專利名稱：一種復合酶提取斑蝥素的方法
技術領域：
本發明屬于中藥制藥或原料加工領域，具體涉及一種復合酶法提取斑蝥素的方法。
背景技術：
斑蝥，包括芫青科昆蟲南方大斑蝥(大斑芫青)力ris phalerata / /^^或黃黑小斑蝥(眼斑芫青)1 cichorii Zi/waem，是一種用途極廣的中藥材，臨床及藥理研究表明斑蝥臨床應用除抗癌外，尚有抗病毒、抑真菌、壯陽、升高白細胞等多種活性。斑蝥含斑蝥素、脂肪、蠟質、蟻酸和色素等物質，其中斑蝥素是主要有效成份。斑蝥素作為應用價值極高的抗癌藥，對其應用的研究越來越引起世人的關注。目前采用的斑蝥素的提取方法有酸法、堿法、滲轆法、混合提取法等，以上方法存在著提取不徹底、含量較低、產品中雜質多、品質不好等問題。在水提法和加熱回流法提取過程中，由于操作溫度高，斑蝥中的斑蝥素易發生分解；而在滲轆法提取過程中，雖然避免了高溫帶來的影響，但要達到較高的萃取效率需時間較長。新發展的技術如超聲波提取、微波提取、高壓提取和超臨界萃取等方法，不但設備成本高，新工藝也尚不成熟。發明人通過大量實驗，提出了一種斑蝥素的酶法提取方法，該方法經濟、環保、低能耗，且能最大程度地提取出斑蝥中的有效物質，并能應用于工業化生產。本發明的制備斑蝥素的新方法，在國內外尚未見報道。
發明內容
本發明的主要目的是提供一種簡單易行、成本低廉、適于大規模生產的斑蝥素提取工藝。為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案
一種復合酶提取斑蝥素的方法，所述方法是將斑蝥藥材用復合酶酶解，將酶解產物用體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸混合液浸提，將浸提產物趁熱抽濾后再向殘渣中加入體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸浸提，合并兩次濾液并旋轉蒸發干，將所得固體用體積比為1-2 1-2的水-氯仿混合液溶解，萃取下層有機相后再將下層有機相旋轉蒸發干，向所得固體中加入體積比為1-2:1-2的無水乙醇-石油醚混合液溶解，最后用丙酮重結晶，得到斑蝥素；所述復合酶為纖維素酶和果膠酶的混合物；所述濃鹽酸為37wt%的鹽酸水溶液。如上所述的方法，所述方法的步驟如下
a.稱取斑蝥藥材，粉碎至10-20目；
b.將粉碎后的斑蝥藥材加入水中，浸泡半小時，每500g藥材加入纖維素酶0.8-2g，果膠酶 1. 6-4g ；
c.調pH至5.0-6. 0，在40-50°C下水浴酶解2_4h，后煮沸2-5min使酶失活；
d.將酶滅活后，加入體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸混合溶液，加溶液總量為藥材重量的4-9倍；e.在40-70°C水浴中浸提20- 小時，趁熱抽濾；
f.濾畢，向殘渣中加入體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸混合液 600-6000mL浸提，趁熱抽濾；
g.將上述兩次提取的濾液合并后旋轉蒸發干；
h.將蒸干后所得固體用體積比為1-2:1-2的水-氯仿共400-4000mL溶解，萃取下層有機相；
i.將萃取的下層有機相旋轉蒸發干；
j.向蒸干后所得固體中加入體積比為1-2:1-2的無水乙醇-石油醚混合液共 200-2000mL 溶解；
k.所得溶液用丙酮重結晶，即得斑蝥素。如上所述的方法，其中，所述各酶的比活力為纖維素酶60萬U/g、果膠酶80萬U/ g°如上所述的方法，其中優選地，步驟b中，所加水重量為斑蝥藥材重量的1-2. 5倍。如上所述的方法，其中，所述斑蝥藥材為芫青科昆蟲南方大斑蝥(大斑芫青) Mylabris phalerata Pallas 或黃黑小斑蝥(眼斑芫青)M. cichorii Linnaeus 的干燥體。本發明的有益效果為
1、斑蝥素具有明顯的抗病毒、抑菌、壯陽、升高白細胞等多種活性，用于制藥，用途廣泛，本發明提供了一種提取制備斑蝥素的新方法。2、本發明的提取方法采用復合酶對原料進行酶解處理，成本低、對環境友好、產量高、純度高，適宜工業化生產。本發明制得的斑蝥素提取率較普通的混合提取法提高50%以上。3、本發明的提取方法操作簡便，避免了反復重結晶帶來的耗時。4、本發明方法中未使用氨水等堿化措施，提取液澄清，粘度低，產品雜質少，后續處理方便。
圖1為斑蝥素酶標準品的HPLC圖譜。圖2為斑蝥藥材未加酶提取的HPLC圖譜。圖3為斑蝥藥材加酶提取的HPLC圖譜。
具體實施例方式實施例1
(1)取南方大斑蝥力ris phalerata Pallas)藥材500g，粉碎，過10-20目篩。(2)用水浸潤，每500g藥材加入纖維素酶0. Sg、果膠酶1. 6g。(3) HCl調pH至5. 0，溫度為50°C酶解2. 5h，而后煮沸3min，使酶失活。(4)將酶解產物用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1. 5:1:1)于66°C水浴中浸提 24小時，將浸提產物熱抽濾，向殘渣中再加入氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1:2:1)浸提，熱抽濾。(5)合并兩次濾液旋蒸干，所得固體用水-氯仿(體積比2:1)溶解，萃取下層有機相。(6)再將下層有機相旋蒸近干，所得固體中加入無水乙醇-石油醚(體積比1:2)溶
解，最后用丙酮重結晶，得斑蝥素。經復合酶處理后，用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比單純的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取提高了 50%。實施例2
(1)取南方大斑蝥藥材500g，粉碎，過10-20目篩。(2)用水浸潤，每500g藥材加入纖維素酶lg、果膠酶1. Sg。(3) HCl調pH至5. 8，溫度為48°C酶解3h，而后煮沸％iin，使酶失活。(4)將酶解產物用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1. 5:1. 5:1)于57°C水浴中浸提23小時，將浸提產品熱抽濾，向殘渣中再加入氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1:2:1. 5) 浸提，熱抽濾。(5)合并兩次濾液旋蒸干，所得固體用水-氯仿(體積比2:1. 5)溶解，萃取下層有機相。(6)再將下層有機相旋蒸近干，所得固體中加入無水乙醇-石油醚(體積比1.5:2)
溶解，最后用丙酮重結晶，得斑蝥素。經復合酶處理后，用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比單純的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取提高了 56%。實施例3
(1)取黃黑小斑蝥(I cichorii Linnaeus)藥材500g，粉碎，過10-20目篩。(2)用水浸潤，每500g藥材加入纖維素酶1. 5g、果膠酶2. 0g。(3) HCl調pH至6. 0，溫度為45°C酶解2. 5h，而后煮沸2min，使酶失活。(4)將酶解產物用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1. 5:1:1)于70°C水浴中浸提 25小時，將浸提產品熱抽濾，向殘渣中再加入氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1 2 1. 5)浸提，熱抽濾。(5)合并兩次濾液旋蒸干，所得固體用水-氯仿(體積比2:1. 5)溶解，萃取下層有機相。(6)再將下層有機相旋蒸近干，所得固體中加入無水乙醇-石油醚(體積比1.5:2)
溶解，最后用丙酮重結晶，得斑蝥素。經復合酶處理后，用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比單純的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取提高了 59%。實施例4
(1)取黃黑小斑蝥藥材500g，粉碎，過10-20目篩。(2)用水浸潤，每500g藥材加入纖維素酶1. 4g、果膠酶2. 2g。(3) HCl調pH至5. 7，溫度為48°C酶解2h，而后煮沸5min，使酶失活。(4)將酶解產物用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1:2:1)于50°C水浴中浸提25 小時，將浸提產品熱抽濾，向殘渣中再加入氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1:2:1.5)浸提， 熱抽濾。(5)合并兩次濾液旋蒸干，所得固體用水-氯仿(體積比2. 5:1. 5)溶解，萃取下層有機相。(6)再將下層有機相旋蒸近干，所得固體中加入無水乙醇-石油醚(體積比 1. 5:2. 5)溶解，最后用丙酮重結晶，得斑蝥素。經復合酶處理后，用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比單純的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取提高了 53%。實施例5
(1)取黃黑小斑蝥藥材500g，粉碎，過10-20目篩。(2)用水浸潤，每500g藥材加入纖維素酶1. 6g、果膠酶3. 2g。(3) HCl調pH至5. 4，溫度為47°C酶解2h，而后煮沸3min，使酶失活。(4 )用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1 2 1. 5 )于42 °C水浴中浸提23小時，將浸提產品熱抽濾，向殘渣中加入氯仿-無水乙醇-濃鹽酸(體積比1:2. 5:1. 5)浸提。(5)合并兩次濾液旋蒸干，所得固體用水-氯仿(體積比2. 0:1. 0)溶解，萃取下層有機相。(6)再將下層有機相旋蒸近干，所得固體中加入無水乙醇-石油醚(體積比 1. 5:2. 0)溶解，最后用丙酮重結晶，得斑蝥素。 經復合酶處理后，用氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取斑蝥素，斑蝥素提取量比單純的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸提取提高了 59%。斑蝥素的含量檢測
(1)稱取斑蝥素標準品，采用高效液相色譜(HPLC)檢測，色譜條件柱型C18 ；流動相 乙腈-水(體積比40:60)；流速lmL/min ；柱溫:25°C。在273nm處測定峰面積，標準品的 HPLC圖譜見圖1 (斑蝥素保留時間t=7. 2min)0(2)斑蝥藥材未加酶提取的HPLC圖譜，見圖2 (斑蝥素保留時間t=7. 2min)0(3)斑蝥藥材加酶提取的HPLC圖譜，見圖3 (斑蝥素保留時間t=7. 2min)0(4)斑蝥藥材未加酶提取和加酶提取斑蝥素的結果見表1。表1酶法提取結果
權利要求
1.一種復合酶提取斑蝥素的方法，其特征在于，所述方法是將斑蝥藥材用復合酶酶解，將酶解產物用體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸混合液浸提，將浸提產物趁熱抽濾后再向殘渣中加入體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸浸提，合并兩次濾液并旋轉蒸發干，將所得固體用體積比為1-2:1-2的水-氯仿混合液溶解，萃取下層有機相后再將下層有機相旋轉蒸發干，向所得固體中加入體積比為1-2:1-2的無水乙醇-石油醚混合液溶解，最后用丙酮重結晶，得到斑蝥素；所述復合酶為纖維素酶和果膠酶的混合物；所述濃鹽酸為37wt%的鹽酸水溶液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的步驟如下a.稱取斑蝥藥材，粉碎至10-20目；b.將粉碎后的斑蝥藥材加入水中，浸泡半小時，每500g藥材加入纖維素酶0.8-2g，果膠酶 1. 6-4g ；c.調pH至5.0-6. 0，在40-50°C下水浴酶解2_4h，后煮沸2-5min使酶失活；d.將酶滅活后，加入體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸混合溶液，加溶液總量為藥材重量的4-9倍；e.在40-70°C水浴中浸提20- 小時，趁熱抽濾；f.濾畢，向殘渣中加入體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸混合液 600-6000mL浸提，趁熱抽濾；g.將上述兩次提取的濾液合并后旋轉蒸發干；h.將蒸干后所得固體用體積比為1-2:1-2的水-氯仿共400-4000mL溶解，萃取下層有機相；i.將萃取的下層有機相旋轉蒸發干；j.向蒸干后所得固體中加入體積比為1-2:1-2的無水乙醇-石油醚混合液共 200-2000mL 溶解；k.所得溶液用丙酮重結晶，即得斑蝥素。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟b中，所加水重量為斑蝥藥材重量的 1-2. 5 倍。
4.如權利要求1至3中任意一項所述的方法，其特征在于，所述斑蝥藥材為芫青科昆蟲南方大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥體。
全文摘要
本發明涉及一種復合酶提取斑蝥素的方法，其是將斑蝥藥材用纖維素酶和果膠酶復合酶酶解，將酶解產物用體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸混合液浸提，將浸提產物趁熱抽濾后再向殘渣中加入體積比為1-2:1-2:1-2的氯仿-無水乙醇-濃鹽酸浸提，合并兩次濾液并旋蒸干，將所得固體用體積比為1-2:1-2的水-氯仿混合液溶解，萃取下層有機相后再將下層有機相旋蒸干，向所得固體中加入體積比為1-2:1-2的無水乙醇-石油醚混合液溶解，最后用丙酮重結晶，得到斑蝥素。本發明與傳統提取法比較具有提取速度快、成本低、省時省力、提取率高、雜質含量少、易于純化等優點，適宜大規模工業化生產。
文檔編號A61P31/04GK102268006SQ20111016063
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月15日 優先權日2011年6月15日
發明者杜曉霞, 林強, 王路, 田平芳, 葛喜珍 申請人:北京聯合大學生物化學工程學院