三氧化二砷及其水溶物在制備治療胰腺癌藥物中的用途
【專利摘要】本發明屬藥物制藥領域，具體涉及三氧化二砷及其水溶物亞砷酸作為SHH信號通路抑制劑在制備治療癌胰腺癌藥物的用途。本發明通過動物實驗，將三氧化二砷以及聯合給藥干預荷人胰腺癌細胞株移植瘤裸鼠后，結果顯示,三氧化二砷對胰腺癌移植瘤的產生具有顯著的生長抑制作用，能下調胰腺癌細胞株移植瘤SHH末端成員GLI1蛋白及其靶基因的表達，下調腫瘤干細胞相關指標ALDH、CD24、CD44的表達，表明三氧化二砷在動物體內發揮SHH信號通路抑制劑的作用，并使GLI蛋白喪失活性，所述的三氧化二砷及其水溶物可作為SHH信號通路抑制劑用于制備治療胰腺癌的藥物。
【專利說明】三氧化二砷及其水溶物在制備治療胰腺癌藥物中的用途
【技術領域】
[0001]本發明屬藥物制藥領域，涉及SHH信號通路抑制劑，具體涉及三氧化二砷(化學分子式:As203)及其水溶物亞砷酸(化學分子式H3As03)作為SHH信號通路抑制劑在制備治療癌胰腺癌藥物的用途。
【背景技術】
[0002]研究顯示，尤其在對血液腫瘤，腦瘤和乳腺癌的研究中均已證實腫瘤干細胞的存在，還有研究發現了一個在腫瘤發生和發展中發揮主要任務的細胞亞群，其特征是特有性的表達0)44,0)24和ESA(epithelial_specific antigen,上皮細胞特有抗原),研究顯示，在胰腺癌細胞中存在有約0.2 - 0.8%的細胞表達⑶44+⑶24+ESA+，與其它胰腺癌細胞相比其成癌特性高100倍，CD44+CD24+ESA+胰腺癌細胞可以自我復制，能夠分化子代細胞，表現干細胞特性，被認為是胰腺癌干細胞。高表達Sonic Hedgehog(簡稱SHH，中文常譯作“音猬因子”)信號是胰腺癌干細胞的重要特征。SHH信號通路可以通過調控正常干細胞的自我復制以及祖細胞的增殖或分化以維持組織的穩定。Chenwei Li等人報道⑶44+⑶24+ESA+胰腺癌干細胞對SHH mRNA的表達比正常胰腺細胞約增高46倍，比⑶44-⑶24-ESA-的胰腺癌細胞或胰腺癌瘤體細胞約增高4倍，提示在胰腺癌干細胞的自我復制和胰腺癌成瘤過程均有SHH信號通路的參與，SHH信號在胰腺癌干細胞的自我復制及腫瘤微環境的形成過程發揮重要作用。
[0003]有研究證實，三氧化二砷(化學分子式:As203)所含的砷元素可以直接與癌蛋白PML端的“鋅指”結構之半胱氨酸結合，誘導蛋白質發生構象變化和多聚化，繼而發生Sumo化、泛素化修飾而被蛋白酶體降解，這是三氧化二砷治療急性幼粒白血病的主要機制。SHH信號通路的末端成員GLI具有與PML蛋白相似鋅指結構，三氧化二砷也可以與GLI蛋白結合，導致GLI蛋白喪失轉導活性，阻斷SHH信號，抑制其靶基因的表達，也可以成為一種SHH信號通路抑制劑。
【發明內容】
[0004]本發明目的為提供一種SHH信號通路抑制劑在制藥中的新用途，具體涉及三氧化二砷及其水溶物作為SHH信號通路抑制劑在制備治療胰腺癌藥物中的用途。
[0005]本發明通過動物實驗，將三氧化二砷作為SHH信號通路抑制劑給藥荷人胰腺癌細胞株移植瘤裸鼠5mg/Kg,隔日一次，在此基礎上，再給予小劑量吉西他濱，15mg/Kg,每周一次，聯合給藥干預后，測量腫瘤體積，結果顯示，作為SHH信號通路抑制劑的三氧化二砷對胰腺癌移植瘤的產生具有顯著的生長抑制作用，抑瘤率為60.9%(P=0.004);同時，作為SHH信號通路抑制劑使用的三氧化二砷與吉西他濱聯用，未見增加動物的不良反應，裸鼠體重未顯示顯著的減低；對 動物移植瘤樣進行免疫組織化學和Western blot分析，結果顯示三氧化二砷可以下調胰腺癌細胞株移植瘤SHH末端成員GLI 1蛋白及其靶基因的表達，下調腫瘤干細胞相關指標ALDH、CD24、⑶44的表達，表明三氧化二砷在動物體內發揮SHH信號通路抑制劑的作用。
[0006]本發明采用激光共聚焦和腺病毒轉染過表達技術，觀察含砷染料與GLI1蛋白的結合，并且這一結合過程可以被三氧化二砷弱化，先示三氧化二砷可以通過所含的砷元素與GLI結合，導致GLI蛋白喪失活性，符合抑制SHH信號轉導活性的基本機制。
[0007]本發明所述的三氧化二砷及其水溶物可作為SHH信號通路抑制劑用于制備治療胰腺癌的藥物。
[0008]說明書附圖
[0009]圖1是本發明各實驗組裸鼠移植瘤生長曲線圖。
[0010]圖2是本發明各實驗組裸鼠體重變化曲線圖。
[0011]圖3是本發明各實驗組瘤樣免疫組織化分析代表圖。
[0012]圖4是本發明各實驗組瘤樣Western Blot分析代表圖。
[0013]圖5是本發明實驗中綠色熒光標記GLI1蛋白與As203相互作用激光共聚焦觀察圖。
[0014]圖6是本發明實驗中GFP-GLI1腺病毒表達載體轉染的SW1990細胞采用三氧化二砷培養后，再采用ReAsH處理的觀察圖。
【具體實施方式】
[0015]本發明實驗采用的試劑和原料:
[0016]RPMI 1640培養基(RPMI 1640+10 %胎牛血清)；CCK_8 (同仁化學公司產品)；ReAsH-EDT2熒光染料(Invitrogen公司產品)。
[0017]實施例1細胞活性實驗
[0018]人胰腺癌SW1990，PANC-1細胞培養于1640+10%FBS培養液，5%C0, 37°C常規培養。96孔培養板，每孔植入5000個細胞，預培養24小時后，采用上述含有在0-50 μ M, As203濃度范圍的1640+10%FBS培養液常規培養24，48，72小時后，加入CCK-8試劑，繼續孵育2小時酶標儀450nm波長檢測每孔吸光度值(0D)，按以下公式計算腫瘤細胞生長抑制率和細胞活力。
[0019]腫瘤細胞生長抑制率=(0D空自-0D實驗)/0D空自X100%
[0020]細胞活力=0D實驗/0D空自X 100%
[0021]結果顯示，As203能夠有效抑制SW1990，PANC-1兩種人胰腺癌細胞株的增殖，并且與培養時間密切關聯，24小時的IC50值分別為27.3uM、41.5uM.48小時的IC50值分別為
15.luM、21.4uM，72小時的IC50值分別為7.2uM, 13.4uM，隨著藥物作用時間的延長，抑制細胞增殖的效應增強(如圖1所示)。
[0022]實施例2動物實驗
[0023]5周齡雌性無胸腺裸鼠(購自中國科學研究院)，SPF環境飼養，先取5只裸鼠，右側肩胛皮下注入SW1990細胞1X107/只，3周后，腫瘤生長至~500mm3，常規處理裸鼠，取瘤塊，選取生長旺盛的兩個瘤塊，剪成ImmX ImmX 1mm方形碎塊，植入另外32只裸鼠.當裸鼠荷瘤生長至~200mm3大小時(2周)，隨機分為4組，每組8只，具體分組與用藥:(1)對照組:腹腔注射與聯合用藥組等體積生理鹽水；(2)吉西他濱組:腹腔注射鹽酸吉西他濱，15mg/kg,每周一次(3)三氧化二砷組:腹腔注射三氧化二砷,5mg/Kg,隔日一次，(4)聯合用藥組:腹腔注射鹽酸吉西他濱，15mg/kg,每周一次，加腹腔注射三氧化二砷,5mg/Kg,隔
曰一次。
[0024]每三天按下述公式測量腫瘤體積:
[0025]腫瘤體積計算公式:V=(LXW2) X0.5
[0026]式中，L為瘤長徑，W為瘤短徑。
[0027]裸鼠治療三周后，在第22天全部按常規處理，取出瘤塊，拍照，留存腫瘤組織進行免疫組織化學和Western Blot蛋白分析。
[0028]根據第21天的腫瘤體積測量結果，與對照組相比較，吉西他濱組、三氧化二砷組、聯合用藥組對腫瘤生長的抑制率分別為23.6% (P=0.189)、22.8% (P=0.205)，和60.9%(P=0.004)，腫瘤生長曲線如圖2所示；其中聯合用藥組與吉西他濱組比較，裸鼠體重沒有明顯的減低，提示加用三氧化二砷并沒有顯著增加吉西他濱組裸鼠的不良反應，體重變化曲線如圖3所示。
[0029]取上述瘤樣進行免疫組化分析，結果顯示，與對照組相比，吉西他濱、三氧化二砷組和聯合用藥組均可對CD24、CD44和ALDH1A1的不同染色，但吉西他濱組差別最輕，聯合用藥組差別最重；此外，ALDH1A1是干細胞指標ALDH的主要成員，各組瘤樣對此蛋白的表達差別最為明顯，其中，三氧化二砷組和聯合用藥組均有下調ALDH1A1表達的趨勢(如圖4所示)，表明三氧化二砷治療能降低瘤組織中胰腺癌干細胞的比率；
[0030]取上述瘤樣進行 Western Blot分析，結果顯示,三氧化二砷組和聯合用藥組SHH信號通路末端成員GLI1蛋白的表達均有下調，同時GLI1蛋白的靶基因，PATCHED, WNT1的表達被明顯降低(如圖5所示)，驗證了三氧化二砷具有導致GLI蛋白活性喪失，阻斷SHH信號通路的效應。
[0031]實施例3激光共聚焦實驗
[0032]為了進一步證實三氧化二砷與SHH信號通路GLI蛋白的相互作用，本發明采用綠色熒光蛋白(GFP)與GLI和腺病毒載體重組(委托上海生博醫學生物科技有限公司)，形成GFP-GLI1腺病毒表達載體，轉染SW1990人胰腺癌細胞，同時采用沒有GLI1蛋白結合的GPF腺病毒表達載體轉染SW1990細胞作為陰性對照，轉染24小時后，選其中一組更換含有2.5 μ Μ三氧化二砷，其余更換為新鮮的培養基，繼續培養24小時后，采用含有2.5 μ ΜReAsH-EDT2 (簡稱:ReAsH)的 Opt1-MEM(Invitrogen)培養基 37。C 條件下轉染 30 分鐘后，按ReAsH-EDT2使用指南，采用250 μ M BAL緩沖溶液沖洗干凈，激光共聚焦觀察；
[0033]結果顯示，被GFP-GLI1腺病毒表達載體和GFP腺病毒表達載體轉染后的SW1990細胞內均可以見到綠色熒光，但GFP-GLI1腺病毒表達載體轉染的細胞內同時可以觀察到ReAsH的發出的紅色熒光，綠色熒光與紅色熒光位置相同，重疊后變為黃色；而GFP腺病毒表達載體轉染的細胞內不能觀察到紅色熒光；同時，GFP-GLI1腺病毒表達載體轉染的SW1990細胞采用三氧化二砷培養后，再采用ReAsH處理，紅色熒光有被減低的現象(如圖6所示)，表明三氧化二砷在SW1990細胞內與GFP-GLI1蛋白發生結合，削弱了含有砷的熒光染料ReAsH與GLI 1的結合，進一步證實三氧化二砷可以通過與GLI蛋白結合，發揮作為SHH通路抑制劑的功效，進一步用于制備治療胰腺癌的藥物。
【權利要求】
1.三氧化二砷及其水溶物亞砷酸在制備治療胰腺癌藥物中的用途。
2.按權利要求1的用途，其特征在于，所述的三氧化二砷及其水溶物亞砷酸作為SHH信號通路抑制劑。
3.按權利要求1的用途，其特征在于，所述的三氧化二砷及其水溶物亞砷酸抑制SW1990, PANC-1人胰腺癌細胞株的增殖。
4.按權利要求1的用途，其特征在于，所述的三氧化二砷及其水溶物亞砷酸抑制胰腺癌腫瘤生長。
5.按權利要求1的用途，其特征在于，所述的三氧化二砷及其水溶物亞砷酸降低瘤組織中胰腺癌干細胞的比率。
6.按權利要求1的用途， 其特征在于，所述的三氧化二砷及其水溶物亞砷酸使GLI蛋白活性喪失，阻斷SHH信號通路。
7.按權利要求1的用途，其特征在于，所述的三氧化二砷及其水溶物亞砷酸與吉西他濱聯合用藥。
【文檔編號】A61K31/7068GK103655613SQ201310050897
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年2月8日 優先權日:2013年2月8日
【發明者】韓盡斌, 劉魯明 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫院