一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法

專利名稱：一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種多孔材料及其制備方法，特別涉及一種以絲素蛋白為原料，制備 多孔三維材料的技術，所制備的材料可應用于生物醫學、生物技術、組織工程等技術領域。
背景技術：
生物醫用材料特別是組織工程支架材料、組織修復再生材料等，要求所使用的材 料不僅具有良好的生物相容性，同時必須具備合適的三維多孔結構、可控的生物降解性、一 定的力學強度、以及可以釋放因子或者其它相關藥物的性能。對于制備生物醫用材料的方法，尤其是制備生物材料多孔支架的方法，要求制備 過程應當盡可能溫和，并盡量避免毒性有機溶劑的使用，這樣保護其生物相容性和可能加 載藥物的活性；同時，也要求有溫和有效的方法來調控生物材料的結構，從而有效控制材料 的降解行為以適應不同組織的正常再生。中國是蠶絲的發源地和主要生產國。蠶絲主要由70%的絲素蛋白和25%的絲膠 蛋白組成，其中的絲素蛋白具有優異的生物相容性、機械性能和可降解性，是一種非常有前 途的組織工程支架材料。大量研究證明，絲素蛋白基組織工程支架能夠應用于骨、皮膚、血 管、神經、肝、軟骨、韌帶多種組織的再生。同時，絲素蛋白開始被應用于藥物緩釋領域，絲素 蛋白薄膜或凝膠作為藥物釋放的載體，表現出良好的控釋效果。因此，絲素蛋白有可能同時 作為支架材料和藥物載體，避免藥物載體同支架的不相容問題。作為一種普適的生物材料， 絲素蛋白在不同領域都表現出巨大的應用前景。絲素蛋白的結晶形態主要有絲素I(Silk I)和絲素II(Silk II)兩種。其中絲 素II結晶是一種伸展的反平行β-折疊結構，絲素I結晶則是介于蛋白質β-折疊結構和 α-螺旋結構中間的一種曲柄型結構。蠶絲纖維中絲素蛋白的結晶形態主要是絲素II結 晶，從5齡蠶的絹絲腺中得到的液態絲素蛋白不做拉伸或者化學處理，在0 40°C緩慢干燥 可以得到絲素I結晶。作為生物材料使用的絲素蛋白，必然涉及到這兩種主要的絲素蛋白 結晶結構以及非晶結構等。蠶絲纖維的降解速度比較緩慢，這是由于反平行折疊結構 比較規整緊密。非結晶結構的絲素蛋白可溶于水，作為材料使用時需要使用交聯劑來降低 其水溶性，而這樣作的結果有可能會降低其良好的生物相容性。而絲素I結晶作為一種結 晶結構，它是不溶于水的，不需要另外添加交聯劑；但因其結構比絲素II疏松，所以具有一 定的生物可降解性。其生物降解速度介于非結晶結構和絲素II結晶結構的絲素蛋白之間， 可以在幾個月內完全降解。因此，可以通過調控兩種結晶結構以及非晶結構的比例來獲得 所需要的材料性能現有技術中，采用絲素蛋白制備三維多孔支架的方法有鹽析法、冷凍干燥法、靜電 紡絲法以及相分離法等，其中，冷凍干燥法的現有技術主要有以下報道，例如(1)公開號為CN101502669A的中國發明專利“絲素蛋白多孔三維支架及其制備方 法”中，公開了一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法，先將家蠶絲經脫膠、溶解、透析、濃 縮后得到質量濃度為1 30%的絲素蛋白溶液，其特征在于再進行如下步驟的加工第一步將絲素蛋白溶液注入金屬模具中，在-10 -80°C的低溫條件下經1 24小時的快速冷 凍，得到冷凍體；第二步在溫度為_5 _25°C的條件下將上述冷凍體低溫保存2 60天， 得到冷凍結晶體；第三步對冷凍結晶體進行解凍處理，得到濕態絲素蛋白多孔三維材料， 再經干燥處理，得到干態絲素蛋白多孔三維材料。上述技術方案，采用冷凍干燥法制備三維支架，避免了有機溶劑使用，但因為沒有 對絲素蛋白溶液進行處理，溶液中絲素蛋白沒有形成規則的納米結構，導致冷凍干燥過程 中片狀結構的形成。觀察其電鏡圖片仍可知，所得支架中仍然存在分離片狀結構，且該技術 方案中蛋白的結晶結構無法調控。(2)公開號為CN1262579C的中國發明專利“絲素蛋白海綿狀三維多孔材料制備方 法”中，需要采用甲醇或者乙醇作為變性劑，促使絲素II結構形成，提高絲素蛋白在水中穩 定性，但是，因為主要以絲素II結構為主，所以降解緩慢，并且不可調控微結構中絲素I和 絲素II結構的比例。因此，需要研究發明一種在綠色溫和條件下制備絲蛋白三維支架的方法，并且可 以通過調節制備工藝調控多孔支架材料的孔徑尺寸，二級結構的制備方法。

發明內容
本發明目的是提供一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法，，克服現有技術中所 得絲素蛋白多孔三維材料存在分離片狀結構的缺陷，以及所得絲素蛋白多孔三維材料中絲 素I和絲素II結構的比例無法調節的缺陷。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是一種絲素蛋白多孔三維材料的制備 方法，包括以下步驟(1)按常規方法先將蠶絲經脫膠、溶解、透析得到純的絲素蛋白水溶液，將絲素蛋 白水溶液進行開口緩慢濃縮處理，通過調整溶液揮發面積，調整溶液濃縮速度，使絲素蛋白 水溶液在35 60°C下，濃縮2 7天，使絲蛋白的最終濃度為10% 50%，然后加入水調 整所述絲素蛋白水溶液的質量濃度至0.5% 10% ；(2)將醇和絲素蛋白水溶液混合均勻得到絲素蛋白溶液，所述醇為異丙醇、丙三 醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇或乙二醇中的一種或兩種以上的混合物；(3)將絲素蛋白溶液注入模具中，進行冷凍處理獲得冷凍體；將冷凍體進行冷凍 干燥處理，獲得干態的絲素蛋白多孔材料，所述絲素蛋白多孔材料不溶于水并且含有醇；(4)將絲素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡去除醇；(5)將去除醇的絲素蛋白多孔材料再進行冷凍干燥處理獲得干態的純絲素蛋白多 孔材料。上述技術方案中，步驟(1)中，上述技術方案中，步驟(1)中，進行透析處理主要是 為了過濾除去無機鹽等雜質分子從而獲得純的絲素蛋白水溶液；在開口緩慢濃縮過程中， 絲素蛋白可以自組裝形成納米球，并且由于開口時，溶劑水會減少，因此形成的納米球之間 會發生結合團聚成納米線，最終培育得到了穩定的絲素蛋白納米線水溶液，而冷凍干燥過 程中片狀結構的形成同絲素蛋白在溶液中的微觀結構有關，從而避免了分離片狀結構的形 成。上述技術方案中，步驟(2)中，按照質量比，絲素蛋白醇=0.05 20 1。隨著醇含量的提高，有利于結晶結構Silk I和Silk II的形成；同時醇種類的變化同樣可以 影響絲素蛋白晶體結構，丙三醇的加入更有利于Silk I的形成，而乙二醇的加入則會促進 Silk II含量的提高。上述技術方案中，步驟(3)中，冷凍處理的溫度為-10°C _80°C，冷凍處理時間為 1 48小時；低溫有利于冰晶的快速形成，從而降低凍干后的孔徑，同時低溫會在一定程度 上抑制絲素蛋白結晶的形成，進一步調控絲素蛋白的晶體組成。根據實際需要，優選地，冷 凍處理的溫度為_20°C _60°C。上述技術方案中，步驟(4)中，絲素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡時間為0.5 24 小時。上述技術方案中，所述冷凍干燥處理是在凍干機中進行的，冷凍干燥又稱升華干 燥，將含水物料冷凍到冰點以下，使水轉變為冰，然后在較高真空下將冰轉變為蒸氣而除去 的干燥方法；該方法的優點是在低溫高真空的條件下使樣品中的水分由冰直接升華達到干 燥的目的，在干燥的過程中不受表面張力的作用，樣品不變形。上述技術方案中，按常規方法制備絲素蛋白水溶液的具體方法為以天然家蠶絲 為原料，絲經脫膠，中性鹽溶液溶解后用去離子水透析獲得絲素蛋白水溶液；或者以再生絲 素為原料配制絲素蛋白水溶液；優選天然家蠶絲。進一步優選的技術方案中，在步驟(3)和步驟(4)之間，對步驟(3)所得絲素蛋 白多孔材料進行處理，所述處理方法選自以下處理方法中的一種或兩種以上的組合①采 用真空水蒸氣處理絲素蛋白多孔材料0. 5 24小時；②采用真空甲醇蒸氣或乙醇蒸氣處 理絲素蛋白多孔材料0. 5 24小時；③將絲素蛋白多孔材料浸泡在甲醇或者乙醇中10分 鐘 24小時；④將絲素蛋白多孔材料進行力學拉伸處理，拉伸后增加的長度為材料原長度 的20% 300%。其中真空水蒸氣處理能夠同時提高Silk I和Silk II的含量，而其它處 理方式主要提高Silk II的含量，不同處理方式相互結合，可以對絲素蛋白中晶體含量進行 進一步調控。本發明的原理是絲素蛋白在水溶液中存在緩慢的自組裝過程，而冷凍干燥過程 中片狀結構的形成同絲素蛋白在溶液中的微觀結構相關，本發明中絲素蛋白溶液的開口緩 慢濃縮過程，調控絲素蛋白的微觀結構，從而抑制片狀分離結構的形成，然后通過冷凍干燥 法可以獲得具有良好孔結構的三維多孔支架；同時絲素蛋白的聚集態結構可以通過在培育 過的絲素蛋白水溶液中加入多元醇來調控，可以促進并控制絲素蛋白Silk I和II晶體結 構的形成；經過對上述兩個過程中的參數進行調控，就可以直接通過冷凍干燥法制得具有 良好孔結構的不溶于水的絲素蛋白多孔支架材料。另外，通過不同的后處理過程，對絲素蛋 白的二級結構進行進一步調控，就可以獲得具有不同二級結構和降解性能的絲素蛋白三維 多孔材料。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點1、由于本發明通過開口緩慢濃縮過程對絲素蛋白進行調控，有效抑制了片狀結構 的形成，因此所獲得的多孔支架同其它方法制備的支架相比，具有更加均勻、結構更好的多 孔形態。2、由于本發明在制備過程中將無毒的醇添加到絲素蛋白溶液中，促使絲素蛋白 Silk I和II晶體結構形成，從而能夠通過冷凍干燥法直接制得不溶于水的絲素蛋白多孔支架，而不需添加其它化學試劑，且醇可通過在水溶液中浸泡直接去除，不會引起絲素蛋白 生物相容性的降低。3、本發明可以在制備過程中，通過調節冷凍溫度、絲素蛋白濃度等工藝參數，控制 孔的大小，滿足不同應用的需要。4、本發明可以通過采用可選的后處理過程，進一步調節絲素蛋白多孔支架的二級 結構，從而獲得不同的降解性能和力學性能，以滿足不同組織再生或者不同藥物釋放的要 求。


圖1為實施例一經過緩慢濃縮處理后的絲素蛋白溶液中絲素蛋白的納米結構原 子力顯微鏡照片；圖2為實施例一和二所得絲蛋白支架材料的紅外光譜圖；其中a代表實施例一所 得絲素蛋白支架材料；b代表實施例二所得絲素蛋白支架材料；圖3為實施例一所得絲蛋白支架材料的電鏡照片；圖4為實施例六和七所得絲蛋白支架材料的紅外光譜圖；其中a代表實施例六所 得絲素蛋白支架材料；b代表實施例七所得絲素蛋白支架材料；圖5為實施例六所得絲蛋白支架材料的電鏡照片。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例一將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調節絲蛋白水溶液濃度為2%。取上述絲蛋白溶液15mL，在60°C條件下，通過降低溶液揮發面積，調整濃縮速度， 使其濃縮48小時后，濃度為30%左右，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液，所述絲素蛋 白納米線的原子力顯微鏡圖見圖1 ；將溶液重新稀釋到2%，然后加入占干態多孔支架質量 20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放入-20°C下冷凍24小時。放入凍干機干燥48 小時后得到乳白色的不溶性絲素三維支架。用去離子水將甘油浸泡出來，再冷凍干燥即得 到純的絲蛋白三維支架。對上述絲蛋白三維支架此支架進行電鏡掃描和紅外測試，結果見圖2和圖3，從圖 3可見，上述絲蛋白三維支架中的孔直徑在100 300微米之間，從圖2中的a曲線可知，材 料在1648CHT1處有吸收峰，這是Silk I結構的特征峰，所以絲蛋白三維支架的結構主要為 Silk I結構。實施例二 將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調節絲蛋白水溶液濃度為2%。取上述絲蛋白溶液15mL，在60°C條件下，通過降低溶液揮發面積，調整濃縮速 度，使其濃縮48小時后，濃度為30%左右，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液；將溶液 重新稀釋到2 %，加入占干態多孔支架質量60 %的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時。然后放入凍干機干燥48小時，得到乳白色的不溶性絲素三維支架， 然后在去離子水中浸泡12小時，將甘油浸泡出來，進一步冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維 支架。對上述絲蛋白三維支架此支架進行紅外測試，結果見圖2，從圖2中的b曲線可知， 材料在1646CHT1和1629CHT1處有吸收峰，它們分別是SilkI和SilkII結構的特征吸收峰， 因此絲蛋白三維支架的結構主要為Silk I和Silk II結構。上述絲蛋白三維支架中的孔直徑在100 300微米之間。實施例三將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調節絲蛋白水溶液濃度為2%。取上述絲蛋白溶液15mL，在60°C條件下，通過降低溶液揮發面積，調整濃縮速度， 使其濃縮48小時后，濃度為30%左右，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液；將溶液重 新稀釋到2 %，加入占干態多孔支架質量40 %的乙二醇，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時。然后放入凍干機干燥48小時，得到乳白色的不溶性絲素三維支架， 然后在去離子水中浸泡20小時，將乙二醇浸泡出來，再次冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維 支架。此支架中的孔直徑在100 300微米之間，主要為Silk I。實施例四將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。取上述絲蛋白溶液20mL，在35°C條件下，通過降低溶液揮發面積，調整濃縮速 度，使其濃縮96小時后，濃度為30%左右，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液；將溶液 重新稀釋到6 %，加入占干態多孔支架質量40 %的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具，放 入-60°C下冷凍48小時。然后再放入凍干機干燥48小時，得到乳白色的絲素三維支架，將 支架在去離子水中浸泡16小時，將甘油浸泡出來，再次冷凍干燥即得到絲蛋白三維支架。 此支架中孔的直徑在100微米以下，主要為Silk I和Silk II結構。實施例五將50g左右生絲浸入2L 0.5% NaCO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。取上述絲蛋白溶液15mL，在常溫25°C下進行緩慢濃縮，濃縮7天，濃縮后得到 絲素蛋白納米線的水溶液；然后加去離子水配成2%的絲素溶液，加入占干態多孔支架質 量60 %的丙三醇和占干態多孔支架質量20 %的乙二醇，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放 入-20°C下冷凍48小時。然后再放入凍干機干燥48小時，得到乳白色的絲素三維支架，然 后用去離子水將甘油浸泡出來，進一步冷凍干燥即得到絲蛋白三維支架。此絲素蛋白支架 主要為Silk II結構，孔徑在100 300微米之間。實施例六將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。取上述絲蛋白溶液40mL，在60°C進行緩慢濃縮，通過控制揮發表面積，使溶液在 濃縮48小時后，濃度達到30%，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液。將溶液稀釋到2% 后，加入占干態多孔支架質量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放入-20°C下冷 凍48小時。然后放入凍干機干燥48小時，得到乳白色的不溶性絲素三維支架。將此支架 利用真空水蒸氣處理的方法處理6小時后，浸泡在去離子水中20小時，去除甘油，再次冷凍 干燥即得到純的絲蛋白三維支架。對上述絲蛋白三維支架進行電鏡掃描和紅外測試，結果見圖4和圖5，從圖5可見， 上述絲蛋白三維支架中的孔直徑在100 300微米之間，從圖4中的a曲線可知，材料在 1648CHT1和1629CHT1處有吸收峰，分別是SilkI和SilkII結構的特征吸收峰，因此絲蛋白 三維支架的結構主要為SilkI和SilkII結構。實施例七將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調節絲蛋白水溶液濃度為1.5%。取上述絲蛋白溶液40mL，在60°C進行緩慢濃縮，通過控制揮發表面積，使溶液在 濃縮48小時后，濃度達到30%，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液；加去離子水稀釋成 2 %的絲素溶液。然后加入占干態多孔支架質量60 %的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再 放入-20°C下冷凍48小時。然后放入凍干機干燥48小時，得到乳白色的不溶性絲素三維支 架。用真空乙醇蒸氣處理6小時后，將支架浸泡在去離子水中20小時，去除甘油和甲醇，進 一步冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。對上述絲蛋白三維支架此支架進行紅外測試，結果見圖4，從圖4中的b曲線可知，材料在1629CHT1處有吸收峰，它分別是SilkII結構的特征吸收峰，因此絲蛋白三維支架的 結構主要為Silk II結構。上述絲蛋白三維支架中的孔直徑在100 300微米之間。實施例八將50g左右生絲浸入2L 0.5% Na2cO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調節絲蛋白水溶液濃度為1.5%。取上述絲蛋白溶液40mL，在30°C調整濃縮速度，緩慢濃縮200小時后溶液濃度為 40 %左右，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液。將溶液濃度稀釋至2 %，然后加入占干態 多孔支架質量40%的乙二醇，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放入-60°C下冷凍48小時。然 后放入凍干機干燥48小時，得到乳白色的絲素三維支架，將此支架在甲醇溶液中直接浸泡 0.5小時，促進Silk II的形成。隨后將此在去離子水中浸泡12小時，去除乙二醇和甲醇， 再次冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此支架中的孔直徑在100 300微米之間，主 要為 Silkll。實施例九將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液。取上述絲蛋白溶液40mL，調整濃縮速度，在60°C緩慢濃縮48小時后濃度提高到 40%，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液；將溶液稀釋到2%，然后加入占干態多孔支架 質量20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具，放入-60°C下冷凍48小時。然后再放入凍 干機干燥48小時，得到乳白色的不溶性絲素三維支架。將此支架固定在雙向拉伸裝置上， 雙向拉伸100%。隨后在去離子水中浸泡10小時，去除甘油，進一步冷凍干燥即得到絲蛋白 三維支架。此支架中絲素蛋白主要為Silk II結構。實施例十將50g左右生絲浸入2L 0.5 ^Na2CO3溶液中，攪拌煮沸30分鐘后取出，用去離子 水洗滌干凈。重復以上操作兩次后將蠶絲60°C下烘干。稱取上述處理后的脫膠蠶絲15g溶解于IOOml濃度為9. 5mol/L的BrLi溶液中， 60°C下攪拌溶解一個小時。然后用截留分子量為3500的透析袋，用去離子水透析四天，得 到濃度為4%的絲蛋白水溶液，調整絲素蛋白濃度到2%。取上述絲蛋白溶液20mL，在60°C緩慢濃縮96小時，使絲素蛋白溶液濃度達到 20%，濃縮后得到絲素蛋白納米線的水溶液；然后稀釋至8%。加入占干態多孔支架質量 20%的甘油，攪拌均勻后倒入聚乙烯模具再放入-20°C下冷凍48小時。然后放入凍干機干 燥48小時，得到乳白色的不溶性絲素三維支架。將此支架利用真空水蒸氣處理方法處理6 小時后，用去離子水浸泡24小時，去除甘油，再冷凍干燥即得到純的絲蛋白三維支架。此絲素蛋白支架孔徑在100微米以下，主要由SilkI晶體組成。 上述實施例所得絲素蛋白三維支架材料可應用于骨、軟骨、韌帶、神經、皮膚等組 織修復以及藥物緩釋的載體等。
權利要求
一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)按常規方法先將蠶絲經脫膠、溶解、透析得到純的絲素蛋白水溶液，將絲素蛋白水溶液進行開口緩慢濃縮處理，通過調整溶液揮發面積，調整溶液濃縮速度，使絲素蛋白水溶液在35～60℃下，濃縮2～7天，使絲蛋白的最終濃度為10％～50％，然后加入水調整所述絲素蛋白水溶液的質量濃度至0.5％～10％；(2)將醇和絲素蛋白水溶液混合均勻得到絲素蛋白溶液，所述醇為異丙醇、丙三醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇或乙二醇中的一種或兩種以上的混合物；(3)將絲素蛋白溶液注入模具中，進行冷凍處理獲得冷凍體；將冷凍體進行冷凍干燥處理，獲得干態的絲素蛋白多孔材料，所述絲素蛋白多孔材料不溶于水并且含有醇；(4)將絲素蛋白多孔材料在水溶液中浸泡去除醇；(5)將去除醇的絲素蛋白多孔材料再進行冷凍干燥處理獲得干態的純絲素蛋白多孔材料。
2.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(1)中，開口緩慢濃縮的溫度為 20°C 80°C，濃縮時間為1 240小時。
3.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(2)中，按照質量比，絲素蛋白醇 =0.05 20 1。
4.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(3)中，冷凍處理的溫度 為-10°C _80°C，冷凍處理時間為1 48小時。
5.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟(4)中，絲素蛋白多孔材料在水溶 液中浸泡時間為0. 5 24小時。
6.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，在步驟(3)和步驟⑷之間，對步驟(3) 所得絲素蛋白多孔材料進行處理，所述處理方法選自以下處理方法中的一種或兩種以上的 組合①采用真空水蒸氣處理絲素蛋白多孔材料0. 5 24小時；②采用真空甲醇蒸氣或乙 醇蒸氣處理絲素蛋白多孔材料0. 5 24小時；③將絲素蛋白多孔材料浸泡在甲醇或者乙醇 中10分鐘 24小時；④將絲素蛋白多孔材料進行力學拉伸處理，拉伸后增加的長度為材料 原長度的20% 300%。
全文摘要
本發明涉及一種多孔材料及其制備方法，公開了一種絲素蛋白多孔三維材料的制備方法，將絲素蛋白水溶液開口緩慢濃縮之后，與醇混合均勻后進行冷凍干燥，直接獲得不溶于水的絲素蛋白多孔支架材料，再選擇性地使用后處理手段調控多孔支架的二級結構和力學性能，并可通過改變絲蛋白濃度、冷凍溫度等參數控制多孔材料的孔隙率和孔徑尺寸等。最后將絲素蛋白多孔支架材料浸泡在水中除去醇，本發明所述制備過程條件溫和，無需加入任何交聯劑、制孔劑、和其它毒性有機溶劑，簡便可控，易于產業化，并能有效保持絲素蛋白的生物相容性，可應用于骨、軟骨、韌帶、神經、皮膚等組織修復以及藥物緩釋的載體等。
文檔編號A61L27/22GK101905035SQ20101023342
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月22日 優先權日2010年7月22日
發明者盧神州, 呂強, 張冰, 李明忠, 王建南 申請人:蘇州大學