一種自體外周血淋巴細胞cik的培養方法
【專利摘要】本發明涉及一種自體外周血淋巴細胞的培養方法，包括如下步驟：（1）從外周血中分離單個核細胞，重懸于X-VIVO15無血清培養基中，使細胞濃度為1×106個/mL，培養3天；（2）補加X-VIVO15無血清培養基至100mL，添加IL-21×103U/mL，培養1天；（3）補加X-VIVO15無血清培養基至200-240mL，添加IL-21×103U/mL，培養3天；（4）補加X-VIVO15無血清培養基至1000ml，添加IL-21×103U/mL、CTLA-4mAb100ng/mL、PD-1mAb100ng/mL；（5）培養5-7天，制得自體外周血淋巴細胞。本發明通過向X-VIVO15無血清培養基中添加多種單抗及細胞因子，提高效應細胞群活化效率和擴增效率。特別是體外加載CTLA-4、PD-1抗體以覆蓋所有CIK細胞表面的CTLA-4、PD-1分子，有效的降低了T調節細胞的含量，進一步提高CIK細胞對腫瘤的殺傷作用。
【專利說明】-種自體外周血淋巴細胞CIK的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫細胞體外培養【技術領域】，特別涉及一種自體外周血淋巴細胞CIK 的培養方法。
【背景技術】
[0002] 過繼性免疫療法是將致敏淋巴細胞(具有特異免疫力）或其產物輸給細胞免疫功 能低下者(如腫瘤病人)，使其獲得抗腫瘤免疫力，它是用來治療腫瘤的一種免疫療法。
[0003] 細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells,CIK)是將人外周血 單個核細胞在體外用多種細胞因子(如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-γ等）共同培養一 段時間后獲得的一群異質細胞。由于該種細胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故 又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限 制性殺瘤優點。
[0004] 腫瘤組織的免疫逃逸性就是指腫瘤細胞通過多種機制逃避機體免疫系統識別和 攻擊，從而得以在體內生存和增殖的現象。機體免疫系統具有免疫監視功能，當體內出現惡 變細胞時，免疫系統能夠識別并通過免疫機制特異地清除這些"非己"細胞，抵御腫瘤的發 生發展。然而，惡變細胞在某些情況下能通過多種機制逃避機體的免疫監視，在體內迅速增 殖，形成腫瘤。也就是說：一方面，機體可通過天然和獲得性免疫抵抗腫瘤的發生；另一方 面，腫瘤細胞可通過多種機制逃避機體免疫的識別和攻擊。其分子機理在于免疫T細胞包 括CIK細胞，在其細胞表面表達著一類受體，它們的作用是一但與其相應的配體結合，就能 產生一系列信號來抑制或削弱T細胞的活力。生物體通過這一機制來控制T細胞的殺傷作 用，以避免它們攻擊自身細胞，產生自身免疫反應。而CTLA4、ro-l分子就是這類受體。在免 疫T細胞被激活、擴增的各個步驟中，一旦遭遇到表達著輔助激活配體（B7-1，⑶80,⑶86) 的樹突細胞或腫瘤細胞時，激活的T細胞通過提高CTLA-4、Η)-1分子的表達，其中CTLA-4 分子使之替代CD28與B7-1結合，而ro-i分子與ro-L分子接合，從而提高了 T調節細胞的 負調節功能，降低T細胞的殺傷功能。
[0005] 目前現有的CIK技術的不足：在腫瘤的微環境中T細胞表面CTLA4和ro-i的表 達量升高，與APC上的相應的配體接合，從而介導免疫負調控機制，抑制T細胞的殺傷功能。 現有的CIK技術沒有考慮到T調節細胞含量對腫瘤免疫逃逸的影響。用CTLA-4和ro-i單 克隆抗體用來抑制T調節細胞在理論上和實驗中均得到證實。
【發明內容】
[0006] 本發明針對現有技術的不足，提供一種培養自體外周血淋巴細胞的方法。
[0007] 本發明中一些常用的術語說明如下； PBMC :外周血單個核細胞； IL-2 :白細胞介素2; IL-I α :白細胞介素 I α ; IFN-γ :干擾素 γ ; CD3mAb :細胞表面分子3單克隆抗體； ⑶28mAb :細胞表面分子28單克隆抗體； CTLA-4mAb :CTLA-4 單克隆抗體； I3D-ImAb :ro-i單克隆抗體。
[0008] 本發明的技術方案如下： 一種自體外周血淋巴細胞CIK的培養方法，包括如下步驟： (1) 從外周血中分離外周血單個核細胞，重懸于X-VIV015無血清培養基中，使外周血 單個核細胞的細胞濃度為IX IO6個/mL，靜置培養3天； (2) 向步驟（1)制得的培養液中補加 X-VIV015無血清培養基至IOOmL,同時添加 IL-2， 使IL-2的濃度為I X 103U/mL，靜置培養1天； (3) 向步驟（2)制得的培養液中補加 X-VIV015無血清培養基至200-240mL，同時添加 IL-2,使IL-2的濃度為I X 103U/mL，靜置培養3天， (4) 將步驟（3)制得的培養液中補加 X-VIV015無血清培養基至IOOOmL,同時添加 IL-2， 使1!^-2的濃度為1\10%/1^，添加(：1'1^-411^13 1001^/11^、？0-111^13 1001^/11^; (5) 將步驟（4)制得的培養液靜置培養5-7天，制得自體外周血淋巴細胞。
[0009] 其中，步驟（1)的X-VIV015無血清培養基添加了以下組分：rhIFN-γ 1000U/mL、 胸腺法新 500ng/mL、rhIL-la 100U/mL、CD3mAb 100ng/mL、CD28mAb 100ng/mL。
[0010] 其中，所述步驟（I)?（4)中的靜置培養條件為在溫度為37°C、C02體積百分比為 含量為7. 5%、相對飽和濕度為100%的CO2培養箱中培養。
[0011] 其中，所述步驟（5)還包括將制得的自體外周血淋巴細胞經離心后，重懸于保存液 中，所述保存液含有如下組分：體積百分比為20%的人血清白蛋白5mL，0. 9wt%氯化鈉溶 液定容至l〇〇mL。
[0012] 本發明的方法是經過篩選獲得的，篩選過程如下： (1) CTLA-4 濃度（ng/mL ): 0、100 和 500 ; (2) PD-I 濃度（ng/mL): 0、100 和 500 ; 為此，本發明提出了以下9種實驗篩選條件： 實驗條件1 : (1) 從外周血中分離外周血單個核細胞，重懸于X-VIV015無血清培養基中，使外周血 單個核細胞的細胞濃度為IX IO6個/mL，在37°C、7. 5%C02 CO2培養箱中培養靜置培養3天； (2) 向步驟（1)制得的培養液中補加 X-VIV015無血清培養基至IOOmL,同時添加 IL-2， 使IL-2的濃度為IX 103U/mL，在37°C、7. 5%C02 CO2培養箱中靜置培養1天； (3) 向步驟（2)制得的培養液中補加 X-VIV015無血清培養基至200-240mL，同時添加 IL-2,使IL-2的濃度為I X 103U/mL，在37°C、7. 5%C02 CO2培養箱中靜置培養3天； (4) 將步驟（3)制得的培養液中補加 X-VIV015無血清培養基至IOOOmL,同時添加 IL-2， 使1!^-2的濃度為1\10%/1^，添加(：1'1^-411^13〇1^/11^、？〇-111^13〇1^/11^ ; (5) 將步驟（4)制得的培養液在37°C、7. 5%C02 CO2培養箱中靜置培養5-7天，制得自體 外周血淋巴細胞； (6)取1*106個自體淋巴細胞，離心收集，并用流式細胞儀檢測⑶4+⑶25+細胞所占百 分比。
[0013] 實驗條件2- 9,實驗操作如實驗條件1所示，各實驗條件及實驗結果如下：
【權利要求】
1. 一種自體外周血淋巴細胞CIK的培養方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 從外周血中分離外周血單個核細胞，重懸于X-VIV015無血清培養基中，使外周血 單個核細胞的細胞濃度為1 X 106個/mL，靜置培養3天； (2) 向步驟（1)制得的培養液中補加X-VIV015無血清培養基至lOOmL，同時添加IL-2， 使IL-2的濃度為1 X 103U/mL，靜置培養1天； (3) 向步驟（2)制得的培養液中補加X-VIV015無血清培養基至200-240mL，同時添加 IL-2,使IL-2的濃度為1 X 103U/mL，靜置培養3天； (4) 將步驟（3)制得的培養液中補加X-VIV015無血清培養基至lOOOmL，同時添加IL-2， 使 IL-2 的濃度為 lX103U/mL，添加 CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-lmAb 100ng/mL ; (5) 將步驟（4)制得的培養液靜置培養5-7天，制得自體外周血淋巴細胞。
2. 權利要求書1所述的一種自體外周血淋巴細胞CIK培養方法，其特征在于，其中步 驟（1)的X-VIV015無血清培養基添加以下組分：rhIFN- y 1000U/mL、胸腺法新500ng/mL、 rhIL-la 100U/mL、CD3mAb 100ng/mL、CD28mAb 100ng/mL。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)?（4)中的靜置培養條件為在 溫度為37°C、C02體積百分比為含量為7. 5%、相對飽和濕度為100%的C02培養箱中培養。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（5)還包括將制得的自體外周血淋 巴細胞經離心后，重懸于保存液中，所述保存液含有如下組分：體積百分比為20%的人血清 白蛋白5mL，0. 9wt%氯化鈉溶液定容至100mL。
【文檔編號】C12N5/0783GK104371974SQ201410573311
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】何學松, 何南海, 葉曉峰, 林曉峰, 楊東暉, 路楊 申請人:杭州阿德萊諾泰制藥技術有限公司