專利名稱：一種用于擴增cik的方法及一種cik細胞制劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫細胞體外培養領域，涉及一種用于擴增CIK的方法，所述CIK細胞為經由外周血單個核細胞(PBMC)擴增培養成細胞因子誘導的殺傷細胞，本發明還進一步的提供了一種CIK細胞制劑。
背景技術：
生物治療是通過調動宿主天然防衛機制或給予天然產生的靶向性很強的物質來達到臨床治療效果，生物治療領域中一個重要的方法就是免疫細胞療法，即將分離的自身免疫細胞在體外通過細胞因子誘導，擴增初大量具有高度細胞毒活性的異質細胞群(CIK)， 再回輸至體內發揮治療作用。此類免疫細胞的種類包括了淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)， 腫瘤侵潤淋巴細胞(TIL)，細胞毒淋巴細胞(CTL)，CD3單抗激活的殺傷細胞(CD3AK)及細胞因子誘導的殺傷細胞。在眾多的免疫細胞中，CIK細胞由于有殺瘤活性高，殺瘤譜廣，對多種耐藥細胞同樣敏感以及對正常骨髓造血前提細胞毒性更小等優良特點，廣泛的應用于臨床。與其它免疫細胞相比，CIK細胞是已知的殺傷活性最強的效應細胞之一。它是通過加入多種細胞因子，由外周血單個核細胞培養而來的一群異質細胞，CIK細胞臨床治療效果主要取決于回輸細胞的數量和細胞毒活性。CIK細胞中最具細胞毒活性的是CD3+CD56+ 細胞(NKT細胞)，NKT細胞表面能夠同時表達⑶3和⑶56兩種膜蛋白分子，既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性又具備NK細胞的非MHC限制性殺瘤的特點，然而NKT細胞在正常的外周血中含量極低，僅為左右。因此，在體外培養中，提高CIK細胞的絕對數量和其中的 NKT細胞的比例對提高臨床治療效果至關重要。CIK細胞能通過體外誘導而大量增殖，一般的CIK制備方法是將分離的外周血單個核細胞(PBMC)用IFN-Y處理24小時后，加入CD3mAb, IL-1 α和IL-2因子進行刺激誘導，最終獲得一定數量的CIK細胞，但最終獲得的CIK細胞的增值倍數和細胞毒活性都不夠
王困相
發明內容
本發明所要解決的技術問題是常規CIK擴增方法所得到的CIK細胞增殖細胞倍數和細胞毒活性不夠理想的問題，并針對該問題提供一種用于擴增CIK的方法。本發明通過以下技術方案解決上述問題—種用于擴增CIK的方法，其特征在于，按如下程序實施a、應用淋巴細胞分離液分離出PBMC，將培養袋預先用⑶3mAb和⑶137mAb包被，將分離得到的PBMC用無血清培養基調整濃度之1 X 106/ml，并加入IFN- γ至終濃度為IOOOu/ ml，轉移至培養袋中培養；b、培養M小時后加入CD3mAb、CD^mAb、CD137mAb，并加入配置的無血清培養基， 配置的無血清培養基中添加了 IL-I α、IL-2、IL-12及IL-15，連續培養7_21天后，離心收集獲得的CIK細胞；c、b步驟的培養過程中，每隔3天對培養袋中的細胞進行計數，并根據細胞濃度補加培養基，每隔6天添加CD3mAb，CD^mAb，CD137mAb至相應濃度。與常規的培養方法相比，本發明的有益效果表現在以下幾方面第一，本發明所述用于擴增CIK的方法在a步驟采用了培養袋包被技術。試驗表明，附著的單抗比游離的單抗對細胞的促有絲分裂作用更強，從而有助于提高了細胞的擴增水平；第二，在b步驟使用了多種單抗。在CIK的培養體系中，CIK細胞是通過誘導活化的τ細胞分化而來，CD3mAb作為抗原刺激提供了 T細胞活化的第一信號，而CD^mAb作為T 細胞表面的共刺激分子與其配體結合，提供了 T細胞活化的第二信號，試驗結果表明，共刺激分子的存在有利于增強T細胞的活化效果；而CD137/CD137L則是TNFR/TNF超家族成員之一，兩者結合后介導的共刺激信號同樣可刺激T細胞增殖，本發明所述用于擴增CIK的方法，在b步驟中同時加入了 3種單抗，既相對降低了單個抗體的使用總量，又通過單抗相互間的協同作用刺激T細胞高通量地活化增殖，從而使收獲的CIK細胞數量有了大比例的提尚；第三，在b步驟中使用了多個白細胞介素的組合，即延長了 CIK細胞的存活周期又提高了細胞毒活性。IL-12主要由活化的巨噬細胞和B細胞產生，能刺激多種免疫細胞的增殖和殺傷作用，是THO細胞想THl細胞方向分化過程中的必要因子；而IL-15是一種多功能的細胞因子，是造血前體細胞向NK細胞定向發育的決定性因子，具有促進NK細胞增生，上調NK細胞毒活性，促進NK細胞分泌各種細胞因子參與免疫調節和趨化作用。常規的培養體系中僅應用了 IL-Ia及IL-2，本發明中通過加入了 IL-12及IL-15，增加了多因子間的相互協同作用，不但可以促進CIK細胞的擴增數量及CD3+CD56+細胞比例的增加，還可以大幅度提高CIK細胞的毒活性。本發明還進一步的對用于擴增CIK的方法中所涉及的各種濃度進行了限定，以使 CIK細胞增殖細胞倍數和細胞毒活性進一步提高對于a步驟，一種較優的方案是a步驟中用于包被培養袋的CD3mAb的濃度為 50ng/ml-30ug/ml，用于包被培養袋的 CD137mAb 的濃度為 10ng/ml_20ug/ml ；一種更優的方案是，a步驟中用于包被培養袋的⑶3mAb的濃度為0. 5ug/ml-20ug/ ml，用于包被培養袋的CD137mAb的濃度為50ng/ml_10ug/ml。對于b步驟，一種較優的方案是b步驟中加入無血清培養基中的CD3mAb終濃度為 5ng/ml-5ug/ml，加入無血清培養基中的CD^mAb終濃度為5ng/ml_5ug/ml，加入無血清培養基中的CD137mAb終濃度為lng/ml_lug/ml ；b步驟中所述的無血清培養基中，含有的IL-I α濃度為10u/ml-1000u/ml，含有的 IL-2 濃度為 50u/ml-3000u/ml，含有的 IL-12 濃度為 lng/ml_100ng/ml，含有的 IL-15 濃度為 lng/ml-1000ng/ml ；一種更優的方案是b步驟中加入無血清培養基中的⑶3mAb終濃度為50ng/ ml-500ng/ml，加入無血清培養基中的CD^mAb終濃度為50ng/ml_500ng/ml，加入無血清培養基中的CD137mAb終濃度為5ng/ml_500ng/ml ；b步驟中所述的無血清培養基中，含有的IL-I α濃度為50u/ml-500u/ml，含有的IL-2 濃度為 100u/ml-2000u/ml，含有的 IL-12 濃度為 5ng/ml_50ng/ml，含有的 IL-15 濃度為 5ng/ml_500ng/mlο本發明還提供了一種CIK細胞制劑，該細胞制劑包括由本發明所述用于擴增CIK 細胞的方法制備的CIK細胞、白蛋白、IL-2以及生理鹽水，制備方法一般是將CIK細胞重懸于含有白蛋白以及IL-2的生理鹽水中。就上段內容所提到的細胞制劑組成成分，本發明通過實驗發現，在IL-2細胞因子的基礎上，再添加白蛋白后，能夠較不添加白蛋白之前，更有利于保持CIK細胞活性，提高細胞的存活率。一種優選的方案是，所述生理鹽水中白蛋白的濃度為5g/L 80g/L，生理鹽水中 IL-2 的濃度為 1 X 105U/ml 1 X 107U/ml ；一種更優的方案是，所述生理鹽水中白蛋白的濃度為10g/L 40g/L，I生理鹽水中 L-2 的濃度為 1 X 106U/ml 3X 106U/ml ；一種最優的方案是，所述生理鹽水中白蛋白的濃度為25g/L，生理鹽水中的IL-2 的濃度為3X106U/ml。
具體實施例方式實施例本實施例的目的是通過與現有技術實施方案的對比，使本領域技術人員充分的了解本發明的技術方案及相應的技術效果，至于本實施例所用到的各種試劑均在市場上能夠買到，不同廠家生產的試劑按照本領域常規處理后，不會造成本實施例實驗結果的不同，所使用的無血清培養基為添加了 2%自體血清的商品化無血清培養基。(一 )、本實施例所采用的用于擴增CIK的方法一種擴增CIK的方法，包括①、應用血細胞分離機或從外周全血中獲得外周血單個核細胞(PBMC)，將PBMC用無血清培養基懸浮，并調整濃度之ι X IO6Ail，將培養袋預先用10ug/ml⑶3mAb和CD137mAb 包被，并加入IFN-Y至終濃度為1000u/ml，轉移至培養袋中培養；②、將培養袋置于37°C，CO2濃度為5%，濕度為100%的恒溫培養箱中培養M小時后加入⑶3mAb、ra^mAb、⑶137mAb，并加入配置的無血清培養基，配置的無血清培養基中添加了 IL-Ia、IL-2、IL-12及IL-15，連續在37°C，C02濃度為5%，濕度為100%的培養箱中連續培養21天后，離心收集獲得的CIK細胞；其中，②步驟中加入無血清培養基中的OT^mAb終濃度為lOOng/ml，加入無血清培養基中的CD137mAb終濃度為20ng/ml ；②步驟中所述的無血清培養基中，含有的IL-I α濃度為300u/ml，含有的IL-2濃度為1000u/ml，含有的IL-12濃度為lOng/ml，含有的IL-15濃度為50ng/ml ；③、②步驟的培養過程中，每隔3天對培養袋中的細胞進行計數，并根據細胞濃度補加培養基，每隔6天添加CD3mAb，CD^mAb，CD137mAb至相應濃度。(二)、常規培養方法將采集的外周血單個核細胞用無血清培養基調整濃度為lX106U/ml，第1天加入 IFN- y 1000U/ml，隨后將培養液置于37°C，0)2濃度為5%，濕度為100%的恒溫培養箱中培養24小時；隨后加入IL-I α、IL_2以及⑶3單抗，使得IL_1 α、IL-2以及⑶3單抗在培養基中的終濃度分別為300U/ml、1000U/ml以及500U/ml ；接著繼續在37°C，0)2濃度為5%，濕度為100%的恒溫培養箱中培養，每隔3天添加培養基，使細胞濃度保持在lXlOM/ml，IL-Ia、IL-2以及⑶3單抗的濃度分別保持在 300U/ml、1000U/ml 以及 500U/ml。(三)、結果測試分別在第7、14及21天收集由本實施例所述擴增CIK的方法及常規培養方法所培養的細胞用于各項測試。以下從幾個方面比較這兩種制備方法獲得的CIK細胞的差異性，常規組是以常規方法獲得的CIK細胞，實驗組是以本實施例所提供的方法制備的CIK細胞。I、細胞增殖倍數的測定將取得的CIK細胞用臺盼藍染色后再用血細胞計數器進行計數，將當前的細胞總數除以培養前的單個核細胞數，數值即為細胞的擴增倍數。用此方法可以動態觀察細胞的增殖狀況，具體情況見表1。表 權利要求
1.一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，按如下程序實施a、應用淋巴細胞分離液分離出PBMC，將培養袋預先用CD3mAb和CD137mAb包被，將分離得到的PBMC用無血清培養基調整濃度之1 X 106/ml，并加入IFN- γ至終濃度為1000u/ml， 轉移至培養袋中培養；b、培養M小時后加入CD3mAb、CD^mAb、CD137mAb，并加入配置的無血清培養基，配置的無血清培養基中添加了 IL-I α、IL-2、IL-12及IL-15，連續培養7_21天后，離心收集獲得的CIK細胞；c、b步驟的培養過程中，每隔3天對培養袋中的細胞進行計數，并根據細胞濃度補加培養基，每隔6天添加CD3mAb，CD28mAb, CD137mAb至相應濃度。
2.根據權利要求1所述的一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，所述的無血清培養基是添加了 2%自體血清的商品化無血清培養基。
3.根據權利要求1所述的一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，a步驟中用于包被培養袋的⑶3mAb的濃度為50ng/ml-30ug/ml，a步驟中的用于包被培養袋的CD137mAb的濃度為 10ng/ml-20ug/mlo
4.根據權利要求1所述的一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，a步驟中用于包被培養袋的⑶3mAb的濃度為0. 5ug/ml-20ug/ml, a步驟中的用于包被培養袋的CD137mAb的濃度為 50ng/ml-10ug/mlo
5.根據權利要求1所述的一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，b步驟中加入無血清培養基中的⑶3mAb終濃度為5ng/ml-5ug/ml，加入無血清培養基中的OT^mAb終濃度為 5ng/ml-5ug/ml，加入無血清培養基中的CD137mAb終濃度為lng/ml_lug/ml。
6.根據權利要求1所述的一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，b步驟中加入無血清培養基中的⑶3mAb終濃度為50ng/ml-500ng/ml，加入無血清培養基中的OT^mAb終濃度為 50ng/ml-500ng/ml，加入無血清培養基中的CD137mAb終濃度為5ng/ml_500ng/ml。
7.根據權利要求1所述的一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，b步驟中所述的無血清培養基中，含有的IL-I α濃度為10u/ml-1000u/ml，含有的IL-2濃度為50u/ml_3000u/ ml，含有的 IL-12 濃度為 lng/ml-100ng/ml，含有的 IL-15 濃度為 lng/ml_1000ng/ml。
8.根據權利要求1所述的一種用于擴增CIK的方法，其特征在于，b步驟中所述的無血清培養基中，含有的IL-I α濃度為50u/ml-500u/ml，含有的IL-2濃度為100u/ml-2000u/ ml，含有的 IL-12 濃度為 5ng/ml-50ng/ml，含有的 IL-15 濃度為 5ng/ml_500ng/ml。
9.根據權利要求1所述的一種用于擴增CIK的方法，其特征在于a步驟中用于包被培養袋的⑶3mAb的濃度為10ug/ml，用于包被培養袋的⑶137mAb的濃度為lug/ml ；b步驟中加入無血清培養基中的OT^mAb終濃度為lOOng/ml，加入無血清培養基中的 CD137mAb 終濃度為 20ng/ml ；b步驟中所述的無血清培養基中，含有的IL-I α濃度為300u/ml，含有的IL-2濃度為 1000u/ml，含有的IL-12濃度為10ng/ml，含有的IL-15濃度為50ng/ml。
10.一種CIK細胞制劑，包括由權利要求1至11任意一種用于擴增CIK的方法制備的 CIK細胞、白蛋白、IL-2以及生理鹽水。
11.根據權利要求10所述的一種CIK細胞制劑，其特征在于所述白蛋白在生理鹽水中的濃度為5-80g/L，生理鹽水中的IL-2的濃度為0. l-10X106U/ml。
12.根據權利要求10所述的一種CIK細胞制劑，其特征在于所述白蛋白在生理鹽水中的濃度為10-40g/L，生理鹽水中的IL-2的濃度為l-6X106U/ml。
13.根據權利要求10所述的一種CIK細胞制劑，其特征在于所述白蛋白在生理鹽水中的濃度為25g/L，生理鹽水中的IL-2的濃度為3X106U/ml。
全文摘要
本發明屬于免疫細胞體外培養領域，涉及一種用于擴增CIK的方法以及一種CIK細胞制劑，具體采用如下程序a、應用淋巴細胞分離液分離出PBMC，將培養袋預先用CD3mAb和CD137mAb包被，將分離得到的PBMC用無血清培養基調整濃度之1×106/ml，并加入IFN-γ至終濃度為1000μ/ml，轉移至培養袋中培養；b、培養24小時后加入CD3mAb、CD28mAb、CD137mAb，并加入配置的無血清培養基，配置的無血清培養基中添加了IL-1α、IL-2、IL-12及IL-15，連續培養7-21天后，離心收集獲得的CIK細胞；c、b步驟的培養過程中，每隔3天對培養袋中的細胞進行計數，并根據細胞濃度補加培養基，每隔6天添加CD3mAb，CD28mAb，CD137mAb至相應濃度；從而提高了CIK細胞增殖細胞倍數和細胞毒活性。
文檔編號A61K35/14GK102352342SQ201110297100
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者張贊, 蘇國新 申請人:上海柯萊遜生物技術有限公司