專利名稱：一種使用dc細胞刺激cik細胞快速增殖的方法
技術領域：
本發明屬于過繼免疫治療中細胞培養領域，尤其涉及一種使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法。
背景技術：
全國每6分鐘就有一人被確診為癌癥，每天有8550人成為癌癥患者，每七到八人中就有一人死于癌癥。未來10年，中國的癌癥發病率與死亡率仍將繼續攀升。從“癌癥縣”至IJ “癌癥村”，中國腫瘤發病的歷史與地理坐標背后，是社會發展與生活方式數十年變遷帶來的癌癥高發態勢。腫瘤是目前成脅人類健康的重大疾病之一。目前，惡性腫瘤是全球第二大致命疾病，也是中國城鄉居民第一位死亡原因，中國每年新發腫瘤患者總數約200萬，新增腫瘤患者年增長率在10%左右。《2013年報》上的發病年齡曲線提示著，中國癌癥發病呈現年輕化趨勢，乳腺癌、肺癌、結腸癌、甲狀腺癌等癌癥的發病年齡均低于此前的數據。最新數據顯示，全國35歲至39歲年齡段中，平均每10萬人中有87.07人會罹患癌癥，而在40歲至44歲年齡段中，這一數字達到了 154.53。對于導致中國癌癥患者年輕化的原因，腫瘤學家們的共識是:環境污染、不良生活方式與現代社會生活造成的精神壓力。季加孚舉例說，空氣中的PM2.5問題，是近10年才出現的。癌癥的發展需要長期的過程，因此，對于今天已經五六十歲的人來說，這種空氣污染不會明顯增加他們患肺癌的風險。但試想，一個10年前出生的人，從他小時候起，就長期呼吸這種空氣，今后得肺癌的幾率肯定要大大提高。《2013年報》顯示，中國人癌癥的發病高峰在75歲 80歲年齡組。“原先人的壽命沒有那么長，癌癥還沒有來得及發生，人就已經因其他疾病而去世了。而現在，中國70歲以上的老人越來越多了，癌癥發生的幾率也就大大增加了”。中國人口仍在不斷趨于老齡化，癌癥發病率上升的勢頭還將持續。如果對癌癥的發病率進行橫向比較，占據癌癥發病率排行榜前10位的都是發達國家，如丹麥、法國、澳大利亞等，中國的發病率尚屬中等水平，大約在八九十位。雖然手術、放化療仍是腫瘤的主要治療方法，但是，即使根治性手術也只能解決局部問題，不能避免全身轉移。放、化療存在的最大問題是其殺傷作用沒有針對性，長期的化療、放療會損傷機體的免疫系統及各器官組織的功能，甚至誘發新的癌變。更為重要的是由于腫瘤細胞缺乏特異性的抗原、腫瘤細胞的抗原調變及MHC分子表達異常等因素導致腫瘤免疫逃逸，成為腫瘤治療的一大難題。患過癌癥的病人有這樣一種說法:“80%的癌癥患者不是死于癌癥，而是死于過度化療。”這是因為，化療藥物往往有副作用，在殺死癌細胞的同時也殺死健康細胞，導致病人免疫力低下，還會造成嘔吐、脫發、局部組織壞死等等。盡管如今的化療藥物已能夠避免患者的嘔吐反應，復雜的藥物配合方案也可以降低對人體的誤傷，但這樣的進步，仍是杯水車薪。
細胞免疫治療是近幾年興起的第四種腫瘤治療方法,細胞免疫治療是指把病人的細胞從血里面分離出來，在體外用一些細胞因子，使它變成一種殺傷細胞，再回輸到血液中去，這種殺傷細胞可以識別腫瘤細胞進行殺傷。還有一種給病人直接用一些免疫制劑，像干擾素還有白介素II等等，都叫免疫治療。免疫治療指的是刺激人體自身免疫系統來抵抗癌癥的治療方法。免疫系統是人體抵抗疾病的自身的防衛系統。免疫療法也叫做生物反應修正劑(Biologic Response Modifiers)或生物療法。細胞因子誘導的殺傷細胞(CytokineInduced Killer cell,CIK)是一種新型的免疫活性細胞，它是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞，由于該細胞群中多數細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞。CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣及非MHC限制性殺瘤的優點。目前，CIK療法被認為是新一代抗腫瘤過繼免疫治療的首選方案。CIK細胞在抗腫瘤治療過程中的特點包括= (I)CIK細胞增殖速度快，可以在短期內大量擴增，滿足臨床治療的需要。(2) CIK細胞具有識別腫瘤的機制，對正常細胞無毒性作用。(3) CIK細胞殺瘤活性高，殺瘤譜廣，對多種耐藥腫瘤細胞同樣敏感。(4)CIK細胞是典型的個體化生物治療模式。它來源于自體T淋巴細胞，將這類細胞回輸后，可提高對腫瘤細胞的殺傷活性，還能提高機體的免疫能力，從而對腫瘤治療施以雙重作用。(5)殺瘤活性不受CSA、FK506等免疫抑制劑的影響。(6)對正常骨髓造血前體細胞毒性很小。(7)能抵抗腫瘤細胞引發的效應細胞Fas-FasL凋亡。(8)由于CIK細胞是活化的自體細胞，應用起來非常安全。樹突狀細胞(Dendritic Cells，DC)源自骨髓中的前體細胞，是已知機體內抗原呈遞能力最強的細胞，比普通抗原呈遞細胞強1000倍，它在負載腫瘤抗原后，能刺激T淋巴細胞分化為具有抗腫瘤活性的細胞毒性T淋巴細胞，對腫瘤細胞實施特異性殺傷。DC細胞可通過多種機制發揮其抗腫瘤免疫作用。(I)誘導細胞免疫；DC攝取腫瘤抗原后，將其加工處理為肽-MHC分子復合物表達于細胞表面，進而與T細胞表面的T細胞受體(T cell receptor, TCR)結合，同時與DC表面高表達的CD80、CD86等共刺激分子協同作用下，共同激活T細胞,啟動⑶8+細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)介導的免疫應答。(2)增強體液免 疫一方面，DC通過促進抗原特異性⑶4+輔助性T細胞(HelperT Cell, Th)的產生，促進抗體生成；另一方面，DC直接作用于B細胞，促進免疫球蛋白的分泌。DC通過I型干擾素(Interferon，IFN)的分泌，直接誘導初始和記憶B細胞分化為漿細胞，產生大量免疫球蛋白IgM。(3)分泌多種細胞因子或趨化因子；DC分泌的IL-12可誘導ThO細胞向Thl細胞分化，啟動細胞性免疫應答，抑制IL-12的產生則促進IL-10的分泌及Th2細胞極化。IL-15以膜結合方式存在于DC表面，顯著刺激次級淋巴器官中自然殺傷細胞的增殖。DC還可分泌一種特異性趨化因子，選擇性趨化初始型T細胞，增強對免疫應答的誘導作用。(4)DC通過與某些腫瘤細胞相互接觸，直接抑制腫瘤細胞的生長。(5)腫瘤抗原致敏的DC可釋放一種具有抗原遞呈能力的囊泡小體exosomes,該小體內含有大量MHC-1、II類分子。然而，DC細胞成熟慢、生存期短、CIK細胞的擴增培養時間較長，兩者單獨培養存在一定的缺陷。
發明內容
本發明實施例的目的在于提供一種使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法，旨在解決DC細胞成熟慢、生存期短，CIK細胞的擴增培養時間較長的問題。
本發明實施例是這樣實現的，一種使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法，該方法包括以下步驟:外周血單核細胞PBMC的分離；細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導培養；CIK細胞誘導培養；DC細胞誘導培養；CIK細胞表型⑶3+CD56+的檢測。進一步、，PBMC是從健康人外周血白細胞經Ficoll密度梯度離心獲得，PBMC的分離具體步驟如下:(I)事先預熱的生理鹽水與血站取來的外周血白細胞1:1稀釋，移液管吹打混勻；(2)將40mL淋巴細胞分離液與Ficoll等量均分放入2個50mL刻度離心管，每管20mL ；(3)將步驟(I)中50mL液體等量均分緩慢滴加放入步驟(2)已加入Ficoll的2個離心管中，滴加過程中注意用力均勻,加入的速度也要均勻,避免破壞Ficoll-外周血界面的完整，800g條件下,離心20min ；(4)離心完成后，管內液體分為三層，移液管棄去上層15mL液體后吸取上、中層界面處白色云霧層狹窄帶5-10mL放入步驟(5)準備的50mL刻度離心管中，混勻，1500rpm，離心 8min ；`(5)棄上清，再加入30mL生理鹽水，混勻，1200rpm,離心6min ；(6)棄上清，30mL培養基重懸細胞，吹打混勻，取樣ΙΟΟμ I至1.5mLEP管，加入400 μ I生理鹽水和500 μ I typan blue染色計數，30mL培養基重懸細胞液，1000r/min,離心6min，棄上清，獲得PBMC。進一步，細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導培養具體方法如下:步驟一、調制IL-2和IFN-Y:分別用D-PBS溶解后，調節至1000IU/μ 1，4°C保存；步驟二、配包被液:50mL離心管中加入D-PBS20mL，加入RetroNectin250y 1，終濃度12.5ug/mL，愛歐山CD3抗體100 μ 1，終濃度5ug/mL ；步驟三、將包被液加入T175cm2培養瓶，平放，混勻，4°C，避光，過夜。進一步，CIK細胞誘導培養的具體方法為:3)清洗培養瓶:取出包被過的培養瓶，棄包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mL
培養基洗一次；4)接種細胞:用40mL含2%胎牛血清的細胞培養液GT-T551重懸步驟2)所獲得PBMC細胞，并將獲得PBMC細胞加入已包被的T175cm2培養瓶，添加IL-240 μ 1，終濃度1000IU/mL, IFN- Y 40 μ 1，終濃度 1000IU/mL ；3)將接種后的培養瓶置37°C，5% CO2培養箱培養。進一步，DC細胞誘導培養的具體方法為:I)第零天，分血，分兩組，一組貼壁過夜，另一組貼壁45分鐘后，棄掉貼壁細胞剩下的細胞繼續貼壁過夜，包板準備培養CIK，75mL培養瓶中加入IOmL包被液；2)第一天，早上將未貼壁細胞凍存，凍存液-LMD: DMSO:細胞+培養液=1:1: 8，剩余貼壁細胞+AM-V+GM-CSF 和 IL-4，各 lOOng/ml ;3)第三天，補充因子至全量；4)第六天抗原負載-采用攜帶抗原TERT的5型腺病毒載體進行感染；5)第七天:刺激 DC 成熟，100ng/ml 的 TNF- a，100ng/ml 的 IL-6 和 25ng/ml 的IL-1 β ；6)第八天取樣4-6 X IO6細胞測DC表型同時進行特異性成熟DC與CIK細胞進行共培養，DC細胞與CIK細胞的數量比值為1: 10，共培養時間為7天，每隔一天換液AM-V，調整IL-2的濃度為20IU/mL ；7)第十六天 收取CIK細胞，計數，測細胞表型。本發明提供的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法在短期內使得CIK細胞的數量得到大幅擴增，同時保證CIK細胞(Cytokine-1nduced Killer Cells)表面的CD3+CD56+的比例不會發生較大改變，但雙陽性比例會有所提高，殺傷功能會一定程度上的到增強，明顯縮短了 CIK的擴增時間，同時提高了增殖倍數，具有重要的科研價值。
圖1是本發明實施例提供的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法流程圖；圖2是本發明實施例提供的流式細胞術檢測三種DCs表型⑶80、⑶83、⑶86和CDl α不意圖；圖3是本發明實施例提供的DC-CIK共培養圖片；圖4是本發明實施例提供的CIK經DC刺激前后表型流式細胞檢測結果對比示意圖。左圖為CIK未經刺激時⑶3 (橫坐標)⑶56 (縱坐標)的流式分析圖，其中⑶3⑶56雙陽性率為1.2%右圖為CIK經DC刺激時⑶3⑶56的流式分析圖，經刺激后⑶3⑶56雙陽性率為35.9%，說明使用DC刺激CIK后CIK的⑶3⑶56表型雙陽性比例大大提高，殺傷功能也隨之提聞。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。圖1示出了本發明提供的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖方法的流程。為了便于說明，僅僅示出了與本發明相關的部分。如圖1所示，本發明的實施例提供的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法包括以下步驟:外周血單核細胞PBMC的分離；細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導培養；CIK細胞誘導培養；DC細胞誘導培養；
CIK細胞表型⑶3+CD56+的檢測。作為本發明實施例的一優化方案，PBMC是從健康人外周血白細胞經Ficoll密度梯度離心獲得，PBMC的分離具體步驟如下:(I)事先預熱的生理鹽水與血站取來的外周血白細胞1:1稀釋，移液管吹打混勻；(2)將40mL淋巴細胞分離液與Ficoll等量均分放入2個50mL刻度離心管，每管20mL ；(3)將步驟(I)中50mL液體等量均分緩慢滴加放入步驟⑵已加入Ficoll的2個離心管中，滴加過程中注意用力均勻,加入的速度也要均勻,避免破壞Ficoll-外周血界面的完整，800g條件下,離心20min ；(4)離心完成后，管內液體分為三層，移液管棄去上層15mL液體后吸取上、中層界面處白色云霧層狹窄帶5-10mL放入步驟(5)準備的50mL刻度離心管中，昆勻，1500rpm，離心 8min ；(5)棄上清，再加入30mL生理鹽水，混勻，1200rpm,離心6min ；(6)棄上清，30mL培養基重懸細胞，吹打混勻，取樣ΙΟΟμ I至1.5mLEP管，加入400 μ I生理鹽水和500 μ I typan blue染色計數，30mL培養基重懸細胞液，1000r/min,離心6min，棄上清，獲得PBMC。作為本發明實施例的一優化方案，細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導培養具體方法如下:步驟一、調制IL-2和IFN-Y:分別 用D-PBS溶解后，調節至1000IU/μ 1，4°C保存；步驟二、配包被液:50mL離心管中加入D-PBS20mL，加入RetroNectin250y 1，終濃度12.5ug/mL，愛歐山CD3抗體100 μ 1，終濃度5ug/mL ；步驟三、將包被液加入T175cm2培養瓶，平放，混勻，4°C，避光，過夜。作為本發明實施例的一優化方案，CIK細胞誘導培養的具體方法為:5)清洗培養瓶:取出包被過的培養瓶，棄包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mL培養基洗一次；6)接種細胞:用40mL含2%胎牛血清的細胞培養液GT-T551重懸步驟2)所獲得PBMC細胞，并將獲得PBMC細胞加入已包被的T175cm2培養瓶，添加IL-240 μ 1，終濃度1000IU/mL, IFN- Y 40 μ 1，終濃度 1000IU/mL ；3)將接種后的培養瓶置37°C，5% CO2培養箱培養。作為本發明實施例的一優化方案，DC細胞誘導培養的具體方法為:I)第零天，分血，分兩組，一組貼壁過夜，另一組貼壁45分鐘后，棄掉貼壁細胞剩下的細胞繼續貼壁過夜，包板準備培養CIK，75ml培養瓶中加入IOml包被液；2)第一天，早上將未貼壁細胞凍存，凍存液-LMD: DMSO:細胞+培養液=1:1: 8，剩余貼壁細胞+AM-V+GM-CSF 和 IL-4，各 100ng/ml ;3)第三天，補充因子至全量；4)第六天抗原負載-采用攜帶抗原TERT的5型腺病毒載體進行感染；5)第七天:刺激 DC 成熟，100ng/ml 的 TNF- a，100ng/ml 的 IL-6 和 25ng/ml 的IL-1 β ；
6)第八天取樣4-6 X IO6細胞測DC表型同時進行特異性成熟DC與CIK細胞進行共培養，DC細胞與CIK細胞的數量比值為1: 10，共培養時間為7天，每隔一天換液AM-V，調整IL-2的濃度為20IU/mL ；7)第十六天收取CIK細胞，計數，測細胞表型。下面結合附圖1-4及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。從血站獲得外周血白細胞調制IL-2和IFN- Y:分別用D-PBS溶解后，調節至1000IU/μ 1，4 V保存。配包被液:50mL離心管中加入D_PBS20mL，加入RetroNectin250 μ I (終濃度 12.5ug/mL)，愛歐山 CD3 抗體 100 μ I (終濃度 5ug/mL);將包被液加入T175cm2培養瓶，平放，混勻，4°C，避光，過夜；(I)事先預熱的生理鹽水與血站取來的外周血白細胞1:1稀釋，移液管吹打混勻；(2)將40mL淋巴細胞分離液與Ficoll等量均分放入2個50mL刻度離心管，每管20mL ；(3)將步驟(I)中50mL液體等量均分緩慢滴加放入步驟⑵已加入Ficoll的2個離心管中。滴加過程中注意用力均勻,加入的速度也要均勻,盡量避免破壞Ficoll-外周血界面的完整，800g條件下，離心20min ；(4)離心完成后，管內液體分為三層，移液管棄去上層約15mL液體后吸取上、中層界面處白色云霧層狹窄帶(約5-10mL)放入50mL刻度離心管中，混勻，1500rpm,離心8min ；(5)棄上清，再加入30mL生理鹽水，混勻，1200rpm,離心6min ；(6)棄上清，30mL培養基重懸細胞，吹打混勻，取樣100μ I至1.5mLEP管，加入400 μ I生理鹽水和500 μ I typan blue染色計數，30mL培養基重懸細胞液，1000r/min,離心6min。棄上清，獲得PBMC。DC細胞誘導培養:第零天，分血，分兩組，一組貼壁過夜，另一組貼壁45分鐘后，棄掉貼壁細胞剩下的細胞繼續貼壁過夜，包板準備養CIK (75ml培養瓶中加入IOml包被液)；第一天，早上將未貼壁細胞凍存(凍存液-LMD: DMSO:細胞+培養液=I: I: 8)，剩余貼壁細胞+AM-V+GM-CSF和IL-4(各100ng/ml);第三天，補充因子至全量；第六天抗原負載-采用攜帶抗原TERT的5型腺病毒載體進行感染；第七天:刺激DC 成熟，100ng/ml 的 TNF- a，100ng/ml 的 IL-6 和 25ng/ml 的 IL-1 β ;第八天取樣 4-6 X IO6細胞測DC表型同時進行特異性成熟DC與CIK細胞進行共培養，DC細胞與CIK細胞的數量比值為1: 10，共培養時間為7天，每隔一天換液AM-V，調整IL-2的濃度為20IU/mL。第十六天收取CIK細胞，計數，測CIK細胞⑶3⑶56表型。CIK未經刺激時⑶3 (橫坐標)⑶56(縱坐標)的流式分析圖，其中⑶3⑶56雙陽性率為1.2%，CIK經DC刺激時⑶3⑶56的流式分析圖，經刺激后⑶3⑶56雙陽性率為35.9%，說明使用DC刺激CIK后CIK的⑶3⑶56表型雙陽性比例大大提高，殺傷功能也隨之提高。以上所 述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 外周血單核細胞PBMC的分離； 細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導培養； CIK細胞誘導培養； DC細胞誘導培養； CIK細胞表型⑶3+⑶56+的檢測。
2.如權利要求I所述的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法，其特征在于，PBMC是從健康人外周血白細胞經Ficoll密度梯度離心獲得，PBMC的分離具體步驟如下 (1)事先預熱的生理鹽水與血站取來的外周血白細胞I: I稀釋，移液管吹打混勻； (2)將40mL淋巴細胞分離液與Ficoil等量均分放入2個50mL刻度離心管，每管20mL； (3)將步驟(I)中50mL液體等量均分緩慢滴加放入步驟(2)已加入Ficoll的2個離心管中，滴加過程中注意用力均勻，加入的速度也要均勻，避免破壞Ficoll-外周血界面的完整,800g條件下,離心20min ； (4)離心完成后，管內液體分為三層，移液管棄去上層15mL液體后吸取上、中層界面處白色云霧層狹窄帶5-10mL放入步驟(5)準備的50mL刻度離心管中，混勻，1500rpm，離心8min ； (5)棄上清，再加入30mL生理鹽水，混勻，1200rpm,離心6min； (6)棄上清，30mL培養基重懸細胞，吹打混勻，取樣100μ I至I. 5mLEP管，加入400 μ I生理鹽水和500 μ I typan blue染色計數,30mL培養基重懸細胞液，1000r/min,離心6min,棄上清，獲得PBMC。
3.如權利要求I所述的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法，其特征在于，細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導培養具體方法如下 步驟一、調制IL-2和IFN-Y :分別用D-PBS溶解后，調節至IOOOIU/μ 1，4°C保存； 步驟二、配包被液50mL離心管中加入D-PBS20mL，加入RetroNectin250y 1，終濃度12. 5ug/mL，愛歐山 CD3 抗體 100 μ 1，終濃度 5ug/mL ； 步驟三、將包被液加入T175cm2培養瓶，平放，混勻，4°C，避光，過夜。
4.如權利要求I所述的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法，其特征在于，CIK細胞誘導培養的具體方法為 1)清洗培養瓶取出包被過的培養瓶，棄包被液，20mLPBS洗一次，然后再用20mL培養基洗一次； 2)接種細胞用40mL含2%胎牛血清的細胞培養液GT-T551重懸步驟2)所獲得PBMC細胞，并將獲得PBMC細胞加入已包被的T175cm2培養瓶，添加IL-240y 1，終濃度1000IU/mL, IFN- Y 40 μ 1，終濃度 1000IU/mL ； 3)將接種后的培養瓶置37°C，5%CO2培養箱培養。
5.如權利要求I所述的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法，其特征在于，DC細胞誘導培養的具體方法為 I)第零天，分血，分兩組，一組貼壁過夜，另一組貼壁45分鐘后，棄掉貼壁細胞剩下的細胞繼續貼壁過夜，包板準備培養CIK，75ml培養瓶中加入IOml包被液；2)第一天，早上將未貼壁細胞凍存，凍存液-LMD DMSO :細胞+培養液=1 : I : 8，剩余貼壁細胞 +AM-V+GM-CSF 和 IL-4，各 100ng/mL ； 3)第三天，補充因子至全量； 4)第六天抗原負載-采用攜帶抗原TERT的5型腺病毒載體進行感染； 5)第七天刺激DC 成熟，100ng/ml 的 TNF- a，100ng/ml 的 IL-6 和 25ng/ml 的 IL-1 β ； 6)第八天取樣4-6X IO6細胞測DC表型同時進行特異性成熟DC與CIK細胞進行共培養，DC細胞 與CIK細胞的數量比值為I : 10，共培養時間為7天，每隔一天換液AM-V，調整IL-2的濃度為20IU/mL ； 7)第十六天收取CIK細胞，計數，測細胞表型。
全文摘要
本發明公開了一種使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法，該方法包括以下步驟外周血單核細胞PBMC的分離；細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導培養；CIK細胞誘導培養；DC細胞誘導培養；CIK細胞表型CD3+CD56+的檢測。本發明提供的使用DC細胞刺激CIK細胞快速增殖的方法在短期內使得CIK細胞的數量得到大幅擴增，同時保證CIK細胞表面的CD3+CD56+的比例不會發生較大改變，明顯縮短了CIK的擴增時間，同時提高了增殖倍數，具有重要的科研價值。
文檔編號C12N5/0783GK103255105SQ201310210949
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月31日 優先權日2013年5月31日
發明者陳晚華, 孫慶文, 曲平波, 王延春, 顏廷驥, 張俊藝 申請人:陳晚華