一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法和用圖
【專利摘要】本發明屬于抗菌劑及食品添加劑或者化妝品領域，具體涉及一種酪蛋白?百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法及用途。本發明通過將百里香精油包裹在酪蛋白脂質體中，以實現減少百里香精油在施用過程中的揮發，從而減少百里香精油的浪費，提高其利用率，達到長效抗菌與高效利用的目的。
【專利說明】
一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發明屬于抗菌劑及食品添加劑或者化妝品領域，具體涉及一種酪蛋白-百里香 精油脂質體抗菌劑的制備方法及用途。
【背景技術】
[0002] 百里香，屬于常綠灌木草本植物，是唇形科植物，花期7-8月，小堅果近圓形或卵圓 形。主要有以百里酚為主的百里香酚百里香、含最多沉香醇的沉香醇百里香、以側柏醇為主 的側柏醇百里香這三種。百里香精油具有治感冒、祛風、健脾消食、止咳化痰、溫中散寒等作 用。在海鮮、肉類、魚類等食品中應用廣泛，是天然的調味香料，可去除腥味，增加菜肴的風 味;百里香中含有大量的單萜等揮發性成分，對人體具有極高的食用營養價值。
[0003]國內已有很多關于百里香在食品、化妝品、醫藥技術等領域的專利申請。 CN103333509A公開了一種含有百里香精油的可食性魚皮膠原蛋白抗菌膜及其制備方法。制 備的膠原蛋白抗菌膜具有良好的抗菌性能，能被生物降解，不會對環境造成污染，能抑制食 品表面微生物的生長，從而達到食品保鮮及延長貨架期的效果。CN104739952A公開了一種 具有促進傷口愈合作用的復方茶樹精油，能促進皮膚新陳代謝，促進傷口愈合，且可防留 疤。CN1618294公開了一種從天然芳香植物百里香中提取的精油作為活性成分的驅螨組合 物，24h驅避率均達到100%<XN102178251A公開了一種百里香羊肉除膻調味劑，除膻效果良 好，色澤優美，百里香香氣適宜，口感和諧自然，具有很高的應用價值和廣闊的市場前景。 CN104379156A公開了一種鋪地百里香提取物，用于治療腸炎性疾病。CN104478607A公開了 一種百里香酚殺菌劑及其該殺菌劑幾種劑型的制備方法。該殺菌劑低毒、環保、安全、無害， 是一種非常具有市場應用前景的殺菌劑。CN104381334A公開了一種微囊懸乳劑，特別是含 有阿維菌素、百里香酚、茚楝油、生半夏活性成分的微囊懸乳劑的配方及其制備方法。阿維 菌素和百里香酚具有協同增效作用，復配作用明顯，大大降低農藥的用藥量，還可擴大殺蟲 譜，提尚殺蟲效率。
[0004] 雖然百里香精油在醫學，食品和化妝品行業被廣泛應用，具有較好的殺菌、增香等 特點，但是百里香精油易揮發，暴露在空氣中不穩定，所以要尋找有效的方法降低百里香精 油在使用過程中的揮發程度，延長其貯存期。
[0005] 納米脂質體能將精油包裹在內，并且納米脂質體不會對百里香精油的主要活性成 分造成破壞。納米脂質體使百里香精油中的活性成分與外界環境隔絕開來，可以降低百里 香精油的揮發性，延長保存期。但由于脂質體的緩釋作用，包裹精油的脂質體保質期有限。 因此，選用酪蛋白制成穩定性更高的酪蛋白脂質體。此外，納米脂質體由于它們的亞細胞尺 寸，能加強脂質體的被動吸收機制，減少物質運輸阻力，從而增強精油的抗菌效果。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是公開一種酪蛋白-百里香精油脂質體的制備方法及其用途，通過 將百里香精油包裹在酪蛋白脂質體中，以實現減少百里香精油在施用過程中的揮發，從而 減少百里香精油的浪費，提高其利用率，達到長效抗菌與高效利用的目的。本發明由百里香 精油，大豆卵磷脂，膽固醇和表面活性劑，酪蛋白制成酪蛋白-百里香精油脂質體。
[0007] 本發明的制備方法是將百里香精油，大豆卵磷脂，膽固醇混合于有機溶劑，減壓蒸 發形成光滑的薄膜，加入水相介質溶解膜狀物并超聲成乳液，通過離心和微孔濾膜過濾，得 到粒徑為納米級的百里香精油脂質體，其特征在于:將納米級的百里香精油脂質體與酪蛋 白和表面活性劑的溶液混合，攪拌均勻，通過低溫冷凍緩慢融化的方法使酪蛋白鑲嵌在脂 質體上，通過溫和超聲使脂質體閉合，最終形成包裹百里香精油的酪蛋白脂質體。
[0008] 本發明的大豆卵磷脂和膽固醇的質量比為5:1;用于制備精油脂質體的乳液含有 百里香精油的濃度為5.0mg/mL;表面活性劑為十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，得到包裹百 里香精油的酷蛋白脂質體后其最終濃度為1. 〇mg/mL。
[0009] 本發明中所述的有機溶劑為氯仿。
[0010] 本發明中所用的水相介質是根據中國藥典2000版標準配制的磷酸鹽緩沖溶液，pH 值6.5~7.4,優選7.2。
[0011] 所述的酪蛋白和表面活性劑的溶液是將酪蛋白分散在Brij-35的磷酸鹽緩沖液中 得到的，Br i j-35濃度為1 Omg/mL，分散后溶液中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。
[0012] 本發明中脂質體上鑲嵌的蛋白為酪蛋白，百里香精油脂質體與酪蛋白和表面活性 劑的溶液以體積比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白濃度為〇. lmg/mL，Brij-35濃度為1 .Omg/ mL〇
[0013] 本發明中低溫冷凍緩慢融化是指將混合液在-18°c下冷凍2h，隨后在0°C下緩慢融 化2h。
[0014] 本發明中溫和超聲是指在低功率50W條件下超聲2h，溫度范圍0-10°C。
【附圖說明】
[0015] 圖1酪蛋白-百里香精油脂質體的包封率。
[0016] 圖2酪蛋白-百里香精油脂質體的粒徑與多分散系數(PDI)。
[0017] 圖3酪蛋白-百里香精油脂質體對大腸桿菌的抗菌效果。
[0018] 圖4酪蛋白-百里香精油脂質體對金黃色葡萄球菌的抗菌效果。
[0019] 表1酪蛋白-百里香精油脂質體的Zeta電位。
【具體實施方式】
[0020] 通過下面實例說明本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護內容，不僅局限于此
[0021] 實施例1酪蛋白-百里香精油脂質體的包封率
[0022] 1實驗材料 大豆卵磷脂 BR 國藥集團化學試劑有限公司 膽固醇 AR 國藥集團化學試劑有限公司 三氯甲烷 AR 國藥集團化學試劑有限公司
[0023] - 百里香精油AR 法國Florihana精油 Brij-35 GR 國藥集團化學試劑有限公司 酪蛋白 CP國藥集團化學試劑有限公司
[0024] 2實驗方法
[0025] 1)百里香精油脂質體的制備
[0026]①稱取lg大豆卵磷脂，0.2g膽固醇和250mg的百里香精油，加入50mL氯仿使其溶 解。
[0027] ②在旋轉蒸發儀中蒸發至溶劑蒸干，蒸發溫度為10~30°C，圓底燒瓶內壁會形成 光滑的薄膜;然后將所得產品放入真空干燥箱中，30°C，真空狀態下干燥24h。
[0028] ③加入50mL的磷酸鹽緩沖液到圓底燒瓶中進行水化，水化超聲波功率為100W，超 聲時間為5h。
[0029] ④將所得混合液于細胞超微粉碎儀中以功率360W，工作10s，間隙5s，粉碎30min。
[0030] ⑤將所得產品進行離心，4000rpm，15min，取上層液體。
[0031 ]⑥將所得液體用0.22μπι濾膜進行過濾，得濾液。
[0032] 2)酪蛋白-百里香精油脂質體的制備
[0033]①按照上述百里香精油脂質體的制備方法，制備百里香精油濃度為5.Omg/mL的百 里香精油脂質體。
[0034]②將酪蛋白超聲分散在含10mg/mL Brij-35的磷酸鹽緩沖液中，形成酪蛋白一 Br i j-35溶液，其中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。
[0035]③在50mL百里香精油脂質體中添加5mL酪蛋白一 Brij-35溶液，混合均勻。④將所 得混合液于超聲條件下擴散lOmin。
[0036] ⑤將所得混合液在-18 °C下冷凍2h。
[0037]⑥將所得混合液在0 °C下緩慢融化2h。
[0038] ⑦通過溫和超聲（功率50W，2h，KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司）使脂質體閉 合，所得溶液即為酪蛋白-百里香精油脂質體。
[0039] 3)包封率的測定
[0040]用無水乙醇稀釋百里香精油，逐級稀釋成濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL 的標準溶液。然后，分別吸取lyL標準溶液進行GC-MS分析，對其主要成分的譜峰面積進行自 動積分，繪制主成分峰面積-百里香精油濃度標準曲線。取lmL酪蛋白-百里香精油脂質體樣 品，13500rpm，離心3h，倒掉上清液。接著加入lmL乙醇破乳齊丨」，超聲3h。最后以lOOOOrpm的轉 速離心15min，取上清液，用于GC-MS分析。制備好的脂質體樣品，對精油主成分的峰面進行 自動積分，再根據繪制的標準曲線，計算出脂質體中百里香精油的含量。則：
[0041]
[0042] 3酪蛋白-百里香精油脂質體的包封率
[0043] 包封率是評價脂質體制劑質量好壞的最重要的指標，也是脂質體能否發揮較普通 制劑高效、低毒等特點的關鍵。由圖1可看出，百里香精油脂質體的包封率為38.42%，酪蛋 白-百里香精油脂質體的包封率為75.89%。因此制備酪蛋白-百里香精油脂質體可以明顯 提尚脂質體的包封率。
[0044] 實施例2酪蛋白-百里香精油脂質體的粒徑與多分散系數(PDI)
[0045] 1實驗材料
[0046] ①空白脂質體 [0047]②百里香精油脂質體 [0048]③酪蛋白-百里香精油脂質體
[0049] 2實驗方法
[0050] 用美國布魯克海文儀器公司產的，型號為BI-9000的高濃度激光粒度儀測定酪蛋 白-百里香精油脂質體的粒徑和多分散系數(PDI)值，所測樣品放入樣品池直接測量即可。
[0051] 3酪蛋白-百里香精油脂質體的粒徑與多分散系數(PDI)
[0052]多分散系數(PDI)直接反映酪蛋白-百里香精油脂質體的穩定性，因此是主要參考 指標，脂質體的PDI在0~0.3范圍內屬于最好，在0.3~0.7范圍內較差，但可以接受，當Η)Ι> 0.8時，不予考慮。如圖2所不，空白脂質體的粒徑為86.4nm、PDI為0.353,百里香精油脂質體 的粒徑為146 · 6nm、PDI為0 · 254，酪蛋白-百里香精油脂質體的粒徑為628 · 0nm、PDI為0 · 028〇 酪蛋白-百里香精油脂質體的多分散系數(PDI)最小，因此制備酪蛋白-百里香精油脂質體 可以明顯提尚脂質體的穩定性。
[0053] 實施例3酪蛋白-百里香精油脂質體的Zeta電位
[0054] 1實驗材料
[0055] ①空白脂質體
[0056] ②百里香精油脂質體
[0057]③酪蛋白-百里香精油脂質體 [0058] 2實驗方法
[0059] 用英國馬爾文儀器有限公司生產的型號為ZetasirernanoZSZeta的電位儀測量， 直接將待測脂質體樣品放入電位儀中測量即可。
[0060] 3酪蛋白-百里香精油脂質體的Zeta電位
[0061] 表1酪蛋白-百里香精油脂質體的Zeta電位
[0062]
[0063]
[0064] Zeta電位也可以直接反映酪蛋白-百里香精油脂質體的穩定性，因此也是主要參 考指標，脂質體的Ze ta電位的絕對值越大說明脂質體越穩定性，Ze ta電位的絕對值在0~30 范圍內屬于不穩定，在大于30時脂質體較穩定性。如表1所示，三種脂質體均帶負電，空白脂 質體的Zeta電位為-22.8mV，其絕對值小于30，脂質體不穩定；百里香精油脂質體的Zeta電 位為-36. lmV，其絕對值大于30，脂質體較穩定;酪蛋白-百里香精油脂質體的Zeta電位為-41.5mV，其絕對值最大，脂質體最穩定。
[0065] 實施例4酪蛋白-百里香精油脂質體的抗菌性能
[0066] 1實驗材料
[0067]①百里香精油脂質體(保存7天、30天、60天、90天）
[0068]②酪蛋白-百里香精油脂質體(保存7天、30天、60天、90天）
[0069] 2實驗方法
[0070] 采用平板菌落計數法，以大腸桿菌（Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)為模式菌種測定酪蛋白-百里香精油脂質體的殘存菌數。將大腸 桿菌和金黃色葡萄球菌接種到液體培養基中，分別置于空氣搖床中在37°C、150rpm的條件 下震蕩培養24~48h，獲得對數生長期的菌懸液。取適量處于對數期的大腸桿菌和金黃色葡 萄球菌分別加入含有一定量無菌磷酸鹽緩沖液的試管中（細菌濃度約為1〇 5~106CFU/mL)， 然后再向試管中加入濃度為20% (v/v)的百里香精油脂質體及酪蛋白-百里香精油脂質體。 同時另取兩個分別含有以上兩種菌的試管并向其中加入等量無菌水(不加脂質體)作為對 照。將各試管均置于空氣搖床中在37°C、150rpm的條件下震蕩反應24h。分別于不同時間點 的取適量培養液進行十倍梯度稀釋到合適的濃度，然后移取l〇〇yL稀釋液滴到無菌固體平 板培養基上，涂布均勻之后放入37°C恒溫恒濕培養箱中倒置培養。24~48h后進行平板菌落 計數，從而對百里香精油脂質體和酪蛋白-百里香精油脂質體的抗菌活性進行評價。實驗重 復三次，結果取平均值。
[0071] 3酪蛋白-百里香精油脂質體的抗菌性能
[0072] 不同保存期的酪蛋白-百里香精油脂質體的抗菌活性的變化也可以間接反映脂質 體的穩定性。因此對保存7天、30天、60天、90天的百里香精油脂質體及酪蛋白-百里香精油 脂質體進行了抗菌性能評價，結果如圖3、圖4所示。保存時間為7天時，百里香精油脂質體與 酪蛋白-百里香精油脂質體的抗菌活性相近，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均顯示了良好 的抗菌效果。保存時間為30天時，百里香精油脂質體的抗菌效果明顯降低，而酪蛋白-百里 香精油脂質體仍然顯示出良好的抗菌效果。保存時間為60天和90天時，百里香精油脂質體 幾乎沒有顯示抗菌效果，而酪蛋白-百里香精油脂質體仍然保持良好的抗菌效果。
【主權項】
1. 一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法，將百里香精油，大豆卵磷脂，膽 固醇混合于有機溶劑，減壓蒸發形成光滑的薄膜，加入水相介質溶解膜狀物并超聲成乳液， 通過離心和微孔濾膜過濾，得到粒徑為納米級的百里香精油脂質體，其特征在于:將納米級 的百里香精油脂質體與酪蛋白和表面活性劑的溶液混合，攪拌均勻，通過低溫冷凍緩慢融 化的方法使酪蛋白鑲嵌在脂質體上，通過溫和超聲使脂質體閉合，最終形成包裹百里香精 油的酷蛋白脂質體。2. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:大豆卵磷脂和膽固醇的質量比為5:1;用于制備精油脂質體的乳液含有百里香精油的濃 度為5.0mg/mL;表面活性劑為十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，得到包裹百里香精油的酪蛋 白脂質體后其最終濃度為1 .Omg/mL。3. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:所述的有機溶劑為氯仿。4. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:所用的水相介質是根據中國藥典2000版標準配制的磷酸鹽緩沖溶液，pH值6.5~7.4,優 選 7.2。5. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:所述的酪蛋白和表面活性劑的溶液是將酪蛋白分散在Brij-35的磷酸鹽緩沖液中得到 的，Br i j-35濃度為1 Omg/mL，分散后溶液中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。6. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:脂質體上鑲嵌的蛋白為酪蛋白，百里香精油脂質體與酪蛋白和表面活性劑的溶液以體 積比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白濃度為0. lmg/mL，Bri j-35濃度為1 .Omg/mL。7. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:低溫冷凍緩慢融化是指將混合液在-18 °C下冷凍2h，隨后在0°C下緩慢融化2h。8. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-百里香精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在 于:溫和超聲是指在低功率50W條件下超聲2h，溫度范圍0-10°C。
【文檔編號】A61Q19/00GK105997561SQ201610521996
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月4日
【發明人】林琳, 馬翠霞, 崔海英
【申請人】江蘇大學