專利名稱：季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物疫苗制備領域，涉及利用經檢定證明為WHO推薦的病毒株或相似株的 Hmi 型IVR-148 ；H3N2 型NYMC X-175C ；B 型B/Florida/412006 流感病毒株制備用于預防季節性流感的流感病毒裂解疫苗的新工藝。
背景技術：
流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，主要通過感染者含有病毒的飛沫以氣溶膠的形式傳染給易感者，具有高度傳染性，容易引發大規模流行。上一世紀以來已先后發生四次全球流感大流行，流感大流行具有發病率和病死率高，傳播迅速和波及范圍廣的特點。僅1918年“西班牙”流感的大流行就導致至少2000萬人死亡，超過第一次世界大戰的死亡人數。流感流行帶來了巨大的疾病負擔，造成了較嚴重的社會影響。據2002年世界衛生組織公布的數據，估計全球每年流感病例達6億 12億。 我國是流感的多發地，每年流感發病數估計可達上千萬人。1957年、1968年和1977年三次大流行毒株均首發于我國。1997年在中國香港特別行政區人群中發現禽流感H5W感染病例。1988年以來，世界衛生組織每年公布的流感疫苗病毒株約一半來自中國。中國已成為世界流感監測的前哨。研究表明流感病毒是一種很容易變異的病毒，當變異達到一定程度，從而導致一種新的流感病毒產生時，因人類不具備相應的抗體，而易引發大流行。流感病毒屬于正黏病毒科，典型毒粒呈球形，直徑約為80-120nm，病毒最外部為病毒包膜，病毒包膜由基質蛋白、雙層類脂膜和糖蛋白突起所組成。包膜內部為核衣殼，核衣殼包裹著病毒的遺傳物質一一單股負鏈RNA，其RNA共分為8個節段。基因組分節段是造成同型不同毒株間易產生基因重配的主要原因。且病毒的RNA聚合酶不具有糾錯功能，所以病毒基因易發生變異。若兩種不同亞型毒株感染同一個細胞，使其基因組發生重新排列， 可引起抗原轉變，導致新亞型的出現。另外，由于基因組自發的點突變，常引起抗原漂移。根據流感病毒核蛋白NP和膜蛋白Ml抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒可分為A、B、C三型。A型流感病毒根據其表面血凝素和神經氨酸酶結構及其基因特性的不同又分為許多亞型，目前已發現的血凝素有15個亞型(Hl 15)，神經氨酸酶有9個亞型 (Ni 9)，它們均為位于病毒表面的糖蛋白，其中血凝素Hl 3亞型和神經氨酸酶m 2 亞型的流感病毒常見于人類感染。對于流感疫苗的研制，全世界進行開發的疫苗類型包括全病毒型、裂解型、亞單位型。佐劑包括有氫氧化鋁、MF59。主要免疫途徑是肌肉注射。目前經過WHO認可的工藝流程制備的疫苗主要有傳統的全病毒滅活疫苗、病毒裂解疫苗和新一代的亞單位疫苗及減毒活疫苗。在以往的流感疫苗研制過程中，不少科學研究者求助于基因工程疫苗如重組疫苗、 多肽疫苗、核酸疫苗的研究，然而該種疫苗較低的免疫原性與保護率限制了其應用。基于目前防控新型流感疫情的需要，世界各國的研究單位仍主要致力于這三種傳統疫苗的制備。裂解型流感滅活疫苗是在流感全病毒滅活疫苗的基礎上，通過選擇適當的裂解劑和裂解條件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，經過不同的生產工藝去除裂解劑和純化有效抗原成分制備而成的。按照歷史上流感大流行的規律，理論上最近幾年應該進行這方面的準備，因此從 WHO到國際上許多國家如美、歐等都在進行從策略上到技術上的準備。包括疾病的監測及預警、醫療能力的儲備包括抗病毒藥物的儲備等；疫苗部分包括生產能力的評估、資源的充分利用、生產用毒株的可用性、生產周期、大流行疫苗的注冊即國家管理部門系統的準備、疫苗的儲備及供應等等。中國是一個流感大國，參照國際上的信息及我國具體情況，國家也制定出的應對流感大流行的策略和措施。其中生產技術的儲備，提高生產流感疫苗能力是必不可少的重要部分。目前國內的生產能力要在大流行時提供足夠的疫苗還有很大差距，因此我公司對流感病毒裂解疫苗的研發具有較高的社會意義。我國絕大多數流感病毒疫苗廠家的產品中添加硫柳汞防腐劑，本發明研制的流感病毒裂解型疫苗，不含硫柳汞防腐劑，其采用更為安全的2-苯氧乙醇作為防腐劑。另外由于本發明采用了復合裂解劑和新的純化工藝，最終制備得到了雜質含量更少、HA含量更高的卵清蛋白、內毒素含量、總蛋白含量等質量指標遠低于國家標準的流感病毒裂解疫苗。臨床前動物試驗結果表明，采用本發明的方法制備得到的流感病毒裂解型疫苗免疫原性高， 具有較好的安全性。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種副反應更小，免疫原性更高，接種更安全，接種人群更廣泛的新季節性流感裂解疫苗。本發明的另一目的是提供一種能高效低成本大量制備上述季節性流感裂解疫苗的制備方法。本發明的季節性流感裂解疫苗包括季節性流感免疫抗原及疫苗佐劑，其中流感免疫抗原為WHO推薦并經國家藥品管理部門認可的Hmi型IVR-148 ；H3N2型NYMC X-175C ； B型B/Florida/412006流行性感冒病毒株或相似株毒種的血凝素HA，各型HA含量為30 36ug/ml，所述的疫苗佐劑為氫氧化鋁。本發明的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法包括按順序實施的建立病毒種子批、接種與培養病毒、收獲病毒、對病毒進行滅活處理、超濾濃縮、離心純化、柱層析純化、裂解病毒、二次純化、過濾除菌、半成品配制的步驟，其特征在于，其中的離心純化步驟采用的是蔗糖速率區帶離心法，包括將濃縮后的病毒液以不超過離心腔容積50%的上樣量，在蔗糖溶液中以30000r/min區帶離心3小時；其中的建立病毒種子批步驟包括(1)主代種子庫建立由索取的原始毒種傳代制備，將毒種復溶并稀釋，取稀釋度為IO3 IO5的病毒液接種9 11日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量0. 2ml/胚，33 35°C培養48 72小時后收獲尿囊液并混合，加等量脫脂牛奶后分裝為0. 2ml/支凍干后保存于-60°C以下，經檢定合格即為主代種子批；自原始毒種到制成主代毒種傳代不得超過2代；(2)工作種子庫建立由主種子批毒種傳代制備，將主代種子復溶，取稀釋度為IO3 IO5的病毒液接種9 11日齡 SPF雞胚尿囊腔，接種量0. 2ml/胚，33 35°C培養48 72小時后收獲尿囊液并混合，分裝后凍存于-60°C以下，經檢定合格即為工作種子批，自主代毒種到制成工作種子傳代不得超過2代。在蔗糖溶液中以30000r/min區帶離心3小時后，將收集的病毒液用截留分子量為 300KD的超濾膜進行超濾透析，以去除蔗糖，然后再進行接下來的柱層析步驟。二次純化包括蔗糖密度梯度離心和超濾濃縮步驟，蔗糖密度梯度離心包括將病毒裂解物以不超過離心腔容積50%的量上樣，在蔗糖溶液中以30000r/min區帶離心2小時。二次純化中的超濾濃縮步驟是將收集的離心后的裂解物用IOKD的超濾膜進行超濾濃縮，以去除蔗糖和進一步去除裂解劑。采用Triton X-100和去氧膽酸鈉裂解病毒，Triton X-100及去氧膽酸鈉的終濃度均為0. 3%，裂解過程持續60 150分鐘。用甲醛進行滅活處理，將病毒尿囊液加入終濃度為0. 02%的甲醛，置2 8°C條件下滅活16 M小時。滅活后的收獲液用截留分子量為300KD的超濾膜超濾濃縮30-50倍，濃縮液取樣進行細菌內毒素含量。柱層析采用 kphroSe-4FF凝膠層析純化，洗脫液為0. 01mol/L的PBS，收集第一峰。本發明的方法制備得到的疫苗不含硫柳汞防腐劑，其中的卵蛋白含量為不高于300ng/ml，內毒素含量為小于 20EU/ml，其中的病毒是 Hmi 型IVR_148 ；H3N2 型NYMC X-175C ；B 型B/Florida/412006 流感病毒株，來源于英國國立生物制品研究所。單價原液檢定一般包括(1)鑒別試驗用相應(亞)型特異性免疫血清進行單向免疫擴散試驗，應產生特異性沉淀反應， 證明樣品的抗原性與推薦病毒株一致。(2)無菌檢查按《中國藥典》三部2010版附錄XII A “無菌檢查法”測定，符合規定。(3)病毒滅活驗證試驗將滅活后供試品按原倍、1 10和1 100稀釋后分組接種于9 11日齡雞胚尿囊腔中，每胚接種0. anl，每個稀釋度接種10個雞胚，置33 35°C培養72小時。M小時內死亡的不計數，每組雞胚至少存活80%。自存活雞胚中每胚取0. 5ml尿囊液，按組混合后， 再盲傳一代，每組接種于9 11日齡雞胚尿囊腔中，每胚0. anl，每個稀釋度接種10個雞胚，置33 35°C培養72小時，取尿囊液直接進行血凝試驗，結果應不出現血凝反應。(4)血凝素含量采用單向免疫擴散法測定，各型原液的血凝素含量均應不低于90μ g/ml。制備含病毒標準血清的1. 5%瓊脂糖凝膠板，打孔(孔徑為2. 5 3mm)，將標準抗原和待檢樣品每孔分別加入10 μ 1，置20 25°C擴散至少18小時，用PBS浸泡1小時后干燥、染色、脫色。 準確測量標準抗原和待檢樣品所形成的沉淀環直徑，以標準抗原形成的沉淀環的直徑對其相應抗原含量進行直線回歸，求出直線回歸方程，代入供試品的沉淀環直徑，即可得到原液血凝素的含量。(5)蛋白質含量按《中國藥典》三部2010版附錄VI B “蛋白測定法(Lowry法)”測定，應不高于疫苗血凝素含量4倍。半成品檢定包括(1)無菌檢查按《中國藥典》三部2010版附錄XII A “無菌檢查法”測定，符合規定。(2)血凝素含量
各型流感毒株血凝素含量應為配制量的80% 120%。(3)蛋白質含量按《中國藥典》三部2010版附錄VI B “蛋白測定法(Lowry法)”測定，應不高于 350 μ g/ml，且不超過疫苗血凝素含量4倍。(4)卵清蛋白含量采用酶聯免疫法進行檢測，應不高于300ng/ml。(5) Triton X-100 殘留量Triton X-100殘留量應不高于260 μ g/ml。用反相高效液相色譜檢測Triton x-100殘留量(6)去氧膽酸鈉殘留量去氧膽酸鈉殘留量應不高于100 μ g/ml。將供試品與去氧膽酸鈉標準溶液置酸性條件下，于387nm波長處測定A值，采用對照品法計算供試品中去氧膽酸鈉的殘留量。成品檢定包括(1)鑒別試驗用相應(亞)型特異免疫血清進行單向免疫擴散試驗，應產生特異性沉淀反應，證明樣品的抗原性與推薦病毒株一致。(2)外觀檢查為無色或微乳白色液體，無異物。(3)裝量按《中國藥典》三部2010版附錄V F “最低裝量檢查法”檢查，應不低于標示量。(4)pH 值按《中國藥典》三部2010版附錄V A “pH值測定法”測定，應為6. 8-8. 0。( 游離甲醛含量按《中國藥典》三部2010版附錄VI L “游離甲醛測定法”測定，應不高于30 μ g/ ml ο(6)血凝素含量各型流感毒株血凝素含量應為配制量的80% 120%。(7)蛋白質含量按《中國藥典》三部2010版附錄VI B “蛋白測定法(Lowry法)”測定，應不超過 350 μ g/ml，且不超過疫苗血凝素含量的4倍。(8)卵清蛋白含量采用酶聯免疫法進行檢測，卵清蛋白含量應不高于300ng/ml。(9) 2-苯氧乙醇含量采用液相色譜法，2-苯氧乙醇含量應為5 士 ang/ml。(10)無菌檢查按《中國藥典》三部2010版附錄XII A “無菌檢查法”測定，符合規定。(11)細菌內毒素檢查按《中國藥典》三部2010版附錄XII E “細菌內毒素檢查法”測定，應小于20EU/ ml ο
(12)異常毒性檢查按《中國藥典》三部2010版附錄XII F “異常毒性檢查法”檢查，應符合規定。(13)抗生素殘留量采用酶聯免疫法，抗生素殘留量不高于20ng/劑。與現有技術相比，本發明的制備方法具有以下優點1、將區帶離心純化和分子篩層析柱純化進行組合，同時在病毒裂解后進行包括區帶離心純化步驟的二次純化，通過上述純化步驟的組合，本領域技術人員在相對簡陋的實驗條件下能夠制備得到雜質更少，HA含量更高的裂解疫苗。2、本品純度高，內毒素、卵清蛋白標準遠遠優于《中國藥典》2010版及《歐洲藥典》 的要求。3、濃縮效率及回收率好，成本低，效率高，操作容易。4、采用復合裂解劑，裂解更完全，有效保護抗原。5、病毒滴度高，平均1. 5個雞胚就能生產出1人份疫苗。
具體實施例方式實施例1(1)選取菌種用 HlNl 型IVR-148 ；H3N2 型NYMC X-175C ；B 型B/ Florida/412006流感病毒株，來源于英國國立生物制品研究所。(2)鑒定毒種a)材料①將菌種在雞胚中傳二代(P》。②血清禽流感病毒Hmi型IVR_148 ； H3N2型NYMC X-175C ；B型B/Florida/412006流感病毒株，來源于英國國立生物制品研究所。b)方法①血凝抑制試驗和單向免疫擴散試驗按常規法。②病毒滴度測定按常規雞胚感染法，每稀釋度接種4只雞胚。③無菌試驗和外源因子檢查按現行版《中國藥典》的要求測定。④毒種免疫源性測定病毒經滅活、濃縮、純化后，用不同劑量的血凝素經大腿肌肉接種20 25kg家兔4只，14d后加強1針，首針后28d采血，測定血凝抑制抗體和中和抗體。⑤血凝素序列測定根據Hmi型IVR-148 ；H3N2型NYMC X-175C ；B型B/ Florida/412006的核酸序列，設計一對特異性引物，經RT-PCR擴增H5基因，通過T-A克隆， 將其插入載體，轉導大腸埃希菌，篩選陽克隆，提取質粒，測序。⑥經檢定證明為WHO推薦的病毒株或相似株(3)種子批的建立a、主代種子庫建立由索取的原始毒種傳代制備，將毒種復溶并稀釋，取稀釋度為IO5的病毒液接種11 日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量0. 2ml/胚，34°C培養50小時后收獲尿囊液并混合，加等量脫脂牛奶后分裝約0. aiil/支，凍干后保存于-70°C，經檢定合格即為主代種子批。自原始毒種到制成主代種子傳代2代。
b、工作種子庫建立由主種子批毒種傳代制備，將主代種子復溶，取稀釋度為IO3 IO5的病毒液接種 11日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量0. 2ml/胚，34°C培養50小時后收獲尿囊液并混合，分裝后凍存于-70°C，經檢定合格即為工作種子批。自主代毒種到制成工作種子傳代2代。自WHO獲得毒種代次為基礎到制成工作種子傳代3代。至成品苗的病毒總代次為 4代。(4)病毒接種與培養取工作種子批毒種，用0. 01mol/L的PBS稀釋為10_4，將稀釋后的病毒接種于雞胚尿囊腔內，每胚0. anl，接種后置34°C培養50小時。工作種子批毒種融化后若一次未用完， 不得再凍結使用。(5)病毒收獲篩選活胚置4°C冷胚16小時，吸取外觀澄清的尿囊液于無菌容器中，取樣進行尿囊收獲液檢定。(6)滅活病毒尿囊液加入終濃度為0. 02%的甲醛約200ug/ml，置4°C條件下滅活18小時，
滅活到期后每個滅活容器應立即進行取樣，分別進行病毒滅活驗證試驗，進行細菌內毒素含量測定。(7)病毒收獲液超濾濃縮滅活后的收獲液用截留分子量為300KD的超濾膜超濾濃縮50倍，濃縮液取樣進行細菌內毒素含量。(8)蔗糖速率區帶離心濃縮后的病毒液以不超過離心腔容積50%的上樣量，在蔗糖溶液中以30000r/ min區帶離心3小時，將收集的病毒液用截留分子量為300KD的超濾膜進行超濾透析，以去
除蔗糖。(9)柱層柱用kphroSe-4FF凝膠層析純化，洗脫液為0. 01mol/L的PBS，收集第一峰。(10)病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為0.3% Triton X-100及0. 3%去氧膽酸鈉，裂解120 分鐘。(11)再純化病毒裂解物以不超過離心腔容積50%的量上樣，在蔗糖溶液中以30000r/min區帶離心2小時，收集離心后的裂解物用10KD的超濾膜進行超濾濃縮，以去除蔗糖和進一步去除裂解劑，超濾后的病毒裂解液取樣進行細菌內毒素含量和微生物限度檢查，微生物限度檢查菌落數小于10CFU/ml。(12)過濾除菌(原液)純化后的裂解物經除菌過濾后，即為單價原液。(13)單價原液檢定(14)半成品配制用0. 01mol/L PBS將各型經檢定合格的單價原液稀釋至血凝素含量為36 μ g/ml，加入2-苯氧乙醇至終濃度為5mg/ml，即為半成品。實施例2(1)選取菌種用 HlNl 型IVR-148 ；H3N2 型NYMC X-175C ；B 型B/ Florida/412006流感病毒株，來源于英國國立生物制品研究所。(2)鑒定毒種a)材料①將在雞胚中傳二代(P2)。②血清Hmi型IVR_148 ； H3N2型NYMC X-175C ；B型B/Florida/412006流感病毒株，來源于英國國立生物制品研究所。b)方法:①血凝抑制試驗和單向免疫擴散試驗按常規法。②病毒滴度測定按常規雞胚感染法，每稀釋度接種4只雞胚。③無菌試驗和外源因子檢查按現行版《中國藥典》的要求測定。④毒種免疫源性測定病毒經滅活、濃縮、純化后，用不同劑量的血凝素經大腿肌肉接種25kg家兔4只，14d后加強1針，首針后28d采血，測定血凝抑制抗體和中和抗體。⑤血凝素序列測定根據Hmi型IVR-148 ；H3N2型NYMC X-175C ；B型B/ Florida/412006的核酸序列，設計一對特異性引物，經RT-PCR擴增H5基因，通過T-A克隆， 將其插入載體，轉導大腸埃希菌，篩選陽克隆，提取質粒，測序。⑥經檢定證明為WHO推薦的病毒株或相似株(3)種子批的建立a、主代種子庫建立由索取的原始毒種傳代制備，將毒種復溶并稀釋，取稀釋度為IO3的病毒液接種9 日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量0. 2ml/胚，35°C培養52小時后收獲尿囊液并混合，加等量脫脂牛奶后分裝約0. aiil/支，凍干后保存于-60°C，經檢定合格即為主代種子批。自原始毒種到制成主代種子傳代共2代。b、工作種子庫建立由主種子批毒種傳代制備，將主代種子復溶，取稀釋度為IO3的病毒液接種9日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量0. 2ml/胚，35°C培養52小時后收獲尿囊液并混合，分裝后凍存于-60°C，經檢定合格即為工作種子批。自主代毒種到制成工作種子傳代2代。自WHO獲得毒種代次為基礎到制成工作種子傳代4代。至成品苗的病毒總代次為 5代。(4)病毒接種與培養取工作種子批毒種，用0. 01mol/L的PBS稀釋為10_4，將稀釋后的病毒接種于雞胚尿囊腔內，每胚0. anl，接種后置35°C培養52小時。工作種子批毒種融化后若一次未用完， 不得再凍結使用。(5)病毒收獲篩選活胚置4°C冷胚16小時，吸取外觀澄清的尿囊液于無菌容器中，取樣進行尿囊收獲液檢定。(6)滅活病毒尿囊液加入終濃度為0. 02%的甲醛約200ug/ml，置4°C條件下滅活18小時， 滅活到期后每個滅活容器應立即進行取樣，分別進行病毒滅活驗證試驗，進行細菌內毒素含量測定。(7)病毒收獲液超濾濃縮滅活后的收獲液用截留分子量為300KD的超濾膜超濾濃縮30倍，濃縮液取樣進行細菌內毒素含量。(8)蔗糖速率區帶離心濃縮后的病毒液以不超過離心腔容積50%的上樣量，在蔗糖溶液中以30000r/ min區帶離心3小時，將收集的病毒液用截留分子量為300KD的超濾膜進行超濾透析，以去
除蔗糖。(9)柱層柱用kphr0Se-4FF凝膠層析純化，洗脫液為0. 01mol/L的PBS，收集第一峰。(10)病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為0.3% Triton X-100及0. 3%去氧膽酸鈉，裂解120 分鐘。(11)再純化病毒裂解物以不超過離心腔容積50%的量上樣，在蔗糖溶液中以30000r/min區帶離心2小時，收集離心后的裂解物用IOKD的超濾膜進行超濾濃縮，以去除蔗糖和進一步去除裂解劑，超濾后的病毒裂解液取樣進行細菌內毒素含量和微生物限度檢查，微生物限度檢查菌落數小于10CFU/ml。(12)過濾除菌純化后的裂解物經除菌過濾后，即為單價原液。(13)單價原液檢定(14)半成品配制用0. 01mol/L PBS將各型經檢定合格的單價原液稀釋至血凝素含量為30 μ g/ml, 加入2-苯氧乙醇至終濃度為5mg/ml，即為半成品。
權利要求
1.一種季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，該方法包括按順序實施的建立病毒種子批、接種與培養病毒、收獲病毒、對病毒進行滅活處理、超濾濃縮、離心純化、柱層析純化、裂解病毒、二次純化、過濾除菌、半成品配制的步驟，其中的病毒是甲1、甲3和乙型流感病毒株，其特征在于，其中的離心純化步驟采用的是蔗糖速率區帶離心法，包括將濃縮后的病毒液以不超過離心腔容積50%的上樣量，在蔗糖溶液中以30000r/min區帶離心3小時；其中的建立病毒種子批步驟包括(1)主代種子庫建立由索取的原始毒種傳代制備，將毒種復溶并稀釋，取稀釋度為 IO3 IO5的病毒液接種9 11日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量0. aiil/胚，33 35°C培養48 72小時后收獲尿囊液并混合，加等量脫脂牛奶后分裝為0. 2ml/支凍干后保存于-60°C以下，經檢定合格即為主代種子批；自原始毒種到制成主代毒種傳代不得超過2代；(2)工作種子庫建立由主種子批毒種傳代制備，將主代種子復溶，取稀釋度為IO3 IO5的病毒液接種9 11日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量0. 2ml/胚，33 35°C培養48 72 小時后收獲尿囊液并混合，分裝后凍存于-60°C以下，經檢定合格即為工作種子批，自主代毒種到制成工作種子傳代不得超過2代。
2.權利要求1所述的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于在蔗糖溶液中以30000r/min區帶離心3小時后，將收集的病毒液用截留分子量為300KD的超濾膜進行超濾透析，以去除蔗糖，然后再進行接下來的柱層析步驟。
3.權利要求1或2所述的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于二次純化包括蔗糖密度梯度離心和超濾濃縮步驟，蔗糖密度梯度離心包括將病毒裂解物以不超過離心腔容積50%的量上樣，在蔗糖溶液中以30000r/min區帶離心2小時。
4.權利要求3所述的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于二次純化中的超濾濃縮步驟是將收集的離心后的裂解物用IOKD的超濾膜進行超濾濃縮，以去除蔗糖和進一步去除裂解劑。
5.權利要求3所述的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于采用Triton X-100和去氧膽酸鈉裂解病毒，Triton X-100及去氧膽酸鈉的終濃度均為0. 3%，裂解過程持續60 150分鐘。
6.權利要求3所述的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于采用甲醛進行滅活處理。
7.權利要求9所述的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于將病毒尿囊液加入終濃度為0. 02%的甲醛，置2 8°C條件下滅活16 M小時。
8.權利要求3所述的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于滅活后的收獲液用截留分子量為300KD的超濾膜超濾濃縮30-50倍，濃縮液取樣進行細菌內毒素含量。
9.權利要求3所述的季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法，其特征在于柱層析采用 Sephrose-4FF凝膠層析純化，洗脫液為0. 01mol/L的PBS，收集第一峰。
10.采用權利要求3所述的季節性流感病毒裂解疫苗制備方法制備得到的疫苗，其特征在于所述疫苗不含硫柳汞防腐劑，其中的卵蛋白含量為不高于300ng/ml，內毒素含量為小于 20EU/ml。
全文摘要
本發明提供一種季節性流感病毒裂解疫苗的制備方法及該方法制備得到的疫苗，屬于疫苗制備工藝技術領域。所述制備方法采用經檢定證明為WHO推薦病毒株或相似株的甲1、甲3、乙型流感病毒株，經過傳代建立工作種子庫，接種雞胚、培養收獲病毒液、滅活病毒、超濾濃縮、區帶離心、超濾除糖、柱層析、病毒裂解、二次純化、過濾除菌步驟制備獲得原液，然后通過半成品配置、成品包裝制備得到季節性流感病毒裂解疫苗。本發明的方法將區帶離心純化和分子篩層析柱純化進行組合，同時在病毒裂解后進行包括區帶離心純化步驟的二次純化，具有濃縮效率及回收率好，成本低，效率高，容易操作的優點。最終制備得到的產品雜質含量低，HA含量高，內毒素、卵清蛋白標準遠遠優于《中國藥典》2010版及《歐洲藥典》的要求。而且，本發明的產品不含硫柳汞，接種更安全，接種人群更廣泛。
文檔編號A61P31/16GK102406930SQ20111038207
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者侯文禮, 馮曉, 張濤, 鐘澤榮 申請人:成都康華生物制品有限公司