用于治療胰腺β細胞功能障礙的組織激肽釋放酶的制作方法

專利名稱：用于治療胰腺β細胞功能障礙的組織激肽釋放酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過調節β細胞治療胰腺β細胞功能障礙以及治療與之相關的胰腺疾病和病癥的方法。
背景技術：
如今，I型糖尿病和II型糖尿病都被非常關注。美國有約MOO萬人患有該疾病 (Mueller, Phys Ther，2008，88 (11) :1250-3)，發生率在全球范圍內在上升。盡管I型糖尿病只能通過胰島素注射治療，但在一些病例中II型糖尿病可通過飲食和運動治療。飲食和運動甚至可以避免II型糖尿病發展；然而，在世界很多地區日益增加的案頭工作的生活方式導致了幾近泛濫的肥胖。對于需要治療的人，以目前可用的藥物進行治療可能很昂貴并且令人不適，并且可能產生一些有害的副作用。存在于胰腺中的β細胞負責產生胰島素并將其釋放至血流中。它們占內分泌細胞的大部分并且形成胰島的核心。胰島β細胞對葡萄糖水平升高的響應是分泌胰島素。胰島素幫助葡萄糖進入肌肉和脂肪細胞(Ellingsgaard et al, PNAS, 2008,105 (35) 13162-7)。在患有I型糖尿病的個體中，β細胞受到自身免疫應答的攻擊。剩余的β細胞不足以產生足夠的胰島素以從血液中除去葡萄糖。他們顯示出β細胞破壞水平提高。對于患有II型糖尿病的個體，肌肉和肝細胞不再能夠對正常的血液胰島素水平做出反應。因此，他們最終也可能出現高血糖水平。與健康個體相比，這可以導致β細胞死亡和β細胞功能喪失。I型糖尿病的長期病例顯示出胰腺中β細胞量缺乏約99%，而II型糖尿病的病例顯示胰腺中β細胞量缺乏約65% (Meier, Diabetologia, 2008, 51 :703-13)。因此，調節健康β細胞水平，特別是增加這種細胞的水平或活性，可能作為有效療法來逆轉并有可能預防糖尿病。已經嘗試通過使用干細胞和器官移植來調節β細胞水平。這些方法看起來有一些缺點(Meier，Diabetologia，2008，51 :703-13)。關于干細胞供給和倫理學的問題可能限制該療法的效能。移植存在任何器官移植均有的風險，例如排異、感染和/或之后的死亡。因此需要能夠刺激β細胞生產從而增加β細胞量的療法。該策略將有效地用于抑制胰高血糖素分泌(Ellingsgaard et al, PNAS, 2008,105 (35) :13162-7)并將胰島素產生和分泌恢復至正常水平，使得進一步抑制胰高血糖素分泌和肝臟葡萄糖產生，導致整個外周血胰島素作用的改善(Meier, Diabetologia, 2008, 51 :703-13)。在本發明人的現有工作之前，沒有人考慮過使用組織激肽釋放酶(KLKl)通過調節β細胞的量來治療胰島β細胞功能障礙和治療與之相關的疾病和病癥。KLKl是絲氨酸蛋白酶，其切割低分子量激肽原導致胰激肽(賴氨酰緩激肽)釋放。可將KLKl配制為產品，其能夠被遞送以調節β細胞量，而無其他提出的療法(使用肝細胞和胰腺器官移植) 存在的問題。

發明內容
本發明包括通過調節β細胞量治療胰島β細胞功能障礙和治療與之相關的疾病和病癥的方法，包括給予治療有效量的KLK1、KLKl的變體或它們的活性片段。在本發明的一個方面，所述KLKl可以是純化的/分離的天然形式、合成形式或重組形式。在本發明的另一個方面，所述分離的KLK2可以是人KLKl (SEQ IDN0. 1)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是阿拉伯狒狒(hamadryas baboon)KLKl(SEQ ID NO. 2)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是食蟹猴(crabeating macaque) KLKl (SEQ ID NO. 3)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是棉冠獠狨(cottontop tamarin) KLKl (SEQ ID N0. 4)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是狗KLKl (SEQ IDN0. 5)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是綿羊KLK1(SEQID NO. 6)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是兔KLKl (SEQ IDN0. 7)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是牛KLKl (SEQ IDN0. 8)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是馬KLKl (SEQ IDN0. 9)。在本發明的另一個方面，所述分離的KLKl可以是豬KLKl (SEQ IDN0. 10)。此外，本發明還提供了治療與胰島β細胞功能下降和/或胰島β細胞量減少相關的疾病的藥物組合物和方法。在一個優選的實施方案中，所述與胰島β細胞功能下降和/或胰島β細胞量減少相關的疾病或病癥是I型或II型糖尿病。在本發明的另一方面，調節β細胞量可以是相對于疾病狀態提高β細胞量。在本發明的另一方面，調節β細胞量可以是β細胞再生。在本發明中，β細胞再生是指通過以下方式恢復正常β細胞功能增加功能β 細胞的數量或通過恢復正常功能修復受損的β細胞。在本發明的又一個方面，調節β細胞量可以是增加β細胞增殖。在本發明的另一個方面，KLKl或其變體或活性片段可通過口服給藥。口服給藥可以是經腸給藥，例如可被吞咽的液體、丸劑或膠囊。在本發明的另一個方面，口服治療劑量可以是每天約1至約1000國際單位(IU) 的最大劑量區間。本發明的另一方面包括一種本文描述的方法，所述方法還包括使用可用于調節β 細胞量或治療與之相關的疾病或病癥的其他治療方法。其他治療方法包括但不限于干細胞移植和胰腺器官移植。
本發明的另一方面包括被配制為用于口服給藥的組合物，其包含約1至約1000IU 的KLKl或其變體或活性片段，任選還包含可藥用賦形劑，任選還包含如上所述的其他治療化合物。
具體實施例方式組織激肽釋放酶是主要因其通過將激肽原切割為賴氨酰緩激肽(胰激肽)控制高血壓的功能而被關注的絲氨酸蛋白酶家族(Yousef et al.，Endocrine Rev. 2001,22 184-204)。盡管有很多已知的人和動物組織激肽釋放酶，但僅一種具有激肽原酶活性， 即釋放激肽的能力。在人中，該酶被稱為KLKl或胰腺/腎激肽釋放酶。本發明人相信， 除了在高血壓調節方面為人所知的作用外，KLKl看起來是遍在或多目標作用酶，因此可能在通過調節β細胞量治療胰島細胞功能障礙和治療與之相關的疾病和病癥方面特異性地發揮重要作用。本文使用的術語“人組織激肽釋放酶”或KLKl與以下術語同義血管舒緩素(callicrein)、舒血管素(glumorin)、padreatin、怕杜丁 (padutin)、胰舒血管 % (kallidinogenase)、緩激月太原 Sl (bradykininogenase)、月夷激月太釋放 (pancreatic kallikrein) >onokrein P>dilminal D>depot-Padutin>(urokallikrein)或尿激肽釋放酶(urinary kallikrein)。具有相似激肽原酶活性的組織激肽釋放酶可見于多種動物，因此可被用于治療胰島細胞功能障礙。本發明的一個優選的實施方案可以是人組織激肽釋放酶前體多肽(腎臟/胰腺/ 唾液腺激肽釋放酶)(KLKl)并且具有以下序列(SEQ IDNO=I)NP_002248GI :4504875 人(Homo sapiens)KLK1_ 人1-18 信號肽19-24 前肽25-262 成熟肽> gi I 4504875 | ref | NP_002248. 11 激肽釋放酶 1 前蛋白原[人]MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHRQffVLTAAHCISD NYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGFNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTEE PEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKAHVQKVTDFMLCVGHLEGGKDTCV⑶SGGPLMCDGV LQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSYVKWIEDTIAENS(SEQ IDNO 1)本發明的另一個實施方案包括阿拉伯狒狒組織激肽釋放酶(腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID N0. 2)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有90%的序列同一性Q2877KLK1_PAPHAMWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHPQWVLTAAHCIGDNYQ LWLGRHNLFDDEDTAQFVHVSESFPHPCF匪SLLKNHTRQADEDYSHDLMLLRLTQPAEITDAVQWELPTQEPEVG STCLASGWGSIEPENFSYPDDLQCVDLKILPNDKCAKAHTQKVTEFMLCAGHLEGGKDTCV⑶SGGPLTCDGVLQGV TSWGYIPCGSPNKPAVFVRVLSYVKWIEDTIAENS(SEQ ID NO. 2)本發明的另一個實施方案包括食蟹猴組織激肽釋放酶(腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID N0. 3)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有90%的序列同一性Q07276-1KLK1_MACFA
MWFLVLCLALSLGGTGRAPPIQSRIVGGWECSQPWQAALYHFSTFQCGGILVHPQWVLTAAHCISDNYQ LWLGRHNLFDDEDTAQFVHVSESFPHPGF匪SLLKNHTRQADDYSHDLMLLRLTQPAEITDAVQVVELPTQEPEVGS TCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLEILPNDECAKAHTQKVTEFMLCAGHLEGGKDTCVGDSGGPLTCDGVLQGVT SWGYIPCGSPNKPAVFVKVLSYVKWIEDTIAENS(SEQ ID NO. 3)本發明的另一個實施方案包括棉冠獠狨組織激肽釋放酶(腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID NO. 4)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有82%的序列同一性Q9N1Q1_SAG0EMWFLVLCLALSLGGTGAVPPIQSRIVGGWDCKQHSQPWQAALYHYSTFQCGGVLVHPQWVLTAAHCISD HYQLWLGRHDLFENEDTAQFVFVSKSFPHPDFNMSLLKNHTRLPGEDYSHDLMLLQLKQPVQITDAVKVVELPTEGI EVGSTCLASGWGSIKPEKFSFPDILQCVDLKILPNDECDKAHAQKVTEFMLCAGPLKDGQDTCV⑶SGGPLTCDGVL QGIISWGYIPCGSPNKPSVFVRVLSYVKWIKDTIADNS(SEQ ID NO. 4)本發明的另一個實施方案包括狗組織激肽釋放酶(腎臟/胰腺/唾液腺激肽釋放酶)(SEQ ID NO. 5)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有74%的序列同一性Q29474_CANFAMWFLVLCLALSLAGTGAAPPVQSRIIGGWDCTKNSQPWQAALYHYSKFQCGGVLVHPEWVVTAAHCIND NYQLWLGRYNLFEHEDTAQFVQVRESFPHPEFNLSLLKNHTRLPEEDYSHDIMLLRLAEPAQITDAVRVLDLPTQEP QVGSTCYASGWGSIEPDKFIYPDDLQCVDLELLSNDICANAHSQKVTEFMLCAGHLEGGKDTCVGDSGGPLICDGVL QGITSWGHVPCGSPNMPAVYTKVISHLEWIKETMTANP(SEQ ID NO. 5)本發明的另一個實施方案包括綿羊組織激肽釋放酶-1 (SEQ ID N0.6)，其與人 KLKl (SEQ ID NO. 1)具有72%的序列同一性A5A2L9_SHEEPMWFPVLCLALSLAGTGAVPPVQSRIVGGQECEKHSQPWQVAIYHFSTFQCGGVLVAPQWVLTAAHCKSE NYQVWLGRHNLFEDEDTAQFAGVSEDFPNPGFNLSLLENHTRQPGEDYSHDLMLLRLQEPVQLTQDVQVLGLPTKEP QLGTTCYASGWGSVKPDEFSYPDLQCVDLTLLPNEKCATAHPQEVTDCMLCAGHLEGGKDTCV⑶SGGPLICEGMLQ GITSWGHIPCGTPNKPSVYTKVIVYLDWINKTMTDNP(SEQ IDN0. 6)本發明的另一個實施方案包括兔組織激肽釋放酶-1 (SEQ ID NO. 7)，其與人 KLKl (SEQ ID NO. 1)具有73%的序列同一性A5A2M0_RABITMWLPVLCLALSLGGTGAAPPLQSRIIGGWVCGKNSQPWQAALYHYSNFQCGGVLVHPQWVLTAAHCFSD NYQLWLGRHNLFEDEAEAQFIQVSGSFPHPRFNLSLLENQTRGPGEDYSHDLMLLKLARPVQLTNAVRVLELPTQEP QVGTSCLASGWGSITPIKFTYPDELQCVDLSILANSECDKAHAQMVTECMLCAGHLEGGRDTCVGDSGGPLVCNNEL QGITSWGHVPCGSPNKPAVFTKVLSYVEWIRNTIANNP(SEQ ID NO. 7)本發明的另一個實施方案包括牛腺激肽釋放酶-1前體(SEQ ID N0.8)，其與人 KLKl (SEQ ID NO. 1)具有72%的序列同一性Q6H320_B0VINMWFPVLCLALSLAGTGAVFPIQSRIGGQECEKHSQPWQVAIYHFSTFQCGGVLVAPQWVLTAAHCKSDN YQVWLGRHNLFEDEDTAQFAGVSEDFPNPGFNLSLLENHTRHPGEDYSHDLMLLRLQEPVQLTQNVQVLGLPTKEPQ LGTTCYASGWGSVKPDEFSYPDDLQCVDLTLLPNEKCATAHPQEVTEWMLCAGHLEGGKDTCV⑶SGGPLICEGMLQ GITSWGHIPCGTPNKPSVYTKVILYLDWINKTMTDNP(SEQ IDN0. 8)
本發明的另一個實施方案包括馬腺激肽釋放酶-1前體(KLKEl) (SEQ ID NO. 9)，其與人KLKl (SEQ ID NO. 1)具有70%的序列同一性Q6H322_H0RSE
\ .)PQW Υ .ΓΛΛHC'KCiDY YQIW1 XiHHhDED \.Λ(；)i FI — VΛKSFI1H1 二、二., .. + NNNRLPGEDYSHDLMLLQVEQPDQITVAVQVLALPTQEPVLGSTCYASGWGSIEPDKFTYPDELRCVDLTLLSND VCDNAHSQNVTEYMLCAGHLEGGKDTCVGDSGGPLICDGVFQGVTSWGHIPCGRPNKPAVYTKLIPHVQWIQDT IAANP(SEQIDNO. 9)本發明的另一個實施方案包括豬腺激肽釋放酶-1前體(SEQ ID NO. 10)，其與人 KLKl (SEQ ID NO. 1)具有67%的序列同一性NP_001001911 GI :50054435 野豬(Sus scrofa)1-17 信號肽18-24 前肽25-263 成熟肽> gi I 50054435 |ref I NP_001001911. 1 激肽釋放酶 1 [野豬] MWSLVMRLALSLAGTGAAPPIQSRIIGGRECEKDSHPWQVAIYHYSSFQCGGVLVDPKWVLTAAHCKND NYQVWLGRHNLFENEVTAQFFGVTADFPHPGFNLSLLKNHTKADGKDYSHDLMLLRLQSPAKITDAVKVLELPTQEP ELGSTCQASGffGSIEPGPDDFEFPDEIQCVELTLLQNTFCADAHPDKVTESMLCAGYLPGGKDTCMGDSGGPLICNG MWQGITSWGHTPCGSANKPSIYTKLIFYLDWINDTITENP(SEQ IDN0. 10)術語“活性片段”是指保持了全長KLKl多肽的活性的較小部分KLKl多肽，例如沒有信號肽區的KLK1，沒有信號肽也沒有前肽區的KLKl和具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的KLKl蛋白片段。起始或參考多肽的“變體”或“突變體”是這樣的多肽即1)具有不同于所述起始或參考多肽的氨基酸序列，并且幻通過天然或人工(手工)誘變衍生自所述起始或參考多肽。這樣的變體包括，例如從目標多肽的氨基酸序列中缺失殘基和/或插入殘基至目標多肽的氨基酸序列中和/或置換目標多肽的氨基酸序列中的殘基。本文中變體氨基酸是指與起始或參考多肽序列(例如源抗體或抗原結合片段的多肽序列)的相應位置的氨基酸不同的氨基酸。可以制造任意組合的缺失、插入和置換來實現最終的變體或突變體構建體，條件是所述最終的構建體具有所需要的功能特點。所述氨基酸變化還可以改變所述多肽的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數目或位置。美國專利No. 5，534，615描述了產生多肽的氨基酸序列變體的方法，其以引用的方式明確地納入本文。參考多肽的變體或突變體與所述參考多肽可以具有例如95、90、85、82、80、75、74、72或60%的同一性，并且與所述參考多肽可以有更大或更小或相同的活性。變體還可以包括加至所述參考多肽以便于純化、增加代謝半衰期或使所述多肽更容易鑒定的序列，例如His標簽或聚乙二醇化序列。“野生型”或“參考”序列或“野生型”或“參考”蛋白質/多肽的序列可以是通過引入突變衍生出所述變體多肽的參考序列。通常，給定蛋白的“野生型”序列是自然界中最常見的序列。類似地，“野生型”基因序列是自然界中最常見的基因的序列。可通過天然方法或通過人工誘導方法將突變引入“野生型”基因(從而引入其編碼的蛋白)。這樣的方法的產物是起始“野生型”蛋白或基因的“變體”或“突變體”形式。對于本文中鑒別的多肽，“氨基酸序列同一性百分比(％ )”被定義為進行以下操作后候選序列中與參考序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比比對所述序列并根據需要引入空位以實現最大序列同一性百分比，且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分。可通過本領域技術人員已知的多種方法來實現以確定氨基酸序列同一性百分比為目的的對比，所述方法例如，使用公眾可得計算機軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以確定用于測量對比的合適參數，包括在被比較序列的全長上實現最大對比所需的任何算法。ALIGN-2程序通過加利福尼亞南圣弗朗西斯科的Genentech公司公開可得。對于本文目的，如下計算給定氨基酸序列A與、和或相對給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％ (其還能夠被表述為，給定氨基酸序列A具有或包含與、和或相對給定氨基酸B的某個氨基酸同一性％)100 倍的分數 X/Y，其中X是在程序對比A和B中被序列對比程序計為相同匹配的氨基酸殘基的數目，Y是B中氨基酸殘基總數。應了解，當氨基酸序列A的氨基酸長度不等于氨基酸序列B 的長度時，A與B的氨基酸序列同一性％將不等于B與A的氨基酸序列同一性％。“核酸序列同一性百分比(％ ) ”被定義為進行以下操作后候選序列中與編碼參考多肽的核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比對比所述序列并根據需要引入空位以實現最大序列同一性百分比。可通過本領域技術人員已知的多種方法來實現以確定核酸序列同一性百分比為目的的對比，所述方法例如，使用公眾可得計算機軟件，例如BLAST、 BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟件。可通過已知方法確定用于測量對比的合適參數，包括在被對較序列的全長上實現最大對比所需的任何算法。對于本文目的，如下計算給定核酸序列C與、和或相對給定核酸序列D的核酸序列同一性％ (其還能夠被表述為，給定核酸序列C具有或包含與和、或相對給定核酸序列D的某個核酸同一性％)100 倍的分數 W/Z，其中W是在程序對比C和D中被序列對比程序計為相同匹配的核苷酸的數目，Z是 D中核苷酸的總數。應了解，當核酸序列C的氨基酸長度不等于核酸序列D的長度時，C與 D的核酸序列同一性％將不等于D與C的核酸序列同一性％。術語“氨基酸”用其廣義含義，是指包括天然存在的La-氨基酸或殘基。對于天然存在的氨基酸，本文使用常用的一個字母或三個字母縮寫(Lehninger，A. L.， Biochemistry, 2d ed. , pp. 71-92, (1975), WorthPub lisher s, New York)。 )^ ^: 括所有D-氨基酸以及化學修飾的氨基酸，例如氨基酸類似物，通常不被納入蛋白質的天然存在氨基酸，例如正亮氨酸，以及具有本領域已知是氨基酸特征的性質的化學合成化合物。例如，氨基酸的定義包括可使肽化合物具有與天然Phe或ftx)同樣構象限制的苯丙氨酸或脯氨酸的類似物或模仿物。這樣的類似物和模仿物在本文中被稱為氨基酸的“功能等同物”。氨基酸的其他實例列于 Roberts and Vellaccio，見于The Peptides =Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, Eds., Vol. 5p 341, Academic Press, Inc, N. Y. 1983，其以引用方式納入本文。
術語“蛋白質”具有比肽長的氨基酸序列。“肽”包含2至約50個氨基酸殘基。術語“多肽”包括蛋白質和肽。蛋白質的實例包括但不限于抗體、酶、凝集素和受體；脂蛋白和脂多肽；以及糖蛋白和糖多肽。“融合蛋白”和“融合多肽”是指具有兩個共價連接在一起的部分的多肽，其中每個部分是具有不同性質的多肽。所述性質可以是生物學特性，例如在體外或在體內的活性。所述性質還可以是簡單的化學或物理特性，例如結合目標抗原，催化反應等。所述兩個部分可通過單個肽鍵或者通過包含一個或多個氨基酸殘基的肽連接物直接連接。通常，所述兩個部分和所述連接物將彼此處于閱讀框中。所述多肽的兩個部分優選獲自異源或不同多肽。術語“治療有效量”是指有效“減輕”或“治療”受試者或哺乳動物的疾病或失調的本發明組合物的量。通常，減輕或治療疾病或失調涉及減少與所述疾病或失調相關的一個或多個癥狀或醫學問題。在一些實施方案中，它是與疾病狀態相比可以增加β細胞量的量。術語“治療”和“進行治療”是指抑制、減輕并治愈疾病、病癥或其癥狀。“進行治療”或“治療”是指治療性治療和預防或防止性措施，其中目標是防止或減緩(減少)所靶病理狀態或病癥。治療可以通過給予治療有效量的至少一種本發明的化合物來進行。用于評估成功治療和改善疾病的參數可通過醫生熟悉的常規方法容易地測量。術語“β細胞再生”或“β細胞量增加”是指增加胰腺中的β細胞量，這由本領域醫生通過成像方法和代謝評估來確定。成像方法包括但不限于正電子發射光譜、MRI和/或單光子發射計算體層攝影。 代謝評估包括但不限于口服葡萄糖耐量試驗、靜脈葡萄糖耐量試驗、靜脈精氨酸刺激試驗和精氨酸誘導胰島素分泌的葡萄糖增強。用于評價β細胞功能的已知數學模型包括但不限于穩態模型評估(HOMA)和持續輸注葡萄糖模型評估(CIGMA)。HOMA使用葡萄糖-胰島素相互作用的結構模型并且根據患者的基礎葡萄糖和胰島素或C-肽濃度來評估β細胞功能和胰島素抗性(Wallace，2004)。CIGMA在大約1_2小時可導致血糖水平類似于餐后水平的連續葡萄糖輸注后評估接近穩態的葡萄糖/胰島素濃度(Hermans，1999)。調節胰島β細胞量的方法本發明提供了用于治療胰島β細胞功能障礙以及與其相關的疾病和病癥的方法。一個實施方案包括通過給予哺乳動物治療有效量的KLKl調節所述哺乳動物中β細胞量來治療胰島細胞功能障礙以及治療與其相關的疾病和病癥的方法。藥物組合物可口服給藥。口服給藥包括溶液、片劑、緩釋膠囊、腸溶衣膠囊和糖漿的腸給藥。“有效量”或“治療有效量”是指無毒但足以提供所需效果的藥物或試劑量。在結合物治療中，所述結合物的一種組分的“有效量”是當與所述結合物的其他組分結合使用時足以提供所需效果的所述化合物的量。“有效”量因受試者而異，取決于個體的年齡和整體情況、一種或多種具體活性劑等。任何個體病例中的合適“有效”量可使用常規實驗進行確定。用于治療上述疾病或其癥狀的本發明化合物的治療有效量可以在所述疾病或癥狀發作之前、同時或之后給予。本發明的化合物可在所述疾病或癥狀發作的同時給予。本文使用的“同時給藥”和“同時給予”包括混合地給予本發明多肽和另一種治療劑，例如，在藥物組合物或溶液中；或者分開給予本發明多肽和另一種治療劑，例如，連續、同時或在不同時間給予分開的藥物組合物或溶液，但給予時間不能間隔太久以致本發明的化合物和另一種治療劑不能相互作用以及不能給予較低劑量的所述活性成分。本發明的另一方面包括一種本文所述的方法，所述方法還包括同時使用可用于治療胰島細胞功能障礙以及治療與其相關的疾病和癥狀的其他治療方法。其他治療方法包括但不限于干細胞移植和胰腺器官移植。“治療”和“進行治療”是指預防、抑制和/或減輕與胰島細胞功能障礙相關的疾病或癥狀以及治愈與影響哺乳動物器官和組織的胰島細胞功能障礙相關的疾病或癥狀。可將治療有效量的本發明的組合物在上述病癥出現之前、期間和之后給予患者。將參考多種具體和優選的實施方案和技術描述本發明。然而，應理解可以在本發明的主旨和范圍之內進行很多改變和修改。
實施例本文使用的方法與 Ellingsgaard 的工作(Ellingsgaard et al，PNAS，2008， 105(35) :13162-7)中的方法類似。實施例1 調節胰島細胞量對20只8周齡的雄性C57BL/6J小鼠喂食58%脂肪熱量的高熱量飲食8周。無限制提供水。所述小鼠在遺傳上易患2型糖尿病，經常被用于糖尿病和肥胖研究。對治療組中的10只小鼠每天肌肉注射Qml/kg)分離的具有SEQ ID NO. 10的序列的豬KLKl，劑量是溶于PBS的0. 375mg/ml，對照組小鼠接受PBS安慰劑注射。在最后14天，使所述小鼠接觸飲用水中的lmg/ml溴脫氧尿苷(BrdU)，其用于檢測β細胞的增殖。處死動物。采集每只動物的胰腺并在多聚甲醛中固定。進行組織學分析。用抗-BrdU對20份胰腺樣本染色，以檢測細胞增殖，并以抗-胰島素對其染色，以檢測β細胞。MM由技術人員手工解釋數據。將染色分級為弱(1)；中等O)；或強(3)。還記錄著色β細胞的百分比。與對照細胞相比，用KLKl處理的細胞顯示出平均較高的β細胞強度 (強度大40% )和β細胞中更大百分比的BrdU(增殖多40% )。因此，KLKl能夠觸發β 干細胞增殖(表1和表2)表1 :PBS對β細胞強度和BrdU染色的效應
權利要求
1.一種治療胰島β細胞功能障礙的方法，包括給予治療有效量的純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段。
2.權利要求1的方法，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段是純化且分離的天然KLKl。
3.權利要求1的方法，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段通過重組產生。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl包含SEQID NO. 1的氨基酸序列。
5.權利要求1-3任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10。
6.權利要求1-3任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQID NO. 1具有90%序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
7.權利要求1-3任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQID NO. 1具有82%序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
8.權利要求1-3任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQID NO. 1具有74%序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
9.權利要求1-3任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQID NO. 1具有72%序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
10.權利要求1-3任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQID NO. 1 具有60%序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
11.權利要求3的方法，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段包含聚乙二醇化序列。
12.權利要求1-11任一項的方法，其中所述胰島β細胞功能障礙包括異常β細胞量。
13.權利要求1-12任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段經口服給予。
14.權利要求1-13任一項的方法，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段與另一種用于治療胰島細胞功能障礙的治療方法同時給予。
15.權利要求14的方法，其中所述另一種治療方法選自干細胞移植和胰腺器官移植。
16.權利要求1-15任一項的方法，其中所述治療調節β細胞量。
17.權利要求16的方法，其中所述調節β細胞量選自增加β細胞量、β細胞再生、 通過增加功能性β細胞的數目恢復正常β細胞功能、增加β細胞增殖以及恢復或改善受損β細胞功能。
18.純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段用于治療胰島β細胞功能障礙的用途。
19.純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段用于制備用于治療胰島β細胞功能障礙的藥物的用途。
20.純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段用于制備用于治療胰島β細胞功能障礙的藥物的用途。
21.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段是純化且分離的天然KLKl。
22.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段通過重組產生。
23.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。
24.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl包含選自以下的氨基酸序列 SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10。
25.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQIDNO. 1具有90% 序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
26.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQIDNO. 1具有82% 序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
27.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQIDNO. 1具有74% 序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
28.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQIDNO. 1具有72% 序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
29.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl包含與SEQIDNO. 1具有60% 序列同一性并且具有能夠將低分子量激肽原切割為胰激肽的絲氨酸蛋白酶活性的多肽。
30.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段包含聚乙二醇化序列。
31.權利要求20的用途，其中所述胰島β細胞功能障礙包括異常β細胞量。
32.權利要求20的用途，其中所述純化的或分離的KLKl或者其變體或活性片段經口服給予。
全文摘要
本發明涉及治療胰島β細胞功能障礙和與胰島β細胞功能障礙有關的病癥的方法，包括給予治療有效量的組織激肽釋放酶、其變體或活性片段。
文檔編號A61P1/18GK102438648SQ201080018182
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者K·理查德森, M·威廉姆斯 申請人:代阿麥迪卡股份有限公司