本發明涉及生物工程技術領域，尤其是一種利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法。
背景技術：
我們知道，海參具有很高的營養價值和藥用價值，被人們視為重要的海珍品。近年來，海參消費需求量的逐年增加導致了海參自然資源的過度開發和種群數量的急劇下降，因此，海參的人工養殖也隨之發展起來。餌料是海參生長發育的物質基礎，隨著海參大規模養殖的發展，天然餌料已不能滿足海參養殖的需要，因此需要人工投喂餌料。目前，人工投喂餌料存在著人工成本高、投放的餌料利用率低、人工投放餌料的量和時間不易掌握等問題。
魚類是我國沿海豐富的海產資源，魚類加工后的下腳料（魚碎肉和內臟）成本低、蛋白質、牛磺酸含量高，是海參理想的天然餌料，但是使用未加工的魚下腳料，又存在海參無法消化利用的缺點。
技術實現要素：
為了克服現有技術中魚類下腳料直接投喂海參無法消化利用的不足，本發明提供一種工藝合理、海參餌料的腸道利用率高的利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案為：利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其特征在于：其經過下列工藝步驟：
（a）魚類下腳料發酵處理
（a1）發酵種子液的培養
在DAE培養基中接入W2菌種，控制溫度20～25℃，在150～180r/min條件下，培養2～3d，得種子菌液，所述的種子菌液OD600為1.0～1.2；其中，所述的DAE培養基的配方為：蛋白胨0.4～0.8g，酵母膏0.05～0.2g，磷酸鐵0.01～0.02g，海水90～100ml；所述的W2菌種為魚腸道中分離篩選得到的產蛋白酶菌株，該W2菌種與所述的DAE培養基的接種比例為1:300～500；
（a2）魚類下腳料發酵液的制備
選取魚下腳料為原料，研磨至肉糜狀；稱量肉糜狀魚類下腳料放入步驟(a1)制得的種子菌液中，控制溫度20～25℃，在150～180r/min條件下，培養2～3d，取發酵液，得魚類下腳料發酵液；其中，所述的肉糜狀魚類下腳料與種子菌液的料液比為1:20～25；
（b）固定化酶的制備
（b1）載體制備
稱取殼聚糖溶解于濃度為20～30%的鹽酸溶液中，配成殼聚糖溶液；然后將制得的殼聚糖溶液注射到含15%的氫氧化鈉和30%甲醇混合溶液中，凝結成中空球形殼聚糖；其中，所述的殼聚糖與鹽酸溶液的料液比為1:3～5，所述的殼聚糖的脫乙酰度為80%～85%；
（b2）載體活化
將步驟（b1）制得的中空球形殼聚糖放入濃度為4～8%的戊二醛水溶液中，于室溫下攪拌反應4～6h，然后4℃靜置過夜，去上清液后用水清洗2～3次，去除殘余的戊二醛，得戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖；其中，所述的中空球形殼聚糖與戊二醛水溶液的料液比為1:2～3；
（b3）酶的包埋
將步驟（b2）制得的戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖分別加入不同pH 值緩沖液配置的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶制劑中，室溫下攪拌反應2～3h ，于4℃靜置過夜，用水清洗去除游離酶，即得固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶；其中，所述的中性蛋白酶的緩沖液pH 值為6.8～7.5；所述的堿性蛋白酶的緩沖液pH 值為8.5～10.5；所述的酸性蛋白酶的緩沖液pH 值為4.0～4.5；
（c）投放
將步驟（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶與步驟（a2）制得的魚類下腳料發酵液按料液比為1:50～100投入海參養殖水域中。
本發明是在培養基中接種魚腸道中分離篩選得到的產蛋白酶菌株，培養出種子菌液；將魚類下腳料肉糜放入種子菌液中發酵，形成富含蛋白質的發酵液；將殼聚糖溶液注射到氫氧化鈉和甲醇混合溶液中，凝結成中空球形殼聚糖載體；載體放入戊二醛水溶液中活化；利用固定化酶技術，將酶包裹在空心球殼聚糖載體中，形成固定化酶；將固定化酶與發酵液一起投放到海參養殖水域，即可。固定化酶的穩定性高，半衰周期長，魚類下腳料發酵液與其一起投入海參飼養水域中，底物可以透過孔道與酶接觸反應，將魚下腳料廢液中的蛋白進行酶解，不僅提高了海參餌料的腸道利用率，減少代謝產物的排出，提高海參的生長速率、飼料轉化率，而且還能對沉積在海底或池底的殘餌起到一定的降解作用，減少養殖業中氮、磷的排放，保護養殖生態環境。本發明工藝合理，其中，所采用的蛋白酶為模擬海參體內從前腸到后腸的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶；所采用的殼聚糖，投入飼養海參水域后，還可以起到凈化水質的作用。因為酶的作用底物是有限的，一次性投放的魚下腳料發酵液并不能立刻被完全消化完，魚類下腳料發酵液與固定化的蛋白酶配合緩慢又源源不斷地為海參供給養料。兩者一次性投放可以減少投放餌料的次數，降低人工成本。本發明充分利用海產廢棄物，提高海洋資源利用率，減少環境污染，增加海參養殖餌料種類，具有廣闊的市場前景。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步說明。
實施例1
利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其經過下列工藝步驟：
（a）魚類下腳料發酵處理
（a1）發酵種子液的培養
在DAE培養基中接入W2菌種，控制溫度22℃，在160r/min條件下，培養3d，得種子菌液，該種子菌液OD600為1.1；其中， DAE培養基的配方為：蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，磷酸鐵0.015g，海水95ml； W2菌種為魚腸道中分離篩選得到的產蛋白酶菌株，該W2菌種與DAE培養基的接種比例為1:400；
（a2）魚類下腳料發酵液的制備
選取魚下腳料為原料，送入研磨機中研磨至肉糜狀；稱量肉糜狀魚類下腳料放入步驟(a1)制得的種子菌液中，其肉糜狀魚類下腳料與種子菌液的料液比為1:22；控制溫度23℃，在160r/min條件下，培養3d，取發酵液，得魚類下腳料發酵液；
（b）固定化酶的制備
（b1）載體制備
稱取脫乙酰度為82%的殼聚糖溶解于濃度為25%的鹽酸溶液中，其殼聚糖與鹽酸溶液的料液比為1:4，配成殼聚糖溶液；然后將制得的殼聚糖溶液注射到含15%的氫氧化鈉和30%甲醇混合溶液中，凝結成中空球形殼聚糖；
（b2）載體活化
將步驟（b1）制得的中空球形殼聚糖放入濃度為6%的戊二醛水溶液中，其中空球形殼聚糖與戊二醛水溶液的料液比為1:2.5；于室溫下攪拌反應5h，然后4℃靜置過夜，去上清液后用水清洗3次，去除殘余的戊二醛，得戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖；
（b3）酶的包埋
將步驟（b2）制得的戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖分別加入pH值為7.0緩沖液配置的中性蛋白酶制劑、pH值為9.0緩沖液配置的堿性蛋白酶制劑和pH值為4.2緩沖液配置的酸性蛋白酶制劑中，室溫下攪拌反應3h ，于4℃靜置過夜，用水清洗去除游離酶，即得固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶；
（c）投放
將步驟（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶與步驟（a2）制得的魚類下腳料發酵液按料液比為1:80投入海參養殖水域中。
本實施例所提供的利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其工藝合理，操作可靠。固定化酶的穩定性高，半衰周期長，對魚類下腳料發酵液緩慢酶解，釋放海參餌料，同時對沉積在海底或池底的殘餌起到降解作用，減少養殖業中氮、磷的排放，所采用的殼聚糖還起到凈化水質的作用，保護養殖生態環境。其減少投放餌料的次數，降低人工成本。本發明充分利用海產廢棄物，提高海洋資源利用率，減少環境污染。
實施例2
利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其特征在于：其經過下列工藝步驟：
（a）魚類下腳料發酵處理
（a1）發酵種子液的培養
在DAE培養基中接入W2菌種，控制溫度25℃，在150r/min條件下，培養2d，得種子菌液；該種子菌液OD600為1.2；其中， DAE培養基的配方為：蛋白胨0.8g，酵母膏0.05g，磷酸鐵0.02g，海水100ml； W2菌種為魚腸道中分離篩選得到的產蛋白酶菌株，該W2菌種與DAE培養基的接種比例為1:500；
（a2）魚類下腳料發酵液的制備
選取魚下腳料為原料，送入研磨機中研磨至肉糜狀；稱量肉糜狀魚類下腳料放入步驟(a1)制得的種子菌液中，其肉糜狀魚類下腳料與種子菌液的料液比為1: 25；控制溫度20℃，在180r/min條件下，培養2d，取發酵液，得魚類下腳料發酵液；
（b）固定化酶的制備
（b1）載體制備
稱取脫乙酰度為85%的殼聚糖溶解于濃度為20%的鹽酸溶液中，其殼聚糖與鹽酸溶液的料液比為1: 5，配成殼聚糖溶液；然后將制得的殼聚糖溶液注射到含15%的氫氧化鈉和30%甲醇混合溶液中，凝結成中空球形殼聚糖；
（b2）載體活化
將步驟（b1）制得的中空球形殼聚糖放入濃度為8%的戊二醛水溶液中，中空球形殼聚糖與戊二醛水溶液的料液比為1:2；于室溫下攪拌反應4h，然后4℃靜置過夜，去上清液后用水清洗3次，去除殘余的戊二醛，得戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖；
（b3）酶的包埋
將步驟（b2）制得的戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖分別加入pH值為6.8緩沖液配置的中性蛋白酶制劑、pH值為10.5緩沖液配置的堿性蛋白酶制劑和pH值為4.0緩沖液配置的酸性蛋白酶制劑中，室溫下攪拌反應2.5h ，于4℃靜置過夜，用水清洗去除游離酶，即得固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶；
（c）投放
將步驟（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶與步驟（a2）制得的魚類下腳料發酵液按料液比為1:50投入海參養殖水域中。
本實施例所提供的利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其工藝合理，操作可靠。固定化酶的穩定性高，半衰周期長，對魚類下腳料發酵液緩慢酶解，釋放海參餌料，同時對沉積在海底或池底的殘餌起到降解作用，其減少投放餌料的次數，降低人工成本。本發明充分利用海產廢棄物，提高海洋資源利用率，減少環境污染。
實施例3
利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其特征在于：其經過下列工藝步驟：
（a）魚類下腳料發酵處理
（a1）發酵種子液的培養
在DAE培養基中接入W2菌種，控制溫度20℃，在180r/min條件下，培養3d，得種子菌液；該種子菌液OD600為1.0；其中，DAE培養基的配方為：蛋白胨0.4g，酵母膏0.2g，磷酸鐵0.01g，海水90ml； W2菌種為魚腸道中分離篩選得到的產蛋白酶菌株，該W2菌種與DAE培養基的接種比例為1:300；
（a2）魚類下腳料發酵液的制備
選取魚下腳料為原料，送入研磨機中研磨至肉糜狀；稱量肉糜狀魚類下腳料放入步驟(a1)制得的種子菌液中，其肉糜狀魚類下腳料與種子菌液的料液比為1:20；控制溫度25℃，在150r/min條件下，培養2.5d，取發酵液，得魚類下腳料發酵液；
（b）固定化酶的制備
（b1）載體制備
稱取脫乙酰度為80%的殼聚糖溶解于濃度為30%的鹽酸溶液中，其殼聚糖與鹽酸溶液的料液比為1:3，配成殼聚糖溶液；然后將制得的殼聚糖溶液注射到含15%的氫氧化鈉和30%甲醇混合溶液中，凝結成中空球形殼聚糖；
（b2）載體活化
將步驟（b1）制得的中空球形殼聚糖放入濃度為4%的戊二醛水溶液中，中空球形殼聚糖與戊二醛水溶液的料液比為1: 3；于室溫下攪拌反應6h，然后4℃靜置過夜，去上清液后用水清洗2次，去除殘余的戊二醛，得戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖；
（b3）酶的包埋
將步驟（b2）制得的戊二醛活化處理的中空球形殼聚糖分別加入pH值為7.5緩沖液配置的中性蛋白酶制劑、pH值為8.5緩沖液配置的堿性蛋白酶制劑和pH值為4.5緩沖液配置的酸性蛋白酶制劑中，室溫下攪拌反應2h ，于4℃靜置過夜，用水清洗去除游離酶，即得固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶；
（c）投放
將步驟（b3）制得的固定化的中性蛋白酶、堿性蛋白酶和酸性蛋白酶與步驟（a2）制得的魚類下腳料發酵液按料液比為1:100投入海參養殖水域中。
本實施例所提供的利用魚類下腳料和固定化酶制備緩釋性海參餌料的方法，其工藝合理，操作可靠。固定化酶的穩定性高，半衰周期長，對魚類下腳料發酵液緩慢酶解，釋放海參餌料，同時對沉積在海底或池底的殘餌起到降解作用，減少養殖業中氮、磷的排放，所采用的殼聚糖還起到凈化水質的作用，保護養殖生態環境。其減少投放餌料的次數，降低人工成本。本發明充分利用海產廢棄物，提高海洋資源利用率，減少環境污染。