專利名稱：一種白術多糖及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種白術多糖的制備方法與其在調節腸道菌群平衡中的應用。
背景技術：
人體消化道內經常有一層微生物或微生物層存在，它們對宿主不但無害，而且 是有益和必需的，這一微生物層即稱為正常微生物群(normal microbiota)或正常菌群 (normal bacteria flora)。這些微生物群(數百億，占人體重量的1/50-1/60)在人體腸道 內進行活躍的生長代謝活動，有著極為重要的生理作用。與人體消化、吸收、免疫、抗腫瘤、 抗衰老、抵抗外來菌群侵襲等方面密切相關。眾多研究結果表明，年齡、人種、膳食結構、生 活習慣、環境、疾病、抗生素治療等會影響人腸道微生態系統及其群落結構。雙歧桿菌和乳 桿菌是兩種最重要的腸道益生菌，其數量和組成對維持健康腸道環境和提高免疫系統功能 起著關鍵作用。雙歧桿菌能維持宿主腸道的微生態平衡，提高人體對乳糖的耐受性；具有抑制腸 道病原菌生長，改善蛋白質代謝并能合成多種維生素，促進機體免疫機能等。雙歧桿菌在時 空、種類和數量上產生相應的動態變化，隨著年齡增長而減少，從而直接影響人體的健康。 近年來，國內外出現了研究開發雙歧桿菌產品的熱潮，目前主要的產品有酸乳制品、膠囊 等，但該類活菌制劑保存有效性較差及活菌攝入機體后受到胃酸影響的條件限制，使向機 體補充雙歧桿菌的效果降低。因而，向體內補充雙歧生長因子，采用促進雙歧桿菌增殖的物 質來補充體內有益菌群將是一條更易被接受的途徑。在雙歧生長因子中，低聚糖類研究最 多，如果糖低聚糖、大豆低聚糖、異麥芽寡糖等都具有促進雙歧桿菌的增殖作用。經查證，目前消費市場上的益生元產品主要有英吉利益生元鐵鋅鈣葡萄糖、多美 滋嬰幼兒奶粉、貝因美牛初乳益生元奶粉、多維益生元豆漿粉、亨氏清兒潤、雀巢力多精等 等，這些產品在治療腸道菌群失調引起的腹瀉、慢性腹瀉、抗生素治療無效的腹瀉及便秘的 等方面發揮了很大的作用，同時也是某些臨床疾病的良好的輔助藥物。它們大多為添加低 聚果糖、低聚葡萄糖、低聚木糖、褐藻膠低聚糖、菊糖等各類功能性低聚糖的產品，以乳制品 居多。通過對國內外專利文獻、期刊雜志及其它公開發表的文獻(如互聯網)進行檢索， 多糖研究主要集中在免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老等，并未有多糖類化合物作為益生 元開發利用。白 $ (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)力胃禾斗(Compositae)才直·白 * Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根莖。白術為多年生草本，栽培歷史悠久，主產 中國浙江省東陽、磐安一帶，是著名的道地中藥材“浙八味”之一，分布于浙江、江西、湖南、 湖北、陜西，亦多栽培。白術多糖，也僅限于在免疫調節及抗腫瘤、降血脂上有良好作用，沒 有對益生菌和腸道菌群作用的相關報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種白術多糖的制備方法與其在調節腸道菌群平衡中的應用。本發明提供的白術多糖的制備方法，包括下述步驟1)將白術用水浸泡，然后煎煮，收集濾液，濃縮得到白術浸提液；2)在步驟1)獲得的白術浸提液中加入乙醇或乙醇溶液，調節乙醇最終體積百分 濃度為70% -75% (如71. 25% )，置于4°C靜置24小時，離心收集沉淀，將沉淀用水溶解， 然后在水中透析去除去乙醇、小分子糖、蛋白質和鹽；濃縮透析液，真空冷凍干燥，得到白術 粗多糖；3)將步驟2)獲得的白術粗多糖用水溶解，添加2倍體積的Saveg液，混合搖勻， 離心收集上清液，重復此步驟，直到上清液經紫外測定在260、280nm波長處無蛋白質和核 酸的吸收峰，此上清液為脫蛋白后的糖液；然后在水中透析除去氯仿和正丁醇，濃縮透析 液，真空冷凍干燥，得到不含蛋白質的白術多糖；所述Saveg液為氯仿和正丁醇按體積比為 41混合后的混合液；所述方法中還包括將步驟3)獲得的不含蛋白質的白術多糖用水溶解，進行 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱層析純化，用50mM Tris-HCl收集含多糖的洗脫液； 將洗脫液置于水中透析去除Tris-HCl組分濃縮后冷凍干燥，得到白術多糖。為了加快溶解的速度，所述溶解用水的溫度為40_80°C，如60°C。所述步驟2)和步驟3)中，所述透析的截留分子量為5000Da以下，優選為3500Da。所述步驟2)和步驟3)中，所述透析的時間為24-72小時，優選為48小時。所述步驟1)中，所述浸泡的時間為12-36小時，優選為24小時；所述浸泡用蒸餾 水為10ml/g白術；所述煎煮為將浸泡后的白術用其浸泡液直接煎煮30分鐘，過濾收集濾 液，將濾渣在用于浸泡液相同體積的水煎煮30分鐘，收集濾液，合并兩次收集獲得的濾液。所述方法中，所用的水均為蒸餾水或去離子水。比如，上述步驟1)中的浸泡白術 用水、步驟2)中溶解沉淀用水、步驟3)中的溶解白術粗多糖用水均可以為蒸餾水，上述方 法中的透析用水，DEAE-Si^pharose Fast Flow陰離子柱層析純化前溶解白術多糖用水可以 為去離子水。上述方法制備的白術多糖即本發明所要保護的白術多糖。本發明還提供白術多糖在促進腸道有益菌的增殖或者調節腸道菌群的平衡中的 應用。所述腸道有益菌為嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌或植物乳桿菌。 所述腸道有益菌優選為嬰兒雙歧桿菌CICC6069、青春雙歧桿菌CICC6070、兩歧雙歧桿菌 1. 1852、動物雙歧桿菌1. 2268或植物乳桿菌1. 124。白術多糖可在體外促進腸道有益菌的 增殖，并在一定程度上可以調節腸道菌群的平衡。本發明的白術多糖的提取方法，經醇沉淀、Saveg法除蛋白、透析、陰離子柱層析， 提取的白術多糖純度極高，純度達色譜純，分子量為5527Da，主要由阿拉伯糖，半乳糖，葡萄 糖和甘露糖組成。我們采用的方法提取的白術多糖的鑒定方法和儀器均屬于最新的科研成果，檢測 靈敏準確，可信度高。多糖分子量測定主要采用高效液相色譜及凝膠滲透色譜，本方法利用 激光檢測器，靈敏度高，且不需標曲。單糖組成大都采用液相色譜或氣相色譜，采用的檢測
4器為脈沖安培檢測，不需樣品柱前或柱后衍生，分辨率高，獲得的結果更可靠。本發明首次通過實驗驗證了白術多糖對腸道有益菌的增殖具有促進作用，實驗證 明，該白術多糖可在體外促進嬰兒、青春、動物雙歧桿菌和植物乳桿菌等益生菌的增殖。可 以作為一種益生元生產利用，具有調節腸道菌群平衡的作用，可以作為新型功能性益生元 開發。我們將白術多糖對微生態方面進行研究，彌補了這一方面的空白，并有希望添加至產 品中，開發新型功能性益生元產品。
圖1為本發明方法制得白術粗多糖的樣品照片。圖2為本發明方法制得白術精多糖的樣品照片。圖3為實施例1制得白術精多糖的S印harose CL-6B凝膠層析洗脫曲線圖4為實施例1制得白術精多糖的紫外掃描5不同添加量白術精多糖對雙歧桿菌生長的影響圖6不同添加量白術多糖(AMP)對乳桿菌生長的影響圖7白術多糖(AMP)的FT-IR譜8中A為單糖標品(1. 0 μ g/mL)HPAEC-PAD色譜圖；B為實施例1制得白術精多 糖的HPAEC-PAD色譜圖
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、白術多糖的提取方法1、白術多糖的提取方法取20g白術(購自北京同仁堂百旺山藥店)，加入200mL蒸餾水浸泡24h，然后其 浸泡液直接煎煮30min后過濾，濾渣加同量蒸餾水(200mL)再煎煮30min，合并濾液蒸發濃 縮至IOOmL,得到白術浸提液。2)白術多糖的提取純化水提醇沉法制備白術粗多糖將白術浸提液濃縮后加入3倍體積乙醇溶液(體積 百分濃度為95%，乙醇的終體積百分比濃度為71. 25% )，置于4°C冰箱醇沉24h，SOOOrpm 離心IOmin收集沉淀，沉淀用熱蒸餾水(40-80°C，普通室溫水即可，溫度稍高的水可以加快 溶解速度)復溶后，置于透析袋(0SO-T8340，MD34 (3500)，美國聯合碳化)中，將透析袋置 于去離子水中透析48h，除去乙醇、小分子糖、蛋白質、鹽等。濃縮透析液，真空冷凍干燥，得 白術粗多糖，粗糖提取率為10% (制得粗糖質量/白術干重)，樣品見圖1。Saveg法除蛋白將上述透析2)后獲得的白術粗多糖用熱蒸餾水(40-80°C，常溫 即可，溫度稍高的水可以加快溶解速度)復溶后得到白術粗多糖溶液，將Saveg液(氯仿 正丁醇(體積比)=4:1)與糖液以2 1(體積比)比例混合搖勻脫蛋白，SOOOrpm離心 IOmin收集上清液，重復4次，至紫外測定在260、280nm波長處無蛋白質和核酸的吸收峰得 到脫蛋白后的糖液。將脫蛋白后的糖液置于透析袋(0SO-T8340，MD34(3500)，美國聯合碳 化)中，將透析袋置于去離子水中透析48h，除去氯仿和正丁醇，濃縮，冷凍干燥得到不含蛋 白質的白術多糖。
DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱層析純化將除蛋白后的白術多糖用去離子 水配制成10mg/mL溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后，用DEAE-S印harose Fast Flow陰離子柱 (玻璃離子交換柱2. 6 X 20em，填裝DEAE-S印harose Fast Flow，購自Pharmacia)純化，以 7mL上樣后，用50mM Tris-HCl溶液洗脫，流速4. OmL/min, 2min/管，收集40管，部分收集器 收集洗脫液。以苯酚-硫酸比色法(徐斌，董英，林琳，等.改良苯酚-硫酸法測定苦瓜多 糖含量[J].食品科學，2005，26 (7) =79-82.)跟蹤檢測每管多糖含量。結果表明白術多糖 在洗脫液體積為120mL時洗脫完全。收集含多糖的峰的流出液，置于透析袋(0SO-T8340，MD34 (3500)，美國聯合碳化) 在去離子水中透析24h，去除Tris-HCl組分，濃縮后冷凍干燥，得到白術多糖純品并命名為 AMP (Atractylodes macrocephala polysaccharides)。該白術多糖純品照片如圖 2 所示。2、多糖純度鑒定1)常壓凝膠色譜層析(玻璃凝膠過濾柱1. 6 X 80cm,填裝S印harose CL-6B，購自 Pharmacia)將步驟1獲得的AMP凍干樣品用去離子水溶解，配制成10mg/mL溶液，0. 45 μ m 微孔濾膜過濾后上樣(IOmL)，0.05mol/L NaCl洗脫，流速30mL/h，12min/管，自動部分收集 器收集洗脫液。苯酚_硫酸比色法跟蹤檢測每管多糖含量，繪制曲線圖。結果如圖3所示，結果表明白術多糖已達色譜純。2)紫外(UV)檢測將步驟1獲得的純品AMP用去離子水溶解制備成0. 5mg/mL樣 品待測液，以去離子水為空白對照，在波長220-580nm范圍內利用紫外分光光度計進行紫 外全波長掃描，以確定AMP中是否含有核酸和蛋白質。結果表明步驟1獲得的純品AMP在260-280nm處無吸收，無蛋白質和核酸，如圖4。3、白術多糖對腸道菌群體外促生長試驗1)不同濃度白術多糖對雙歧桿菌體外生長的影響將活化好的5株雙歧桿菌(青 春雙歧桿菌CICC6070、嬰兒雙歧桿菌CICC6069、長雙歧桿菌CICC6068購于中國工業微生物 菌種保藏管理中心；兩歧雙歧桿菌1. 1852、動物雙歧桿菌1. 2268購自中國普通微生物菌種 保藏管理中心(CGMCC)，；分別以接種量(106CFU/mL)接種于步驟1制備的AMP添加的 終質量百分濃度為0%、0. 1%,0. 5%U.0%U. 5%,2. 0%或2. 5%的MRS培養基中，各濃度 重復三組，37°C培養24h后，于600nm波長下測定各培養液的OD值。結果表明白術多糖可在體外促進嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、動物雙歧桿菌的 增殖，有良好的促生長作用，具體結果見圖5。2)不同濃度白術多糖對乳桿菌的體外生長影響將活化好的2株乳桿菌(嗜酸乳 桿菌1. 2686、植物乳桿菌1. 124購自CGMCC)分別以接種量(約106CFU/mL)接種于AMP 添加終質量百分濃度為0%、0. 1%,0. 5%U. 0%U. 5%,2. 0%或2. 5%的MRS培養基中，各 濃度重復三組，37°C培養24h后，測定600nm波長下測定各培養液的OD值。結果表明白術多糖可以促進植物乳桿菌的增殖，見圖6。3)白術多糖對其余主要腸道菌群體外生長的影響將活化好的5大類腸道菌群代 表菌株(青春雙歧桿菌CICC6070、植物乳桿菌CGMCC1. 124、大腸桿菌ATCC83965、糞腸球菌 CGMCC1. 131、丁酸梭菌CGMCC1. 336)分別以接種量(約106CFU/mL)接種于AMP (步驟1 制備的白術多糖)添加終質量百分濃度為0. 的各自適宜培養基及對照組(不加白術多 糖)中，各組重復3組，37°C培養24h后，測定600nm波長下測定各培養液的OD值。
結果(見表1)表明，白術多糖可以促進青春雙歧桿菌、植物乳桿菌的生長，對其余 3類(大腸桿菌、丁酸梭菌、糞腸球菌)的促進效果不明顯，或有抑制作用，有調節腸道菌群 平衡的作用。表1 白術多糖對腸道菌群的調節作用
權利要求
一種白術多糖的制備方法，包括下述步驟1)將白術用水浸泡，然后煎煮，收集濾液，濃縮得到白術浸提液；2)在步驟1)獲得的白術浸提液中加入乙醇或乙醇溶液，至乙醇終體積百分比濃度為70％ 75％，置于4℃靜置24小時，離心收集沉淀，將沉淀用水溶解，然后在水中透析去除乙醇、小分子糖、蛋白質和鹽；濃縮透析液，真空冷凍干燥，得到白術粗多糖；3)將步驟2)獲得的白術粗多糖用水溶解，然后添加2倍體積的Saveg液，混合搖勻，離心收集上清液，重復此步驟，直到上清液經紫外測定在260和280nm波長處無蛋白質和核酸的吸收峰，此上清液為脫蛋白后的糖液；然后在水中透析除去氯仿和正丁醇，濃縮透析液，真空冷凍干燥，得到不含蛋白質的白術多糖；所述Saveg液為氯仿和正丁醇按體積比為4∶1混合后的混合液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將步驟3)獲得的不 含蛋白質的白術多糖用水溶解，進行DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子柱層析純化，用 50mM Tris-HCl洗脫，收集含多糖的洗脫液；將含多糖的洗脫液置于去離子水中透析去除 Tris-HCl組分濃縮后冷凍干燥，得到白術多糖。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)和步驟3)中，所述透析 的截留分子量為5000Da以下，優選為3500Da。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于所述步驟2)和步驟3)中， 所述透析的時間為24-72小時，優選為48小時。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述浸泡 的時間為12-36小時，優選為24小時；所述浸泡用水的用量為10ml/g白術；所述煎煮為將 浸泡后的白術用其浸泡液直接煎煮30分鐘，過濾收集濾液，將濾渣在用于浸泡液相同體積 的水煎煮30分鐘，收集濾液，合并兩次收集獲得的濾液。
6.權利要求1-5中任意一項所述的方法，其特征在于所述方法中，所用的水均為蒸餾 水或去離子水。
7.權利要求1-6中任意所述的方法制備的白術多糖。
8.權利要求7所述的白術多糖在促進腸道有益菌的增殖和/或調節腸道菌群平衡中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述腸道有益菌為嬰兒雙歧桿菌、青春雙 歧桿菌、動物雙歧桿菌或植物乳桿菌；所述腸道有益菌優選為嬰兒雙歧桿菌CICC6069、青 春雙歧桿菌CICC6070、兩歧雙歧桿菌CGMCC1. 1852或植物乳桿菌CGMCC1. 124。
10.權利要求7所述的白術多糖在制備促進腸道有益菌的增殖和/或調節腸道菌群平 衡產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種白術多糖的制備方法與應用。該白術多糖的制備方法，包括下述步驟1)將白術用水浸泡，然后煎煮，收集濾液，濃縮得到白術浸提液；2)加入乙醇，置于4℃靜置，離心收集沉淀，將沉淀溶解，然后在透析去除去乙醇、小分子糖、蛋白質和鹽；干燥，得到白術粗多糖；3)將白術粗多糖溶解，然后添加2倍體積的Saveg液，混合搖勻，離心收集上清液；然后在水中透析除去除去氯仿和正丁醇，干燥，得到不含蛋白質的白術多糖。實驗證明，該白術多糖可在體外促進嬰兒、青春、動物雙歧桿菌和植物乳桿菌等益生菌的增殖。可以作為一種益生元生產，具有調節腸道菌群平衡的作用，可以作為新型功能性益生元開發。
文檔編號A61P1/00GK101955549SQ201010294879
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者劉麗莎, 尚楠, 李平蘭, 王洋, 王銳 申請人:中國農業大學