E0的獲得
根據NCBI上豬瘟病毒E2、EO基因的序列(基因登錄號E0為EF015^2. 1，E2為 DQ907718. 1)設計E2基因的上游引物SEQ ID: NO. 6和EO基因的下游引物SEQ ID: NO. 7， 上游引物引入I酶切位點，下游引物引入損ο I酶切位點以中國農業科學院張志芳老師贈送的pvL1393-E2-2A-E0重組質粒為模板，進行PCR擴增，獲取融合基因E2-2A-E0，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID: NO. 10。具體程序和反應體系如下反應程序
IJI
反應體系
10XPCR Buffer5 μ 1
25mM MgCl24 μ 1
2.5mM dNTPs4 μ 1
SEQ ID: NO. 61 μ 1
SEQ ID: NO. 71 μ 1
模板1 μ 1
KOD Plus DNA 聚合酶(Τ0Υ0Β0 公司)1 μ
加無菌ddH20至50 μ 1
將PCR產物用feoR l,Xho I (均購自^witrogen公司)進行雙酶切后，割膠回收以備后用。 實施例2 桿狀病毒表面展示系統轉移載體pFaStBaCI-gp64的構建
根據NCBI上獲得的桿狀病毒gp64基因序列(基因登陸號為L33180. 1)，設計引物SEQ ID: NO. 2、SEQ ID: NO. 3通過重疊延伸PCR技術(SOE-PCR)特異擴增出其信號肽(SP)序列，以SEQ ID: N0.4、SEQ ID: NO. 5為引物，提取的野生桿狀病毒基因組為模板特異擴增出跨膜區域(TM)序列，如SEQ ID: N0.9，并以NCBI上獲取的SP序列為模板設計鑒定上游引物SEQ ID: NO. 1，各步具體反應程序如下 (1) SP序列的合成 反應程序
反應體系 10XPCR Buffer 25mM MgCl2 2. 5mM dNTPs SEQ ID: NO. 2
5 μ 1 4 μ 1 4 μ 1 1 μ 1SEQ ID: NO. 31 μ 1
KOD Plus DNA 聚合酶(TOYOBO 公司)1 μ
加無菌ddH20至50 μ 1
將PCR產物用I,EcoR I (均購自Fermentas公司)進行雙酶切后，割膠回收以備后用。 ⑵TM序列的合成
反應程序
反應體系
10XPCR Buffer5 μ 1
25mM MgCl24 μ 1
2.5mM dNTPs4 μ 1
SEQ ID: NO. 41 μ 1
SEQ ID: NO. 51 μ 1
基因組模板ι μ
KOD Plus DNA 聚合酶(T0Y0B0 公司)1 μ
加無菌ddH20至50 μ 1
將PCR產物用ZAo l.Hind III進行雙酶切后，割膠回收以備后用。將(1)、⑵兩組雙酶切后的PCR產物，依次分別克隆到pFastBacI空載質粒(購自 Invitrogen公司)上，轉化大腸桿菌TGl感受態細胞(購自^witrogen公司)，挑取單菌落， 利用上述的PCR鑒定引物SEQ ID: NO. 1和SEQ ID: NO. 5進行PCR鑒定，并進行雙酶切和測序鑒定，篩選取陽性克隆的質粒即為桿狀病毒表面展示系統轉移載體pFaStBacI-gp64， 如圖1所示。實施例3 桿狀病毒表面展示系統轉移質粒pFaStBaCI-gp64-E2-2A-E0的構建將實施例1中回收的融合基因E2-2A-E0雙酶切產物克隆至轉移載體pFastBaCI-gp64
上，篩選陽性克隆即為桿狀病毒表面展示系統轉移質粒pFastBaCI-gp64-E2-2A-E0，如圖2 所示。實施例4 重組桿狀病毒angp64-E2-2A-E0的獲取與鑒定
將實施例3中所獲得的重組轉移質粒pFastBaCI-gp64-E2-2A-E0轉化大腸桿菌 DHlOBac感受態細胞(購自hvitrogen公司)，在含有購自Bio Basic Inc公司的卡那霉素、 慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG(異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)的LB固體培養板(常規方法制備)上進行藍白斑篩選，避光培養4 后挑取單菌落白斑，培養1 后菌液稀釋IO6 重新涂板做篩選，挑取白斑至LB培養基搖菌培養1 后，用異丙醇在超凈臺中抽提重組桿狀病毒基因組，用M13通用引物PCR鑒定是否轉座成功。
M13 上游引物5，-GTTTTCCCAGTCACGAC-3， Ml3 下游引物5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，
將鑒定成功的重組桿狀病毒基因組參照^witrogen公司脂質體轉染試劑 Cellfectin II Reagent說明書的方法，經脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞(為一代雜交種菁松X皓月，由上海生化所贈送)，待該家蠶BmN細胞發病(顯微鏡下觀察)后收集第一代重組病毒懸液并于4°C保存，用Viral DNA Kit (200)(購自OMEGA公司)提取病毒基因組，然后用M13通用引物進行PCR鑒定。將所得鑒定成功的重組桿狀病毒命名為 Bmgp64-E2-2A-E0，如圖 3 所示。實施例5 重組桿狀病毒&iigp64-E2-2A-E0在家蠶BmN細胞中的表達(擴增)和鑒
定
將實施例4中獲取的重組桿狀病毒angp64-E2-2A-E0以MOI=O. lpfu/cell的劑量感染家蠶BmN細胞對數生長期家蠶BmN細胞中，在含有10%胎牛血清的1 X Sf-900 II SFM培養基(購自hvitrogen公司)中27°C培養3 4 d，收集培養上清；4°C，500 X g離心10 min， 上清液貯于4°C或分裝凍存于_70°C。將擴增后的重組桿狀病毒以MOI=IO pfu/cell劑量感染家蠶BmN細胞(為一代雜交種菁松X皓月，由上海生化所贈送)，在27°C培養72 h，4°C， 2000g離心IOmin收集細胞沉淀；將該細胞沉淀用pH 7.4的PBS洗滌重懸，樣品分別與 2X SDS上樣緩沖液混合，60°C加熱30 min，進行SDS-PAGE蛋白電泳，Western blotting分析，結果表明，融合蛋白E2-2A-E0已在家蠶BmN細胞中成功表達。實施例6 重組桿狀病毒&iigp64-E2-2A-E0在家蠶五齡幼蟲及蠶蛹中的表達和鑒定
將實施例5擴增后的重組桿狀病毒angp64-E2-2A-E0以MOI=IO pfu/cell的劑量腹部倒數第二節處穿刺接種眠起后的家蠶五齡幼蟲和化蛹兩天的蠶蛹(為一代雜交種菁松X 皓月，浙江中奇生物藥業股份有限公司)，第五天大部分幼蟲和蠶蛹出現典型病毒感染癥狀，剪幼蟲腹足收集蠶血淋巴，加0.5% (w/v)抗氧化劑八羥基喹啉，12000rpm離心lOmin， 取上清；將蠶蛹_80°C儲存。取12000rpm離心后的蠶血淋巴上清和發病蠶蛹的勻漿液分別加入等體積的2X蛋白質上樣緩沖液(IOOMm Tris-HCl,4% SDS，0. 1%溴酚藍，10%甘油)， 60°C加熱30min，取20 μ 1進行SDS-PAGE蛋白電泳，并進行^festern blotting分析。結果表明，融合蛋白E2-2A-E0已在家蠶幼蟲和家蠶蛹中獲得了成功表達。實施例7 新型豬瘟疫苗的獲得
(1)從蠶蛹中分離純化重組病毒&iigp64-E2-2A-E0
a.取300g經angp64-E2-2A-E0感染的蠶蛹樣品，在4°C下解凍后，與4°C放置1h的 ddH20 300ml混合，置于勻漿機中，勻漿2min，冰上放置2min，重復9次；
b.將勻漿液加入一個IL離心杯中，配平，6000rpm離心60min，取上清，小心棄去油
脂；
c.將6000rpm離心上清液倒入另一個IL離心杯中，配平，6000rpm離心60min，取上
清，棄油脂；
d.重復c一次；
e.6000rpm離心的上清液倒入50ml離心管，配平，12000rpm離心30min，取上清，棄油
脂(重復此步驟三次)；f.取12000rpm離心后的上清300ml，用300kD中空纖維膜膜包超濾系統4°C(購自 Sartorius公司)進行超濾，按照上清液與PBS為1:1的體積比上樣超濾，如此重復10次， 最終截留液100ml，再用200ml PBS清洗膜包，并與截流液合并；
g.超濾后的樣品在超凈臺上分裝于滅菌的超離管中，平衡，40000rpm超高速離心 40min ；
h.40000rpm離心后，取所有上清，及沉淀重懸液(所有沉淀用50ml PBS重懸)分別進行區帶離心，上樣順序如下PBS 250ml，樣品300ml，30%蔗糖溶液400ml，55%蔗糖溶液充滿， 進樣結束后加上蓋帽，關閉倉門，開啟真空泵開始離心，離心結束后用56%蔗糖溶液下樣， 用核酸蛋白檢測儀監測，收集流出樣品，共150mL;
i.區帶離心后樣品用千分之二甲醛37°C靜置滅活Mh;
j.超濾脫糖滅活后樣品用300kD中空纖維膜膜包超濾至50mL，再用無菌水稀釋至 IOOmL,再超濾至50mL，如此重復10次，最終截留體積為50mL，再用300mL無菌水分3次，每次IOOmL，循環沖洗超濾系統，最終濃縮至50mL，合并兩次超濾截流液；
(2)凍干超濾脫糖后樣品，用間接ELISA法檢測生物活性，有活性的樣品進行分裝， 于-40°C冷凍干燥；
(3)保存及檢測
無菌分裝經_40°C冷凍干燥，制成新型豬瘟疫苗凍干粉。同時，再用ELISA鑒定凍干粉中融合蛋白E2-2A-E0的生物活性。12%SDS-PAGE電泳，檢測樣品，在95kD處有目的蛋白的表達。(4)取純化鑒定后的重組病毒粒子免疫4周齡的Balb/c小鼠制備多克隆抗體，做血清中和試驗，中和效價可達1:32，表明具有良好的免疫原性。血清中和試驗步驟如下
將制備的Balb/c小鼠多克隆抗體于56 °C水浴中處理30 min，然后用無血清 Sf-900TMSFM (IX)培養基(購自hvitrogen公司)分別倍比連續稀釋至2-8 ；
取50 μ L預先制備的重組桿狀病毒&iigp64-E2-2A-E0懸液與相同體積不同稀釋度的血清混合均勻，37°C孵育lh，以重組桿狀病毒angp64-E2-2A-E0免疫的Balb/c小鼠血清試驗組，以PBS免疫的Balb/c小鼠血清陰性對照組，進行血清中和實驗；
取生長狀態良好的家蠶BmN細胞，稀釋細胞密度至1 X 105個/mL，500 μ L/孔，加入M 孔板中；
將病毒-血清混合物以100 μ L/孔接種BmN細胞，不同稀釋度血清做三個重復，細胞培養箱中27°C培養；
觀察細胞病變情況，計算抗體中和效價。以上所述，僅為本發明的較佳實施例，并非對本發明作任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發明，任何本領域的普通技術人員，在不脫離本發明精神的范圍內，所作的任何修改、等效變化與修飾等，均仍屬于本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種家蠶重組桿狀病毒aiigp64-E2-2A-E0，該病毒保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5604。
2.—種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0的制備方法，其特征在于， 所述方法包括以下步驟(a)由PCR擴增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列SP和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列TM，通過I/ EcoR I和煬ol/歷III雙酶切插入 PFastBacI載體多克隆位點上下游兩端，構建表面展示系統轉移載體pFaStBaCI-gp64 ；(b)采用pvL1393-E2-2A-E0 重組質粒為模板，以 SEQ ID: NO. 6 和 SEQ ID: NO. 7 為引物進行PCR擴增，構建融合基因E2-2A-E0 ；(c)將步驟(b)所得的融合基因E2-2A-E0雙酶切產物克隆至步驟(a)所得表面展示系統轉移載體pFaStBacI-gp64上，并篩選陽性克隆，獲得轉移重組質粒 pFastBacI-gp64-E2-2A-E0 ；(d)將步驟(c)所得轉移重組質粒pFastBacI-gp64-E2-2A-E0轉化大腸桿菌DHlOBac 感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養板上進行藍白斑篩選，避光培養40-4 后挑取白斑，培養16-20h后菌液稀釋IO6重新涂板做篩選，挑取白斑至LB培養基搖菌培養16-20h后，用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定；(e)取步驟(d)所鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質體介導法轉染家蠶BmN細胞， 發病后獲得零代病毒懸液0-4°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物進行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0。
3.—種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0表達的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID: NO. 11所示。
4.一種權利要求3所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(a)將權利要求3所述的重組桿狀病毒Bmgp64-E2-2A-E0感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；(b)以穿刺接種法接種家蠶五齡幼蟲、蛹；(c)收集表達的權利3所述蛋白。
5.一種權利要求1所述家蠶重組桿狀病毒&iigp64-E2-2A-E0在豬瘟疫苗制備中的應用。
6.一種權利要求3所述蛋白在豬瘟疫苗制備中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種豬瘟疫苗及其制備方法，屬于生物醫藥技術領域。本發明通過構建一種重組桿狀病毒，并運用桿狀病毒表面展示技術將將豬瘟病毒的主要抗原基因E2、E0融合展示在家蠶桿狀病毒囊膜表面，以家蠶蛹作為生物反應器生產重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為豬瘟疫苗原進行生產。相比于傳統豬瘟疫苗生產具有安全性好、生產成本低、產量高、易于操作、適用于大規模生產的特點，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61K39/187GK102559614SQ201210005619
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者張學賽, 張耀洲, 舒特俊, 陳劍清 申請人:天津耀宇生物技術有限公司