抗氧化劑的制造方法

專利名稱：抗氧化劑的制造方法
技術領域：
本發明涉及使用假絲酵母屬(Candida)微生物由豆渣發酵抗氧化劑的制造方法以及由該制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化劑。
背景技術：
近年來，活性氧被認為是造成皮膚皺紋、張力降低等老化的原因，作為防止老化的方法之一，除去活性氧的方法已廣為所知。作為活性氧清除劑被使用的有超氧化物岐化酶 (S0D，也被稱為抗氧化酶)等。SOD不僅具有抑制活性氧發生的效果，而且能夠防止由活性氧引起的皮膚變粗糙和斑點、皺紋等(參照非專利文獻1)。因此，近年來，人們對具有SOD活性的抗氧化物質進行了相關研究。例如，已提出了白樺提取組合物(參照專利文獻1)以及以七葉樹籽的提取物為有效成分的SOD活性化劑(參照專利文獻幻等。然而，由于這些SOD活性化劑全都是從植物原料提取得到，該提取操作耗費時間長，且由于天然資源的利用可能性有限等原因，其制造成本高。另外，除了來自植物的抗氧化物質以外，乳酸菌等的發酵物也被發現具有抗氧化效果。例如，專利文獻3中提出了對于廣范圍的過氧化物具有分解特性的乳酸菌由來的培養物。然而，該培養物僅僅是從豆曲等分離源分離乳酸菌、并培養，從所得到的培養物回收菌體，而得到的含有該菌體的菌體懸濁液，對于過氧化氫等過氧化物具有分解特性。對于過氧化物的分解有可能是由還原性物質引起的分解，因而并不一定是由SOD引起的分解。另夕卜，非專利文獻2 5中公開了由納豆菌或乳酸菌發酵豆渣得到的發酵物具有抗氧化作用。 然而，這些研究都偏重于豆渣發酵物的亞油酸體系中的抗氧化作用、羥自由基清除能力、過氧化氫清除活性等抗氧化作用，而對于具有SOD活性還未有報道。此外，專利文獻4、5中提出了納豆菌發酵番石榴葉由來的抗氧化物質。然而，從其實施例可以看出，只使用番石榴提取物(試樣1)和只使用米糠、大豆發酵物(試樣幻時的 SOD活性都低，其活性氧清除效果不充分。而且，由于番石榴葉的獲得受季節限制，因而該方法同樣在實際使用上存在困難。如上所述，雖然已知具有各種活性氧清除能力的物質，但是，這些物質中還沒有發現高SOD活性，已實用化的物質也很少。而且，目前還沒有利用假絲酵母屬(Candida)的微生物來制造具有高SOD活性的抗氧化劑的報道。非專利文獻1 食品功能素材11，2001年4月27日出版，株式會社廣告節目郗， 44-63 頁非專利文獻2 田村貴起等，日本食品科學工學會刊，1999年，第46卷，第9號， 561-569 頁非專利文獻3 渡邊泰成等，崎玉縣產業技術綜合中心研究報告，2005年，第3卷非專利文獻 4 :B. Moktan, etc.，Food Research International, 2008,41 :586-93非專利文獻5 :Y. P. Zhu, etc.，Food Control, 2008,19 :654-661專利文獻1 :日本特開2008-88109號公報
專利文獻2 日本特開2007-291069號公報專利文獻3 日本特開2009-191276號公報專利文獻4 日本特開2004-24004號公報專利文獻5 日本特開2004-43505號公報

發明內容
針對上述現有技術中存在的技術問題，本發明人進行了悉心研究，結果發現 在含有豆渣的培養基中培養假絲酵母屬(Candida)的微生物，特別是培養誕沫假絲酵母(Candida zeylanoides)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)或熱帶假絲酵母 (Candida metapsilosis)，能夠低成本且高效地獲得抗氧化劑，從而完成本發明。本發明涉及提供一種抗氧化劑的制造方法，其中，在含有豆渣的培養基中培養假絲酵母屬(Candida)的微生物，從其上清液中得到抗氧化劑。本發明還涉及提供根據上述抗氧化劑的制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化劑。本發明還涉及豆渣的假絲酵母屬(Candida)的發酵提取物作為抗氧化劑的用途。本發明還涉及提供豆渣的假絲酵母屬(Candida)的發酵提取物在制造(活性氧清除劑)中的用途。本發明還涉及提供配合有上述抗氧化劑的食品、化妝品、醫藥品。發明效果根據本發明所涉及的抗氧化劑的制造方法，能夠利用特定微生物，以食品加工業等的副產物豆渣作為培養基的主原料，低成本且高效地得到抗氧化劑，該抗氧化劑具有活性氧清除效果，安全性優異，容易操作，因而能夠用于食品、化妝品、醫藥品等領域。
具體實施例方式本發明所使用的微生物是假絲酵母屬(Candida)的微生物。作為同屬微生物，可以列舉出誕沫假絲酵母(Candida zeylanoides)、近平滑假絲酵母(Candidapara psilosis)、熱帶假絲酵母(Candida metapsilosis)、白假絲酵母(Candida albicans)、霍氏假絲酵母(Candida holmii)、粗狀假絲酵母(Candida valida)等；還包括根據通常方法得到的這些微生物的變異株。這些微生物如下所述發揮作用，通過在含有豆渣的培養基中培養，從而從其上清液中可以得到具有高SOD活性的抗氧化劑。其中，使用誕沫假絲酵母(Candida zeylanoides)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)或熱帶假絲酵母 (Candida metapsilosis)能夠得到具有更高的活性氧清除效果的抗氧化劑，因而優選。本發明所涉及的假絲酵母屬(Candida)的微生物都可以從中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中國典型培養物保藏中心(CCTCC)、江南大學工業微生物資源和信息中心(CICIM)等商業渠道購買得到。本發明的抗氧化劑的制造方法通過在含有豆渣的培養基中，培養上述微生物，并從其上清液中得到抗氧化劑。該方法的具體步驟如下所示。<培養基>在本發明中，液體培養基的主要成分是豆渣，其他成分還有糖類和水等，也可以適當添加蛋白胨、酵母粉。由于豆渣是容易獲得的物質，因而，本發明的培養基具有成本低的優點。其中，豆渣是指，將大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后，再經粉碎、過濾除去水而得到的物質；也可以使用食品產業中壓榨豆漿等的豆制品制造后剩下的豆渣。作為糖類，可以單獨使用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等中的任意一種，或者混合使用。從提高發酵生產性和利用性的觀點出發，其中優選葡萄糖。在本發明中，為了提高SOD活性，本發明的培養基優選由豆渣、葡萄糖和水構成， 進一步優選培養基中的豆渣的含量為5 15W/v%、更優選為8 12W/v%，特別優選為 10W/v%。豆渣的含量在該范圍時才能得到高SOD活性。并且，從該觀點出發，葡萄糖的含量優選為0. 2 2w/v%，更優選為0. 8 1. 2w/v%。下面，將上述這種用于制造抗氧化劑的培養基稱為“抗氧化劑制造培養基”。<發酵培養條件>在發酵培養過程中，可以使用上述微生物中的1種或2種以上。在使用2種以上微生物的情況下，可以將微生物順次或同時添加到抗氧化劑制造培養基中使其發酵。作為用于制造抗氧化劑的發酵培養條件，從最優化假絲酵母屬(Candida)微生物的成長所必需的溫度、時間，以及提高SOD活性的觀點出發，優選在20 40°C、更優選在 27 35°C的培養溫度下，培養1 7天，優選培養48 96小時，更優選培養68 76小時。<抗氧化劑的回收、精制>在本發明中，可以通過離心分離等從培養液除去菌體，回收離心后的培養上清液 (以下，有時也稱為“豆渣發酵提取物”)，將其直接作為抗氧化劑利用。另外，也可以通過適當的公知的分離、精制技術，例如，通過超過濾、硫酸銨分級沉淀等進一步精制。本發明中的抗氧化劑(活性氧清除劑)的抗氧化效果，即，活性氧清除效果，由測定SOD活性值來確認。SOD活性值越大，SOD活性越高，提高消除活性氧的能力，從而能夠抑制由皮膚氧化引起的老化等。本發明中的“高SOD活性”是指，根據下述實施例的方法測定計算的SOD活性值為75%以上。在此我們規定，本發明的抗氧化劑(活性氧清除劑)的 SOD活性為75%以上且小于100%時，是中等的高SOD活性，而SOD活性為100 120%時， 是更高的高SOD活性。如下述實施例所示，通過培養本發明的假絲酵母屬(Candida)微生物得到的豆渣發酵提取物具有高SOD活性。通過使用該發酵提取物，可以得到抗氧化、抗老化等優異的活性氧清除效果。因此，通過培養本發明的假絲酵母屬(Candida)微生物得到的豆渣發酵提取物， 可以作為治療目的或非治療目的的抗氧化劑(活性氧清除劑)使用。非治療目的的使用是以美容為目的的使用，或為維持健康狀態的使用等。并且，所述抗氧化劑(活性氧清除劑) 的治療目的的使用和非治療目的的使用是可以完全區分地進行的。另外，通過培養本發明的假絲酵母屬(Candida)微生物得到的豆渣發酵提取物， 還可以用于制造抗氧化劑(活性氧清除劑)。本發明的抗氧化劑(活性氧清除劑)具有極高的活性氧清除效果，同時安全性極高，可以用于預防或改善由生物體內活性氧量的增大所引起的高血壓、動脈硬化、糖尿病及癌癥等疾病、以及成為美容方面障礙的諸多癥狀。本發明的抗氧化劑(活性氧清除劑)還可以制成制劑配合于通常的食品、化妝品或醫藥品中，賦予活性氧清除效果，提高商品價值。另外，作為食品形態，例如，可以采用蛋糕、巧克力、口香糖、糖、飲料等通常的食品形態。作為化妝品形態，例如，可以制成化妝水、乳液、凝膠劑、精華劑、面膜、沖洗劑、沐浴齊U、粉底、口紅、軟膏等適用于皮膚的皮膚外用劑。另外，作為醫藥品形態，例如，可以制成散齊U、顆粒劑、片劑、膠囊劑、懸浮劑、液劑、乳劑、注射液等。這些食品、化妝品和醫藥品中可以根據目的使用對應的任意成分。本發明的抗氧化劑(活性氧清除劑)的配合量，可以根據其使用形態進行適當變化，相對于食品、化妝品、醫藥品等的總量，換算為固形物，優選配合0.01 10w/V%，更優選配合0. 01 lW/v%。當配合量小于0. 01W/v%時難以得到充分的活性氧清除效果；而當配合量大于10W/V%時，其效果反而不會提高因而不經濟。此外，作為添加方法，可以預先添加，也可以在制造工程中添加，可以考慮操作性進行適當選擇。實施例下面，基礎實施例對本發明進行說明，但本發明并不限定于這些實施例。(抗氧化劑(活性氧清除劑)的制造)實施例1 實施例9作為從豆渣制造抗氧化劑(活性氧清除劑)的微生物，使用以下表1所示的假絲酵母屬(Candida)的微生物。表 1

*上述微生物都從江南大學購入，并保藏于中國高校工業微生物資源和信息中心 CICIM0其中標記有CICIM的是保藏編號，沒有標記CICIM的是原始編號。將在YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培養基中 30°C下培養后得到的上述菌株接種到含有抗氧化劑制造培養基IOOml的三角燒瓶(容量300ml)中，在30°C 下培養72小時。該培養基含有10W/v%豆渣和葡萄糖。其中，豆渣的制備通過將大豆放入水中浸泡12小時，使大豆充分吸收水分，然后將吸收了水分的大豆研磨破碎，過濾并除去液體成分后，將剩余殘渣浙干來得到。
然后，對得到的培養液以3000rpm離心分離10分鐘除去菌體，回收培養上清液，將其分別作為試樣1 9。另外，只由培養基(沒有接種微生物)，在與試樣1 9同樣條件下培養、處理，回收上清液作為對照品，用于測定SOD活性。(SOD活性的測定)使用超氧化物歧化酶檢測試劑盒(SOD ASSAY KIT-ffST,同仁化學研究所制)，在96 孔板中測定如上所述得到的試樣1 9和對照品的SOD活性值。使用試劑盒中附帶的試劑。將上述試樣1 9和對照品作為待測樣品，移取20μ 1在96孔板的“樣品”孔和 “空白對照2 ”孔中，在“空白對照1 ”孔和“空白對照3 ”孔中添加20 μ 1無菌水。然后，在各孔中分別添加200μ1 WST工作液，充分混勻。在“空白對照2”孔和“空白對照3”孔中分別添加20μ 1稀釋緩沖液。再在“樣品”孔和“空白對照1”孔中分別加入20μ 1酶工作液，充分混勻。以37°C加熱20分鐘，進行孵育，然后，將孔板放入酶聯免疫斑點自動圖像分析儀Bioreader中，測定450nm處的吸光度。接著，按如下公式計算SOD活性值。將SOD活性值為64. 11 %以上且小于75%記為Δ，表示具有一般SOD活性，將75%以上且小于100%記為〇，表示具有中等的高SOD活性，將100 120%記為◎，表示具有更高的高SOD活性，示于表2和表3。另外，SOD活性值越高，表示抗氧化活性越高。 SOD 活性(％ ) = [ (Abi-Ab3) - (As-Ab2) ] / (Abi-Ab3) X 100As 由“樣品”孔測定的加入待測樣品反應時的吸光度Am 由“空白對照1”孔測定的沒有添加待測樣品反應時的吸光度Ab2 :由“空白對照2”孔測定的待測樣品本身的吸光度Ab3 由“空白對照3”孔測定的孔板本身及稀釋緩沖液的吸光度表 權利要求
1.一種抗氧化劑的制造方法，其中，在含有豆渣的培養基中培養假絲酵母屬(Candida)的微生物，從其上清液中得到抗氧化劑。
2.如權利要求1所述的抗氧化劑的制造方法，其中，所述假絲酵母屬(Candida)的微生物是誕沫假絲酵母(Candida zeylanoides)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)或熱帶假絲酵母(Candida metapsilosis)。
3.如權利要求1所述的抗氧化劑的制造方法，其中， 所述培養基中所述豆渣的含量為5 15W/v%。
4.如權利要求1所述的抗氧化劑的制造方法，其中， 所述培養基中所述豆渣的含量為8 12W/v%。
5.如權利要求1所述的抗氧化劑的制造方法，其中， 所述培養基中所述豆渣的含量為10w/V%。
6.如權利要求1所述的抗氧化劑的制造方法，其中， 所述培養溫度為27 35°C。
7.如權利要求1所述的抗氧化劑的制造方法，其中， 所述培養時間為1 7天。
8.如權利要求1所述的抗氧化劑的制造方法，其中，將通過所述培養獲得的培養液進行離心，從而得到所述上清液作為抗氧化劑。
9.根據權利要求1 8中任意一項所述的抗氧化劑的制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化劑。
10.如權利要求9所述的抗氧化劑，其中， 所述抗氧化劑的SOD活性為75 120%。
11.如權利要求9所述的抗氧化劑，其中，所述抗氧化劑的SOD活性為75%以上且小于100%。
12.如權利要求9所述的抗氧化劑，其中， 所述抗氧化劑的SOD活性為100 120%。
13.豆渣發酵提取物作為抗氧化劑的用途，其中，所述豆渣發酵提取物是在含有豆渣的培養基中培養假絲酵母屬(Candida)的微生物得到的。
14.豆渣發酵提取物在制造抗氧化劑中的用途，其中，所述豆渣發酵提取物是在含有豆渣的培養基中培養假絲酵母屬(Candida)的微生物得到的。
15.如權利要求13或14所述的用途，其中，所述假絲酵母屬(Candida)的微生物是誕沫假絲酵母(Candida zeylanoides)、近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)或熱帶假絲酵母(Candida metapsilosis)。
16.一種食品，其特征在于，配合有如權利要求9 12中任意一項所述的抗氧化劑。
17.一種化妝品，其特征在于，配合有如權利要求9 12中任意一項所述的抗氧化劑。
18. 一種醫藥品，其特征在于，配合有如權利要求9 12中任意一項所述的抗氧化劑。
全文摘要
本發明涉及抗氧化劑的制造方法。本發明提供一種抗氧化劑的制造方法，其中，在含有豆渣的培養基中培養假絲酵母屬(Candida)的微生物，從其上清液中得到抗氧化劑。本發明還提供由上述制造方法得到的具有高SOD活性的抗氧化劑。根據本發明的制造方法，能夠利用特定微生物，以食品加工業等的副產物豆渣作為培養基的主原料，從而低成本且高效地獲得抗氧化劑。
文檔編號A61P17/18GK102533686SQ201010624758
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者孔凡旗 申請人:花王株式會社