一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑的制備方法

專利名稱：一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體是一種依托泊苷的新劑型依托泊苷納米混懸液凍 干制劑的制備方法。
背景技術：
依托泊苷，中文別名為鬼臼乙叉甙，足葉乙甙，表鬼臼毒吡喃葡萄糖；英文名為 Etoposide，Etopl，Vepeside，常縮寫為 VP-16，VP16-213，EPEG ；是鬼臼脂(Podophyllin)中 分離出的木脂體類有效成份。VP-16是細胞周期特異性抗腫瘤藥物，在體內激活某些內切 酶，或通過其代謝物作用于DNA，其非糖苷同系物4-去甲基表鬼臼毒素則可抑制微管制組 裝。本品主要對小細胞肺癌，有效率達40%增至85%，完全緩解率為14% 34%。對急性 白血病、惡性淋巴瘤、睪丸腫瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、絨毛膜上皮癌、卵巢癌、惡性葡萄 胎等也有效。依托泊苷臨床上常用的劑型為注射液和軟膠囊。其注射液為以聚乙二醇400與無 水乙醇為混合溶劑的滅菌溶液，還含有吐溫-80、苯甲醛等輔料。因為在注射時本品具有較 強的刺激性而產生疼痛，故處方中還添有苯甲醇，從而導致本品不能用于兒童肌內注射。口 服制劑一般應用于非急癥患者，其絕對生物利用度低，只有50%，血中濃度僅為靜脈注射的 52士8%，且不同患者之間口服生物利用度差異較大(25% -74% )，其主要原因為依托泊苷 的水溶性差及其在酸性及堿性介質中性質不穩定，降解為無活性產物，在PHI. 3和10的溶 液中，依托泊苷迅速降解，影響療效。依托泊苷在臨床應用中的主要毒性為骨髓抑制反應和 胃腸道反應，且均為劑量限制性毒性。依托泊苷在實際臨床應用中存在如此多的缺陷，因此 研發一種新劑型來提高依托泊苷溶液的穩定性及療效，降低其毒副作用是迫切需要的。申請號為200610169149. 8的中國專利描述了一種含有依托泊苷的脂質微球注射 液及其制備方法，其本質為水包油脂肪乳劑，應用了界面膜載藥的原理，提高了依托泊苷的 載藥量，即使如此，其載藥量最高也只能達到0. 5 %，這導致其他輔料的量遠遠大于主藥的 量，并且應用了一定量的吐溫-80、司盤-80等表面活性劑，已有大量的文獻報道，吐溫、司 盤類表面活性劑溶血性強、致敏反應嚴重、能夠萃取出塑料注射器/輸液器中的毒性物質， 這必會對臨床應用造成潛在性的毒副作用。

發明內容
本發明的目的是為克服上述現有技術的不足，提供一種依托泊苷的納米混懸液凍干制劑的制備方法。本發明采用高壓乳勻技術制備依托泊苷納米混懸液，粒徑小于200nm， 過濾滅菌，冷凍干燥法制備固體粉末。能避免現有依托泊苷注射液中所使用的大量助溶劑 和表面活性劑，從而降低毒副反應的發生率，提高其制劑穩定性。本發明操作簡單、條件溫 和、可控性強，適合工業化生產；制備的依托泊苷納米混懸液凍干制劑具有安全性高、穩定 性好、毒副作用低等優點。為實現上述目的，本發明采用下述技術方案
(1)將依托泊苷溶解在有機溶劑中，形成溶液A ；(2)將穩定劑溶解在水溶液中，形成溶液B ；(3)將溶液B分散在溶液A中，高速剪切1 3分鐘，形成初乳C ；(4)將初乳C在高壓和高切變力或氣穴作用的條件下形成一種穩定的乳劑；(5)溶劑在減壓條件下蒸發產生一種由蛋白質包被藥理活性物質組成的膠體系 統，過濾滅菌；(6)冷凍干燥去除水分，制備依托泊苷納米混懸液凍干制劑。所述穩定劑選自白蛋白、泊洛沙姆、吐溫-80、聚乙烯吡洛烷酮、羥丙基甲基纖維 素、甲基纖維素、泰洛沙姆、磷脂酰膽堿或卵磷脂、膽酸鈉、牛黃膽酸鈉或聚乙二醇中的一種 或多種。優選白蛋白，其中白蛋白選自人血清白蛋白、通過基因工程方法得到的重組白蛋白 或動物血清白蛋白，白蛋白與依托泊苷的重量比為5 1 20 1。所述步驟(1)中的有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、四氫呋喃、二氧 雜環乙烷、丁醇、乙酸丁酯、乙腈、丙酮、二甲亞砜、二甲酰胺或甲基吡咯烷酮中的一種或多 種。所述步驟O)中的水溶液選雙蒸水、0.9%氯化鈉水溶液、5%葡萄糖水溶液、含 5%葡萄糖和0. 9%氯化鈉的注射用水、含5%葡萄糖的林格氏注射液或磷酸鹽緩沖液的任一種。所述步驟(6)中白蛋白本身即作為冷凍保護劑，不再添加其他任何凍干保護輔 料。對于一般的冷凍干燥過程，為保證制品的成型和復溶，需加入一定的冷凍保護劑 如甘露醇、蔗糖、乳糖等，本發明中所采用的白蛋白本身就可以作為一種冷凍保護劑，而避 免加入其他的輔料。根據本發明的上述制備過程可以看出，最終得到成品中只含有藥理活 性物質和白蛋白，而不含有其他任何輔料；其中在第一步中所使用的溶劑如氯仿、二氯甲烷 等在后面的制備過程(減壓旋蒸和冷凍干燥)中得到了有效地蒸發，基本無殘留，這大大保 證了制劑的安全性，避免毒副作用。差示掃描量熱法(DSC)記錄曲線顯示，在依托泊苷的DSC曲線中出現1個明顯的 吸熱峰，即依托泊苷的熔點特征峰260°C ；白蛋白的DSC曲線中，在65. 2220. 0°C處有2 個明顯的吸熱峰；在納米混懸劑凍干粉末的DSC曲線中，藥物的特征峰消失，并且與物理混 合物DSC曲線明顯不同，表明依托泊苷在納米混懸劑中并不是以結晶形態存在，而是以非 結晶形態存在。體外釋放曲線說明，依托泊苷在納米混懸劑以藥物儲庫的形式不斷地緩慢 釋放藥物，具有一定的緩釋作用。初步動物實驗-在給藥期及恢復期本品對家兔注射部位即血管均無刺激性；受試 樣品經體外溶血試驗無溶血和凝聚反應發生，可靜脈注射使用；骨髓抑制試驗表明，與注 射液相比，白蛋白納米混懸液能明顯降低主藥對小鼠的骨髓抑制，主要表現在白細胞、紅細 胞、血紅蛋白、血小板均下降幅度減小，這表明該制劑應用于臨床后，會有效降低毒副作用 的發生。藥物經白蛋白包裹后，其體內的藥物動力學數據發生了改變，注射白蛋白納米混懸 劑后的平均滯留時間(MRT)和生物半衰期(t1/2e)都有所增加；同時，納米混懸劑靜脈注射 進入小鼠體內后，可作為外來異物被單核吞噬細胞(MPS)系統吞噬，提高依托泊苷在肝、脾 特別是肺部的濃度，有望大大提高其治療肺癌的效能。


圖1.依托泊苷白蛋白納米混懸劑透射電鏡照片(A:凍干前，B 凍干后)；圖2.依托泊苷白蛋白納米混懸液粒徑分布圖(A :凍干前；B :凍干后)；圖3.依托泊苷白蛋白納米混懸劑DSC分析結果(a 依托泊苷b 牛血清白蛋白c 依托泊苷白蛋白納米混懸劑凍干粉末d 依托泊 苷、白蛋白的混合物)；圖4.依托泊苷溶液及納米混懸液的體外釋放曲線(n = 3)；圖5.耳緣靜脈注射依托泊苷注射劑和納米混懸劑在新西蘭兔體內的藥物動力學 曲線；圖6.小鼠尾靜脈注射依托泊苷注射劑(▲)和納米混懸劑(Δ )在小鼠體內組 織分布圖(Α:肝;B 肺；C:脾)
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明，但不限于這些具體記載的實施例。實施例1 將IOmg依托泊苷溶于1. Oml 二氯甲烷，加入到5ml濃度為2% (W/V)的人血清白 蛋白水溶液中，該混合物高速剪切(9000rpm);3min，形成初乳，然后將其轉移至超聲處理池 內，超聲(600W)5min，將得到的混懸液在40°C減壓條件下蒸發15 20min除去二氯甲烷， 即得依托泊苷納米混懸劑，其粒徑范圍在150 300nm。以上制備的混懸液分裝于西林瓶中，置低溫冰箱(_80°C )預凍Mh，然后轉入冷凍 干燥機中冷凍(_40°C、0. 5mbar)48h,即得依托泊苷納米混懸液凍干制劑。實施例2 將90mg依托泊苷溶于3. Oml氯仿，加入到30ml濃度為1 % (W/V)的人血清白蛋 白水溶液中溶液中，該混合物高速剪切(12000rpm)5min，然后將其轉移至高壓乳勻機中， 1500bar循環20次，將得到的混懸液在40°C減壓條件下蒸發15 20min除去氯仿，得到的 混懸劑為半透明狀，顆粒直徑為160 220nm。以上制備的混懸液分裝于西林瓶中，置低溫冰箱(_80°C )預凍Mh，然后轉入冷凍 干燥機中冷凍(_40°C、0. 5mbar)48h,即得依托泊苷納米混懸液凍干制劑。實施例3 將200mg依托泊苷溶于3. Oml氯仿和0. 4ml無水乙醇的混合溶液中，加入到IOOml 濃度為3% (W/V)的牛血清白蛋白水溶液中，剪切(9000rpm)aiiin，迅速轉移至高壓乳勻機 中，1300bar循環15次，將得到的混懸液在35°C減壓條件下迅速將有機溶劑除去，得到依托 泊苷白蛋白納米混懸劑，其粒徑范圍為300 450nm。以上制備的混懸液分裝于西林瓶中，置低溫冰箱(_80°C )預凍Mh，然后轉入冷凍 干燥機中冷凍(_40°C、0. 5mbar)48h,即得依托泊苷納米混懸液凍干制劑。加入生理鹽水后， 能夠迅速復原為凍干前的狀態，且顆粒的粒徑無變化。
實施例4 將135mg依托泊苷溶于4. Oml氯仿和0. 5ml無水乙醇的混合溶液中；配置BSA (3 % W/V)溶液，用質量分數為10 %的檸檬酸溶液將其PH值調為5. 4 ；將45ml上述BSA溶液與 依托泊苷的氯仿/乙醇溶液在低速剪切的條件下進行混合，然后將其迅速轉移至高壓乳勻 機中處理直至得到納米乳劑，旋轉蒸發除去溶劑。以上制備的混懸液分裝于西林瓶中，置低溫冰箱(_80°C )預凍Mh，然后轉入冷凍 干燥機中冷凍(_40°C、0. 5mbar)48h,即得依托泊苷納米混懸液凍干制劑。實施例5 配置BSA(3% W/V)溶液，用質量分數為10%的檸檬酸溶液將其pH值調為5. 7 ；將 70ml上述溶液與2. Oml溶有140mg依托泊苷的氯仿溶液在低速剪切(6000rpm)的條件下進 行混合，然后將其迅速轉移至高壓乳勻機中處理直至得到納米乳劑，旋轉蒸發除去溶劑。以上制備的混懸液分裝于西林瓶中，置低溫冰箱(_80°C )預凍Mh，然后轉入冷凍 干燥機中冷凍(_40°C、0. 5mbar)48h,即得依托泊苷納米混懸液凍干制劑。實施例6 配置BSA O % W/V)溶液80ml，用鹽酸溶液將其pH值調為5. 9 ；將200mg依托泊苷 溶于2. 5ml氯仿和0. 2ml無水乙醇的混合溶液中；將上述兩種溶液在低速剪切(6000rpm) 的條件下進行混合，然后將其迅速轉移至高壓乳勻機中處理直至得到納米乳劑，旋轉蒸發 除去溶劑。以上制備的混懸液分裝于西林瓶中，置低溫冰箱(_80°C )預凍Mh，然后轉入冷凍 干燥機中冷凍(_40°C、0. 5mbar)48h,即得依托泊苷納米混懸液凍干制劑。實施例7 將IOmg依托泊苷溶于1. Oml乙酸乙酯，加入到5ml濃度為5% (W/V)泊洛沙姆的 5%葡萄糖水溶液中，該混合物高速剪切(9000rpm) 3min,形成初乳，然后將其轉移至超聲處 理池內，超聲(600W)5min，將得到的混懸液在40°C減壓條件下蒸發15 20min除去乙酸乙 酯，即得依托泊苷納米混懸劑。以上制備的混懸液加入西林瓶中，置冰箱中-80°C預凍Mh，然后放入冷凍干燥機 中-40°C、0. 5mbar 48h，即得依托泊苷納米混懸液凍干制劑。實施例8:將IOmg依托泊苷溶于1. Oml 二甲酰胺，加入到5ml濃度為3% (W/V)的牛黃膽酸 鈉生理鹽水溶液中，該混合物9000rpm高速剪切(9000rpm) 3min,形成初乳，然后將其轉移 至超聲處理池內，超聲(600W) 5min,將得到的混懸液在40°C減壓條件下蒸發15 20min除 去二甲酰胺，即得依托泊苷納米混懸劑。以上制備的混懸液分裝于西林瓶中，置低溫冰箱(_80°C )預凍Mh，然后轉入冷凍 干燥機中冷凍(_40°C、0. 5mbar)48h,即得依托泊苷納米混懸液凍干制劑。試驗例1 依托泊苷白蛋白納米混懸液載藥量的測定精密量取實施例4所制得的1.0ml依托泊苷白蛋白納米混懸液，離心 (15000rpm)20min，取上清液0. 5ml，用流動相稀釋一定倍數，進樣20 μ 1，進行色譜分析，測 定峰面積，計算載藥量(DL%)。DL%= (Wtotal-Wfree)/WnX 100%
Wtotal為總藥量，Wfree為游離藥物量，Wn*納米粒子的總重量，約為納米混懸液中所 含固體的總重量。所制備的依托泊苷白蛋白納米混懸液載藥量為8. 65±0. 42。在臨床使用中，如果 制劑載藥量過低，則面臨所需輔料量大、臨床注射體積大的弊端。本發明通過合理的處方篩 選(主要是藥物與白蛋白的比例)，使載藥量達到8 9%，滿足了我們的要求。試驗例2 將實施例4所制得的依托泊苷納米混懸液，采用透射電鏡法觀察納米混 懸劑的物理形態，具體方法將凍干前后的納米混懸劑稀釋至一定倍數，滴至電鏡專用銅網 上，靜置lmin，用濾紙吸干混懸液，再滴加質量濃度為2 %磷鎢酸負染20s，自然干燥后，放 入透射電鏡下觀察納米粒的形態并拍照。結果如圖1所示，依托泊苷白蛋白納米混懸液凍干前后外觀均為帶有乳光的溶 液，透射電鏡照片可見兩種納米粒均呈球形結構，大小均勻。試驗例3 分別取凍干前后的依托泊苷白蛋白納米混懸液適量，用生理鹽水稀釋 后，ZETASIZER3000激光粒度分析儀測定，記錄平均粒徑、zeta電位。結果如圖2所示，依托泊苷白蛋白納米混懸液凍干前的平均粒徑 為(190. 2 ± 7. 3nm)，Zeta電位為(-23. 05 ± 1. 78mV)；凍干后的平均粒徑為為 (182. 3士8. 91nm)，Zeta電位為(-22. 18. ±0. 89)mV。由上述結果可以看出，凍干前后，依托 泊苷白蛋白納米混懸液的粒徑及^ta電位均沒有顯著性變化。試驗例4 微球物相分析(DSC)驗證微球的形成使用CDR-4P差動熱分析儀，以氧化鋁(A1203)為參比，升溫速率10°C /min ；在 25 500°C的范圍內進行測定。分別進樣樣品A 依托泊苷、樣品B 牛血清白蛋白、樣品 C 依托泊苷白蛋白納米混懸劑凍干粉末、樣品D 依托泊苷、白蛋白的混合物結果如圖3所示，由圖可以看出，在依托泊苷的DSC曲線中出現1個明顯的吸熱 峰，即依托泊苷的熔點特征峰260°C ；白蛋白的DSC曲線中，在65. 2220. 0°C處有2個明 顯的吸熱峰；在納米混懸劑凍干粉末的DSC曲線中，藥物的特征峰消失，并且與物理混合物 DSC曲線明顯不同，表明依托泊苷在納米混懸劑中并不是以結晶形態存在，而是以非結晶形 態存在。試驗例5 體外釋放試驗取實施例4所制得的三批依托泊苷納米混懸液，采用動態膜透析法進行體外釋藥 試驗。以5mg/ml依托泊苷溶液為對照，精密吸取2ml依托泊苷白蛋白納米混懸液(5mg/ml)， 裝入經蒸餾水浸泡處理過的透析袋內，將袋口扎緊。加入等體積由pH74的PBS和乙醇組成 的釋放介質(體積比為9 1)，在37°C水浴恒溫振蕩器上振蕩(1OOrpm)。在預設時間點 (0. 083h、0. 17h、0. 5h、0. 75h、lh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、20h、24h、36h)取樣，低溫高速 離心(15000rpm，4°C )15min，量取上清液100 μ 1，液相色譜條件測定釋放介質中依托泊苷 的含量，計算累積釋放百分率⑴)，繪制依托泊苷白蛋白納米混懸劑的體外累積釋藥曲線。 累積釋放百分率計算公式如下
權利要求
1.一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將依托泊苷溶解在有機溶劑中，形成溶液A；(2)將穩定劑溶解在水溶液中，形成溶液B；(3)將溶液B分散在溶液A中，高速剪切1 3分鐘，形成初乳C；(4)將初乳C在高壓和高切變力或氣穴作用的條件下形成一種穩定的乳劑；(5)溶劑在減壓條件下蒸發產生一種由蛋白質包被藥理活性物質組成的膠體系統，過 濾滅菌；(6)冷凍干燥去除水分，制備依托泊苷納米混懸液凍干制劑。
2.根據權利要求1所述的一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑的制備方法，其特征在 于所述步驟(1)中的有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、四氫呋喃、二氧雜環 乙烷、丁醇、乙酸丁酯、乙腈、丙酮、二甲亞砜、二甲酰胺或甲基吡咯烷酮中的一種或多種。
3.根據權利要求1所述的一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑，其特征在于，所述步驟 (2)中的穩定劑選自白蛋白、泊洛沙姆、吐溫-80、聚乙烯吡洛烷酮、羥丙基甲基纖維素、甲 基纖維素、泰洛沙姆、磷脂酰膽堿或卵磷脂、膽酸鈉、牛黃膽酸鈉或聚乙二醇中的一種或多 種。
4.根據權利要求1或3所述的一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑，其特征在于，所述白 蛋白選自人血清白蛋白、通過基因工程方法得到的重組白蛋白或動物血清白蛋白。
5.根據權利要求1所述的一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑的制備方法，其特征在 于，所述穩定劑與依托泊苷的重量比為5 1 20 1。
6.根據權利要求1所述的一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑的制備方法，其特征在 于，所述步驟O)中的水溶液選雙蒸水、0.9%氯化鈉水溶液、5%葡萄糖水溶液、含5%葡萄 糖和0. 9%氯化鈉的注射用水、含5%葡萄糖的林格氏注射液或磷酸鹽緩沖液的任一種。
全文摘要
本發明涉及一種依托泊苷納米混懸液凍干制劑的制備方法，屬醫藥技術領域。本發明采用高壓乳勻技術制備依托泊苷納米混懸液，粒徑小于200nm，過濾滅菌，冷凍干燥法制備固體粉末。能避免現有依托泊苷注射液中所使用的大量助溶劑和表面活性劑，從而降低毒副反應的發生率，提高其制劑穩定性；所采用的白蛋白本身就可以作為一種冷凍保護劑，而避免加入其他的輔料。本發明操作簡單、條件溫和、可控性強，適合工業化生產；制備的依托泊苷納米混懸液凍干制劑具有安全性高、穩定性好、毒副作用低等優點。
文檔編號A61K9/10GK102144969SQ201110091228
公開日2011年8月10日 申請日期2011年4月12日 優先權日2011年4月12日
發明者張志岳, 張棟, 苗蕾, 黃桂華 申請人:山東大學