專利名稱：骨重建激活劑-酪脯肽及其藥物組合物和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一類具有激動骨重建(Bone remodeling)功能的成骨生長肽C端五肽 (0GP5)結構改造化合物，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
骨質疏松(OP)的發病機理較為復雜。至今已經明確的是更年期的激素分泌失調、 一些腫瘤誘發、化療(如維甲酸、大量應用皮質激素等)等因素均可導致明顯的骨量丟失、 骨疼痛以致多發性骨折。研究表明，骨組織中的破骨細胞及成骨細胞交替活化、互相制約的平衡是骨代謝的重要基礎。因此一直破骨細胞及活化成骨細胞應該是改善骨代謝一場、修復骨組織的兩個重要環節。然而目前臨床上治療OP的藥物基本上是以破骨細胞為靶點的骨吸收抑制劑，如雙膦鹽類、雌激素及降鈣素等為主。實踐已經證明過分強調骨吸收抑制劑的應用，只能會削弱OP患者本已衰退的骨重建能力，進一步減少骨質重建部位，患者骨折率反而上升 [Blake, J. et al. JOGC, 2006, 28 (3) 185]，無益于骨質量的改善[丁曉穎，等.國外醫學內科學分冊，2004，3 (4) :175]。本發明涉及的酪脯肽系成骨生長肽C端五肽(0GP5)片段改構化合物。OGP為人體內源性可促進有絲分裂的含14個殘基的活性肽。其C末端五肽(簡稱OGPQ為主要活性段，它可以促進實驗動物的骨形成、增加骨密度及促使骨折的愈合[Chen Y. et al. J. Pept. Res. 2000,56 :147 ；Brager Μ. A. et al. J. Orthop. Res. 2000，18 :133]。0GP5 的作用靶點是成骨細胞，可望與以破骨細胞細胞為靶點的骨吸收抑制配合應用，達到使骨折率下降，真正改善骨質量的治療效果。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一類新的骨重建激活劑，具體而言就是一類新的化合物酪脯肽。本發明要解決的另一個技術問題是提供含有這類化合物的藥物組合物。本發明要解決的再一個技術問題是提供這類化合物在制備藥物中應用。為解決本發明的技術問題，本發明采用如下技術方案本發明以0GP5為先導結構，將第二位Gly改為環狀的ftx)，N端的Tyr及右側Phe可保留不變，也可以改為同樣具有苯環結構的側鏈。目標化合物中含有Tyr-Pro或Pro-Tyr片段是基本特點，因此取名為酪脯肽(Typrotide，簡寫TPT)。化合物主鏈的C端連有含HN (CH2) nC0NH (CH2) m (η及m = 1 10)結構的延長鏈為正序酪脯肽，或者N端連有大于4個單鍵長度的延長鏈則為反序酪脯肽。0GP5 =H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OHTPT 通式R1-X1-Pro-X2-X3-R2(I)
其中R1選自Suc (丁二酸單酰)、Ida(亞氨基二乙酸單酰)、Abu(Y-氨基丁酰)、 Aca (6-氨基己酰)、β-Ala、Gly (甘氨酰)或des (缺失)；X1,X2獨立的選自Tyr (酪氨酰)Ihe (苯丙氨酰),Phe (4-N02)(對硝基苯丙氨酰)、 Trp (色氨酰)、Ser (Bzl) (0-芐基絲氨酰)、Thr (Bzl) (0-芐基蘇氨酰)、HO-Ph-CO (對羥基苯甲酰)、Fer (3-甲氧基-4-羥基肉桂酰，阿魏酰)、Hna (羥基萘甲酰)、Pic (吡啶_2_甲酰)、Hip(N-苯甲酰基甘氨酰，馬脲酰)或Ml (鄰羥基苯甲酰，水楊酰)；X3 選自 β-Ala、Abu、Aca、Gly-Gly 或 des (缺失)；R2 選自 OH、NH2, Gol (H2NCH2CH2OH,甘氨醇)、NH (CH2) mCH3 并且 m 為 0 10 的整數、 NH(CH2)nOH并且η為0 10的整數。Tyr-Pro-Phe- β -Ala-NHEt1
Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHEt2
Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-Gol3
3-Hna-Pro-Ty-rβ -Ala-NHPr4
Hip-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr5
Fer-Pro-Phe (4_Ν02) -Aca-Go 16
Tyr-Pro-Phe (4-Ν02) -Aca-NHMe7
Fer-Pro-Phe- β -Ala-Gol8
Fer-Pro-Phe- β -Ala-NHPr9
Fer-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr10
Pic-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr11
Ida-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe14
Ida-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe13
Suc-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr14
Suc-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe15
Aca-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr16
Suc-Ser (Bzl)-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe17。
本發明還提供了酪脯肽的制備方法，所涉及的酪脯肽是通過化學合成的途徑制備
的。其中有的是采用固相合成方式合成，有的產物也可由傳統的溶液法合成。全部氨基酸原料均為Boc (叔丁氧羰酰基)保護形式。涉及的氨基酸原料為BOC-Tyr-0H、BOC-Pro-0H、 Boc-Phe-OH、Boc-Ser (Bzl) _0H、Boc-Phe (4-N02) _0H、Boc-Aca-OH、Boc- β -Ala-OH0 縮合試劑有Cl-HOBt (5-氯代-1-羥基苯并三唑)、HBTU (苯并三唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲鐺六氟磷酸鹽)、DIC ( 二異丙基碳二亞胺)，其他試劑有NMM (N-甲基嗎啉)，TEA (三乙胺)、TFA (三氟乙酸)、TESi (三乙基硅)。脫除Boc基的條件為50% TFA/CH2C12 (DCM)。氨解切除樹脂試劑為 3O % MeNH2/Et0H,70% EtNH2/H20U00% PrNH2。本發明涉及的生物活性評價是以切除卵巢(OVX)的大鼠為OP動物模型，陽性對照藥為阿倫磷酸鈉(Alen)。酪脯肽的給藥時限為切除卵巢后連續皮下注射12周。隨后處死動物進行故形態學及動力學等指標的測定(詳見實施例)。生物活性實驗結果表明酪脯肽對OP患鼠的骨形態學各項指標，如BV/TV (骨小梁體積/全骨體積)、ΤΒ· Th (骨小梁寬度)、Tb. sp (骨小梁間隙)、Tb. N(骨小梁節點數)、0V/ BV(類骨質體積比)、0S/BS(類骨質表面比)，及骨動力學參數如sL. s/BS(四環素單標記長度與骨小梁周長比值)、dL. s/BS(四環素雙標記長度與骨小梁周長的比值)，及骨礦化指標如MS/BS、MAR、MLT等均明顯優于Alen組。其中多數指標均可反應骨重建的活躍情況，由此可證明本發明的酪脯肽對OP大鼠的骨重建激活發揮了重要作用。相比之下，陽性對照要 Alen沒有任何激動骨重建的活性，此結果與雙膦鹽在臨床上不能減少骨折，反而增加骨折率的不理想結果是一致的。本發明還提供了本發明化合物在制備與預防或治療骨質疏松的藥物組合物中的應用。在制備與腫瘤并發的骨疾病的藥物中的應用。所述的與腫瘤并發的骨疾病選自高鈣血癥、骨疼痛、變形性骨炎或多發性骨髓瘤。在制備促進外科骨移植、創傷性骨折愈合的藥物中的應用。所述的藥物是和骨吸收抑制劑配合的續貫治療藥物。本發明再一方面還涉及以本發明化合物作為活性成份的藥物組合物。該藥物組合物可根據本領域公知的方法制備。可通過將本發明化合物與一種或多種藥學上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結合，制成適于人或動物使用的任何劑型。本發明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0. 1-95重量％。本發明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、 陰道、直腸等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括0/V型、w/o型和復乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、 粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、 顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。本發明化合物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種
微粒給藥系統。為了將本發明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯聚乙烯吡咯烷酮、交聯羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆粒或微丸，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發明化合物的膠囊劑。為將本發明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領域常用的增溶劑、助溶劑、PH調劑劑、滲透壓調節劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β-環糊精等；PH調劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、 氫氧化鈉等；滲透壓調節劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。為達到用藥目的，增強治療效果，本發明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。本發明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發明化合物的每天的合適劑量范圍為0. 001-150mg/Kg體重，優選為0. l-100mg/Kg體重，更優選為 l-60mg/Kg體重，最優選為2-30mg/Kg體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫生的臨床經驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。本發明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對癥藥物合并使用。 當本發明的化合物與其它治療藥物存在協同作用時，應根據實際情況調整它的劑量。術語和簡稱
TPT酪脯肽；
Suc丁二酸單酰；
Ida亞氨基二乙酸單酰；
AbuY-氨基丁酰；
Aca6-氨基己酰；
Gly甘氨酰
Des缺失;
Tyr酪氨酰；
Phe苯丙氨酰；
Phe(4-N02)對硝基苯丙氨酰；
Trp色氨酰；
Ser(Bzl) :0_芐基絲氨酰；
Thr(Bzl) :0-芐基蘇氨酰;
HO-Ph-CO 對羥基苯甲酰；
Fer3-甲氧基-4-羥基肉桂酰，又名阿
Hna:羥基萘甲酰；
Pic吡啶-2-甲酰；
Hip:N-苯甲酰基甘氨酰，又名馬脲酰；
Sal鄰羥基苯甲酰，又名水楊酰；
Gol=H2NCH2CH2OH,又名甘氨醇；
7CN 102532261 A0P:骨質疏松；0GP5 =H-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OHBoc 叔丁氧羰酰基Cl-HOBt 5-氯代羥基苯并三唑；HBTU 苯并三唑-N，N，N，，N，-四甲基脲鐺六氟磷酸鹽；DIC 二異丙基碳二亞胺；NMM :N-甲基嗎啉；TEA 三乙胺；TFA:三氟乙酸；TESi 三乙基硅。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合具體實施例對本發明實施方式作進一步地詳細描述。實施例1Tyr-Pro-Phe- β -Ala-NHEt (1)的合成①Boc- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取氯甲基樹脂(取代度lmmol/g，交聯度1%，粒度100-200目)重20g(20mmol)、 Boc-^-Ala-OH 11. 34g(60mmol)、K2CO3 8. ^g (60mmol)及 KI 0. 2g (0. 12mmol)，共同混合于300mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中。經60°C旋轉反應24h后，濾除上清液。樹脂依次用下列溶劑洗濾60°C DMF (X 3 次)、50% EtOH(乙醇)/H2O (X 3 次)、DMF (X 5 次)、60°C 95% K0H(X5次)、K2O(乙醚X2次)之后抽干。將樹脂至于紅外燈下，50°C干燥至恒重。稱量得Boc- β -Ala-樹脂23g，增重3. Og (理論AW = 3. 05g)，此步產率為98 %。②脫Boc基，中間體β -Ala-OCH2-聚苯乙烯的制備將上述的Boc-^-Ala-樹脂在可密封的反應管內與230ml 50 % TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混搖10分鐘，抽除酸液，再加入230mL 50% TFA/DCM，再搖動30分鐘。 收集酸解液(用于下回的第一次脫Boc反應)。樹脂依次經下列溶劑洗濾DCMX5、95% EtOHX 3、10% TEA/EtOAc(三乙胺 / 乙酸乙酯)X 2、DMFX 3、EtOHX 3、Et2OX 2、抽干備用。③二肽樹脂Wie- β -Ala-0CH2-聚苯乙烯的制備羧基組分的活化取Boc-Phe-OH 1. 5g (6mmol)、Cl-HOBt 1. 02g (6mmol)、HBTU 2. 276g(6mmol)，共同溶于IOmL DMF中，全溶解后加入NMM 0. 67mL (6mmol)。混合反應三分鐘后與2. 3g(2mmol) β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂混于肽反應管中。室溫下搖動3h，濾除上清液。樹脂依次經下列溶劑洗濾DMFX3、K0HX2、DMFX3、K0HX5、K20X2。取樹脂樣品 1 2mg于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106°C反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明β -Ala 上的氨基已被酰化完全，即Boc-Phe-OH已完全縮合上。經脫Boc基處理(與步驟②相同)， 得到二肽I^he-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體2. 59g。④三肽樹脂Pro-Phe- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備 以Boc-Pro-OH為羧基組分，按照上述步驟③的縮合及步驟②的脫Boc保護條件處理，得到三肽Pro-Phe- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂2. 78g。
⑤四肽樹脂Tyr-Pro-Phe- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯的制備以Boc-Tyr-OH為羧基組分，按照上述的縮合及脫Boc基的條件處理，得到四肽樹脂中間體3. 09g。⑥氨解切除樹脂，產物1的制備取四肽樹脂中間體Tyr-Pro-Phe-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯 1. 5g(Immol)與 8ml 含 70% H2NEt的水溶液及8ml THF (四氫呋喃)共混于可密閉的肽反應管內。室溫搖動反應 30h,收集上清液。殘余樹脂再用95% KOH洗濾兩次。合并濾液，并于50°C下減壓蒸除溶劑。 基本除凈溶劑后，加入5ml甲苯及IOml 95% Κ0Η，再減壓蒸除微量水分。得到近白色的殘渣，經無水K2O充分研碎，過濾收集粉狀產物48aiig (理論值為523mg)，總收率為92. 1%， ESI-MS 分析 524. 2060 (M+H)。實施例2Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHEt (2)及 Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-Gol (3)的合成①按照實施例1中步驟①和②的條件，制備β -Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體2. 5g。②二肽樹脂Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯的制備羧基組分的活化取Boc-Tyr-OH 1. 686g(6mmol)、Cl-HOBt 1. 02g(6mmol)、HBTU 2. 276g(6mmol)，共同溶于IOmL DMF中，全溶解后加入NMM 0. 67mL (6mmol)。混合反應三分鐘后與2. 3g^nm0l) β-Ala-OCHdXi脂混于肽反應管中。室溫下搖動池，濾除上清液。樹脂依次經下列溶劑洗濾DMFX3、K0HX2、DMFX3、K0HX5Jt20X2。取樹脂樣品1 ^ig于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106°C反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明β-Ala上的氨基已被酰化完全，即Boc-Tyr-OH已完全縮合上。經脫Boc基處理(與步驟②相同)，得到二肽 Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體2. 62g。③三肽樹脂ftx)-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備以Boc-Pro-OH為羧基組分，按照上述步驟②的縮合及步驟②的脫Boc保護條件處理，得到三肽ftx)-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂2. 81g。④四肽樹脂Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備以Boc-Tyr-OH為羧基組分，按照上述步驟②中的縮合脫Boc基的條件處理，得到四肽樹脂中間體3. 13g。⑤氨解切除樹脂，產物2的制備取四肽樹脂中間體Tyr-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯 1. 6g(Immol)與 8ml 含 70% H2NEt的水溶液及8ml THF共混于可密閉的肽反應管內。室溫搖動反應30h，收集上清液。殘余樹脂再用95% KOH洗濾兩次。合并濾液，并于50°C下減壓蒸除溶劑。基本除凈溶劑后，加入5ml甲苯及IOml 95 % Κ0Η，再減壓蒸除微量水分。得到近白色的殘渣，經無水肚20充分研碎，過濾收集得到產物2的粉末479mg(理論539mg)，總收率88. 8%,ESI-MS 分析 MO. 2113 (M+H)。取另一份步驟④得到的四肽樹脂(1. 56g)與3ml的乙醇胺(50mmol)及15ml 95% KOH混合。室溫搖動反應50h，收集濾液。殘余樹脂經95% KOH混合。室溫搖動反應50h， 收集濾液。殘余樹脂經95% KOH洗濾兩次，合并濾液。50°C下減壓蒸除Κ0Η，得到粘稠的淺黃色殘留液。加入200ml蒸餾水，放置汕。濾集白色沉淀。再用KOAc-nBuOHd 1) 200ml 混合，于分頁漏斗中萃取，除去水層，有機層用水洗兩次后，加無水硫酸鈉干燥，濃縮蒸干，用K2O研磨，得粉狀產物3重453mg (理論555mg)，總收率81. 6 %，ESI-MS分析 556.2301(M+H)。實施例3I-Hna-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr (4)及 l-Hna-Pro-Tyr- β -Ala-Gol (5)的合成①按照實施例2中步驟① ③的條件，制備ftx)-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體 2. 8g。②四肽樹脂I-Hna-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯的制備羧基組分的活化取I-Hna 1. 128g(6mmol)、Cl-HOBt 1. 02g(6mmol)、HBTU 2. 276g(6mmol)，共同溶于IOmL DMF中，全溶解后加入NMM 0. 89mL (8mmol)。混合反應三分鐘后與2. 8g (2mmol) Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂混于肽反應管中。室溫下搖動3h， 濾除上清液。樹脂依次經下列溶劑洗濾DMFX3、EtOHX2, DMFX3、EtOHX5, Et2OX2。取樹脂樣品1 2mg于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106°C反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明Tyr上的氨基已被酰化完全，即Boc-Tyr-OH已完全縮合上。經脫Boc基處理(與步驟② 相同)，得到四肽I-Hna-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體2. 9g。③氨解切除樹脂，產物4和5的制備取該中間體(1. 45g，lmmol)，與5ml丙胺及8ml THF共混于可密閉的肽反應管內。室溫搖動反應30h，收集上清液。殘余樹脂再用95% KOH洗濾兩次。合并濾液，并于 50°C下減壓蒸除溶劑。基本除凈溶劑后，加入5ml甲苯及IOml 95% Κ0Η，再減壓蒸除微量水分。得到淡黃色的殘渣，經無水肚20充分研碎，過濾收集得到產物4的粉末510mg (理論重 560mg)，總收率為 91 %，ESI-MS 分析 556. 3850 (M+H)。取另一份步驟②得到的四肽樹脂(1. 45g)與3ml的乙醇胺(50mmol)及15ml 95% KOH混合。室溫搖動反應50h，收集濾液。殘余樹脂經95% KOH混合。室溫搖動反應50h， 收集濾液。殘余樹脂經95% KOH洗濾兩次，合并濾液。50°C下減壓蒸除Κ0Η，得到粘稠的淺黃色殘留液。加入200ml蒸餾水，放置汕。濾集白色沉淀。再用KOAc-nBuOHd 1) 200ml 混合，于分頁漏斗中萃取，除去水層，有機層用水洗兩次后，加無水硫酸鈉干燥，濃縮蒸干， 用K2O研磨，得到產物5的粉末478mg(理論重56ang)，總收率為85. 0%，ESI-MS分析 563. 2131 (M+H)。實施例4Fer-Pro-Phe (4-N02) -Aca-Gol (6)及 Tyr—Pro—Phe (4-N02) -Aca-NHMe (7)的合成①Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備稱取氯甲基樹脂(取代度lmmol/g，交聯度1%，粒度100-200目)重IOg (IOmmol)、 Boc-Aca-OH 6. 9g(30mmol)、K2C034. 14g(30mmol)及 KI 0. Ig (0. 06mmol)，共同混合于 150mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中。經60°C旋轉反應24h后，濾除上清液。樹脂依次用下列溶劑洗濾60°C DMF(X3 次)、50% EtOH (乙醇)/H20(X3 次)、DMF(X5 次)、60°C 95% K0H(X5次)、K2O(乙醚X2次)之后抽干。將樹脂至于紅外燈下，50°C干燥至恒重。將上述的Boc-Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂在可密封的反應管內與150ml 50% TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混搖10分鐘，抽除酸液，再加入150mL 50% TFA/DCM,再搖動30分鐘。 收集酸解液(用于下回的第一次脫Boc反應)。樹脂依次經下列溶劑洗濾DCMX5、95% EtOHX3UO% TEA/Et0Ac(三乙胺 / 乙酸乙酯)X2、DMFX3、EtOHX3、K2OX2、抽干稱量得Boc-Aca-0CH2-聚苯乙烯樹脂10. 93g，增重0. 93g(理論Aff = O. 945g)，此步產率為98%。②二肽樹脂Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯的制備羧基組分的活化取Boc-Phe (4-N02)-OH 1. 86g(6mmol)、Cl-HOBtl. 02g(6mmol)、 HBTU 2. 276g(6mmol)，共同溶于IOmLDMF中，全溶解后加入NMM 0. 67mL (6mmol)。混合反應三分鐘后與2. 2g^nmOl)Aca-0CHd〗i脂混于肽反應管中。室溫下搖動池，濾除上清液。樹脂依次經下列溶劑洗濾DMFX3、K0HX2、DMFX3、K0HX5Jt20X2。取樹脂樣品1 ^ig于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106°C反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明Aca上的氨基已被酰化完全，即Boc-Phe-OH已完全縮合上。將上述的樹脂在可密封的反應管內與150ml 50% TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混搖10分鐘，抽除酸液，再加入150mL 50% TFA/DCM，再搖動30分鐘。收集酸解液(用于下回的第一次脫Boc反應)。樹脂依次經下列溶劑洗濾 DCMX 5、95% EtOHX 3、10% TEA/EtOAc (三乙胺 / 乙酸乙酯)X 2,DMFX 3,EtOHX 3,Et2OX 2, 抽干稱量得到二肽Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體2. 79g。③三肽樹脂Pro-Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備以Boc-Pro-OH為羧基組分，按照上述步驟③的縮合及步驟②的脫Boc保護條件處理，得到三肽Pro-Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂3. Olgo④四肽樹脂!^r-Pr0-Phe-Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述步驟③的三肽樹脂1. 5g，以阿魏酸為羧基組分，按照上述步驟②的縮合條件處理，得到四肽樹脂中間體1. 55g。⑤四肽樹脂Tyr-Pro-Phe (4-N02) -Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂的制備取上述步驟④的三肽樹脂1. 5g，以Boc-Tyr為羧基組分，按照上述步驟②的縮合及脫保護條件處理，得到四肽樹脂中間體1. 54g⑥氨解切除樹脂，產物6和7的制備取步驟④所得四肽樹脂中間體!^r-Pr0-Phe-Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂 1. 55g(0. 94mmol)與3ml的乙醇胺(50mmol)及15ml 95% EtOH混合。室溫搖動反應50h， 收集濾液。殘余樹脂經95% KOH混合。室溫搖動反應50h，收集濾液。殘余樹脂經95% KOH洗濾兩次，合并濾液。50°C下減壓蒸除Κ0Η，得到粘稠的淺黃色殘留液。加入200ml蒸餾水，放置池。濾集白色沉淀。再用KOAc-nBuOHd 1) 200ml混合，于分頁漏斗中萃取， 除去水層，有機層用水洗兩次后，加無水硫酸鈉干燥，濃縮蒸干，用肚20研磨，最后得到產物 6 重 559mg(理論值 639mg)，總收率 87. 5%, ESI-MS 分析 640. 2985 (M+H)。另取步驟④所得四肽樹脂中間體Tyr-Pro-Phe G-NO2)-Aca-OCH2-聚苯乙烯樹脂 1. 54g(0. 94mmol)與15ml含33% H2^e的水溶液混于可密閉的肽反應管內。室溫搖動反應30h，收集上清液。殘余樹脂再用95% KOH洗濾兩次。合并濾液，并于50°C下減壓蒸除溶劑。基本除凈溶劑后，加入5ml甲苯及IOml 95% Κ0Η，再減壓蒸除微量水分。得到淡黃色的殘渣，經無水K2O充分研碎，過濾收集得到粉狀產物7重497mg (理論值596mg)，總收率 83. 5 %，ESI-MS 分析 597. 2984 (M+H)。實施例5Fer-Pro-Phe- β -Ala-Gol (8)及 Fer-Pro-Phe- β -Ala-NHPr (9)的合成①按照實施例1中步驟① ④的條件，制備Pro-Phe- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯三肽中間體2. 5g。
②取上述三肽樹脂2. 5g，以阿魏酸為羧基組分，按照上述實施例1中步驟③的縮合條件處理，得到四肽Fer-Pro-Phe-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體2. 62g。③按照實施例3中步驟③的方法，得到目標產物，結果為產物8重478mg，收率 86. 6 %，ESI-MS 分析553. 2721 (M+H)。產物 9 重 508mg,收率 92. 5 %，ESI-MS 分析 551. 2668 (M+H).實施例6Fer-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr (10)及 Pic-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr (11)的合成①按照實施例2中步驟① ③的條件，制備ftx)-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體 2. 8g。②取1. 4g上述步驟①的三肽中間體，按照實施例4中步驟④的條件，以阿魏酸作為羧基組分制備Fer-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體1. 45g。③取1.4g上述步驟①的三肽中間體，按照實施例4中步驟④的條件，以吡啶-2-甲酸作為羧基組分制備Pic-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體1. 4g。④氨解切除樹脂，產物10和11的制備按照實施例3中步驟③的方法，以丙胺氨解得到目標產物的結果為產物10重 519mg，總收率91. 8%,ESI-MS分析567. 301 (M+H)。產物 11 重488mg，總收率85. 9%,ESI-MS 分析 569. 2983 (M+H).實施例7Ida-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (12)及 Ida-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (13)的合成①按照實施例2中步驟① ③的條件，制備ftx)-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體 2. 8g。②取上述步驟①三肽樹脂中間體1.4g，按照實施例2中步驟④的條件，制備 Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體 1. 56go③取上述步驟①三肽樹脂中間體1.4g，按照實施例1中步驟②的條件，制備 Phe-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體 1. 54go④將上述步驟②和③的三肽樹脂中間體分別置于兩個固相反應管中。另取 Boc-Ida-OH 1. 4g(6mmol)、DIC 0. 76g(6mmol)溶于 15mLTHF 中，混合均勻后于冰水浴中攪拌反應4小時后，取一半體積的反應溶液加入到步驟②所得樹脂的反應管中，另一半體積溶液加入到步驟③所得的樹脂中間體中，混合均勻后向兩個反應管中均加入NMMO. IlmL(Immol)和0. 3ml吡啶，室溫下搖動混合反應他。。取樹脂樣品 1 2mg于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106 °C反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明 Tyr或Phe上的氨基已被酰化完全。經脫Boc基處理(與實施例1中步驟②相同)， 得到分別得到四肽Ida-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體1. 55g和 Ida-Phe-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體 1. 53go⑤按照實施例4中步驟⑥的甲胺解方法切除樹脂，得到目標產物的結果為產物 12 重 576mg，總收率90. 0%，ESI-MS 分析641. 2640 (M+H)。產物 13 重578mg，總收率92. 6%, ESI-MS 分析 625. 2156 (M+H).實施例8
12
Suc-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (14)及 Suc-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (15)的合成①按照實施例2中步驟① ③的條件，制備ftx)-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體 2. 8g。②取上述步驟①四肽樹脂中間體1. 4g，按照實施例2中步驟④的縮合及脫保護條件，制備Tyr-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體1. 56g。③取上述步驟①四肽樹脂中間體1. 4g，按照實施例2中步驟③的縮合及脫保護條件，制備Phe-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體1. 54g④將上述步驟②和③的四肽樹脂中間體分別置于兩個固相反應管中。另取丁二酐1.4g(6mm0l)溶于15mL THF中，取一半體積的溶液加入到步驟②所得樹脂的反應管中，另一半體積溶液加入到步驟③所得的樹脂中間體中，混合均勻后向兩個反應管中加入 NMMO. IlmL(Immol)和0. 3ml吡啶，室溫下搖動混合反應乩。取樹脂樣品1 2mg于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106°C反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明Tyr或Phe上的氨基已被酰化完全。經洗滌和干燥處理，分別得到五肽Suc-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體1. 55g和Suc-Phe-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體1. 53g。⑤實施例4中步驟⑥的甲胺解方法，得到目標產物，結果為產物14重59aiig， 收率 90. 7%, ESI-MS 分析 654. 3057 (M+H)。產物 15 重 558mg,收率 91. 6%, ESI-MS 分析 610.2298(M+H).實施例9化合物Aca-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr (16)的合成①按照實施例2中步驟① ③的條件，制備ftx)-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體1.4g。②取上述步驟①四肽樹脂中間體1. 4g，按照實施例2中步驟③的縮合及脫保護條件，制備四肽Wie-Pro-Tyr-β-Ala-OCH2-聚苯乙烯中間體1. 54g③五肽Aca-Phe-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體的制備羧基組分的活化取Boc-Aca-OH 0. 693g (3mmol)、Cl-HOBt 0. 51g (3mmol)、HBTU 1. 138g(3mmol)，共同溶于IOmL DMF中，全溶解后加入NMM 0. 44mL (4mmol)。混合反應三分鐘后與1. 54g (Immol)四肽Phe-Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體混于肽反應管中。室溫下搖動池，濾除上清液。樹脂依次經下列溶劑洗濾DMFX3、K0HX2、 DMFX 3、EtOHX 5、Et2OX 2。取樹脂樣品1 2mg于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106°C 反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明Phe上的氨基已被酰化完全，即Boc-Aca-OH已完全縮合上。將上述的樹脂在可密封的反應管內與150ml 50% TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混搖10分鐘，抽除酸液，再加入150mL 50 % TFA/DCM，再搖動30分鐘。收集酸解液 (用于下回的第一次脫Boc反應)。樹脂依次經下列溶劑洗濾DCMX5、95% KOHX3、 10% TEA/EtOAc(三乙胺/乙酸乙酯)X2、DMFX3、EtOHX3、Et2OX2、抽干稱量得到五月太 Aca-Phe-Pro-Tyr-^-Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體 1. 65g。④按照實施例3中步驟③的丙胺解方法，得到產物16重561mg，總收率86. 3%, ESI-MS 分析 651. 4781 (M+H)。實施例10
化合物Suc-Ser (Bzl) -Pro-Tyr- β -Ala-NHMe (17)的合成①按照實施例2中步驟① ③的條件，制備ftx)-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體1.4g。②四肽^r(Bzl)-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體的制備羧基組分的活化取Boc-Ser(Bzl)-OH 0. 885g(3mmol)、Cl-HOBtO. 51g(3mmol)、 HBTU 1. 138g(3mmol)，共同溶于 IOmLDMF 中，全溶解后加入 NMM 0. 44mL(4mmol)。混合反應三分鐘后與1. 54g(Immol)四肽Phe-Pro-Tyr-β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體混于肽反應管中。室溫下搖動池，濾除上清液。樹脂依次經下列溶劑洗濾DMFX3、KOHX2、 DMFX 3、EtOHX 5、Et2OX 2。取樹脂樣品1 2mg于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106°C 反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明Phe上的氨基已被酰化完全，即Boc-Aca-OH已完全縮合上。將上述的樹脂在可密封的反應管內與150ml 50% TFA/DCM(三氟乙酸/ 二氯甲烷)混搖10分鐘，抽除酸液，再加入150mL 50 % TFA/DCM，再搖動30分鐘。收集酸解液 (用于下回的第一次脫Boc反應)。樹脂依次經下列溶劑洗濾DCMX5、95% KOHX3、 10% TEA/EtOAc(三乙胺/乙酸乙酯)X2、DMFX3、EtOHX3、Et2OX2、抽干稱量得到五月太 Ser (Bzl) -Pro-Tyr- β -Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體 1. 7g。③取丁二酐0. 7g(3mmol)溶于15mL THF中，加入到步驟②所得的樹脂中間體中， 混合均勻后向兩個反應管中加入NMM 0. IlmL(Immol)和0. 3ml吡啶，室溫下搖動混合反應他。取樹脂樣品1 2mg于小試管內，加入Kaiser試劑加熱106°C反應5分鐘，樹脂未見變藍。表明Ser上的氨基已被酰化完全。經洗滌和干燥處理，得到Suder(Bzl)-Pro-Tyr -β-Ala-OCH2-聚苯乙烯樹脂中間體1. 7g。④按照實施例4中步驟⑥的甲胺解方法，得到目標產物17重58aiig，總收率 91. 1%, ESI-MS 分析 640. 2591 (M+H)。藥理實驗實驗例1生物活性試驗及結果(1)動物模型以4月齡雌性SD大鼠為實驗動物，適應性飼養2周后，切除卵巢(OVX)，作為造成OP的模型。(2)分組情況，以下各組均為8只大鼠OVX組-切除卵巢，不給治療劑SHAM組-假手術組，不給治療劑Alen組-造模后每天給阿倫磷酸鈉100 μ g/kg體重l/3dAlen組-每個骨重建周期(15d)的第二個五天給予Alen。另十天不給藥，即緩沖液5d/Alen5d/空白5dTPT三個組-造模后給一種TPT 5d，第6 10天給Alen 5d，第11 15天不給任何治療劑。(3)治療劑的給藥方式與劑量Alen-皮下注射，5 μ g/kg 體重/dTPT-10nmol/100g 體重/d
(4)藥效評價指標BV/TV(% )骨小梁體積/全骨體積之比，值越高表明骨量越多Tb. Th(Um)骨小梁寬度，值越高療效越好Tb. SP ( μ m)骨小梁間隙，值越小療效越好
Tb. N每視野中的骨小梁節點，越多越好0V/BV(% )相對類骨質體積比，骨重建活躍指標，越高越有效0S/BS (% )相對類骨質表面比sLS/BS(% )四環素單標記長度與骨小梁周長的比值反映骨重建活性，表明骨小梁表面的激活頻率，越高越好dLS/BS(% )四環素雙標記長度與骨小梁周長的比值，意義同sLS/BSMS/BS(% )骨礦化表面，單位骨表面上的全部雙標記面加上半數單標記面的總和，越高越好MAR ( μ m/d)礦化沉積率，越高越好MLT (d)礦化延遲時間，越短越好BFR(T) (μ m/d)組織水平的骨形成速率，數值越高越好(5)骨形態學及骨力學參數測定結果表1.骨形態學參數
權利要求
1.如通式⑴所示的酪脯肽化合物
2.根據權利要求1的化合物，其特征在于，所述的化合物選自如下群組 Tyr-Pro-Phe- β -Ala-NHEtTyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHEt Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-Gol 3-Hna-Pro-Tyr-β -Ala-NHPr Hip-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Fer-Pro-Phe (4_Ν02) -Aca-Go 1 Tyr-Pro-Phe (4-Ν02) -Aca-NHMe Fer-Pro-Phe- β -Ala-Gol Fer-Pro-Phe- β -Ala-NHPr Fer-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Pic-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Ida-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe Ida-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe Suc-Tyr-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Suc-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe Aca-Phe-Pro-Tyr- β -Ala-NHPr Suc-Ser(Bzl)-Pro-Tyr- β -Ala-NHMe。
3.—種藥物組合物，其特征在于，含有權利要求1-2中任一項的化合物和制藥學上可接受的載體。
4.權利要求1-2中任一項的化合物在制備與預防或治療骨質疏松的藥物中的應用。
5.權利要求1-2中任一項的化合物在制備與腫瘤并發的骨疾病的藥物中的應用。
6.根據權利要求5的應用，其特征在于，所述的與腫瘤并發的骨疾病選自高鈣血癥、骨疼痛、變形性骨炎或多發性骨髓瘤。
7.權利要求1-2中任一項的化合物在制備促進外科骨移植、創傷性骨折愈合的藥物中的應用。
8.根據權利要求4-7中任一項的應用，其特征在于，所述的藥物是和骨吸收抑制劑配合的續貫治療藥物。
全文摘要
本發明公開了一類骨重建激活劑-酪脯肽及其藥物組合物和用途。具體而言，本發明對成骨生長肽C端五肽(OGP5)的結構改造而發現的一類具有激活骨重建活性的通式(I)所示的酪脯肽化合物，涉及新肽的結構設計、合成方法、與抑制骨吸收藥物雙膦鹽配合的ADFR治療實驗性大鼠的骨質疏松(OP)。本發明的OGP5改構肽可以明顯激活OP患鼠的骨重建，可望發展成一種改善骨質量、治療OP、股骨頭壞死及骨創傷的理想藥物。
文檔編號A61K38/07GK102532261SQ201010611949
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者盧飚, 楊瀟驍, 林浩, 王德心, 邱明才, 韓香 申請人:中國醫學科學院藥物研究所