專利名稱：一種人類多肽在制備免疫調節劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及人類多肽，具體是一種人類多肽在制備免疫調節劑中的應用。
背景技術：
免疫系統由免疫器官(如胸腺、脾臟)、免疫組織(皮膚、粘膜組織)、免疫細胞(如T、 B淋巴細胞)、免疫因子(如白介素IL、干擾素IFN、腫瘤壞死因子TNF-a、TGF_b)等組成，維持著機體對感染性抗原的反應和自身耐受的平衡。在正常情況下，機體通過免疫調控機制和適度的免疫應答，識別自體抗原與異體抗原，防止病原微生物的入侵，監視并清除機體內癌變的細胞，并保持內環境的穩定。Bakaguchi，2005; Sakaguchi et al，2008]
調節性T細胞(Regulatory T cell，Treg)是體內一種具有獨特調節作用的特異性T 細胞亞群，該類T細胞在維持和調節免疫平衡狀態中起著重要作用。天然的Treg起源于胸腺，表達CD4+⑶25 ；獲得性Treg可在外周由⑶4+⑶25- T細胞誘導產生，其分子表面表達特異性的轉錄抑制因子R)xp3，又可表達⑶4、⑶25、⑶152等膜分子，主要功能具有免疫抑制性(suppressive)和免疫無能性(anergic)。[Sakaguchi, 2000，2003，2005 ； Sakaguchi and Powrie, 2007；Sakaguchi et al.，2008]
FoxP3是控制Treg發生發展的最主要轉錄因子，在⑶4+⑶25+調節性T細胞的形成和功能方面起中樞作用。體內胸腺和外周CD4+CD25+調節性T細胞富含 ^0ΧΡ3 ；人為破壞小鼠 ^ΧΡ3基因導致小鼠出現致死性炎癥性疾病；患有R)xP3基因突變的病人臨床表現(如胸腺萎縮、脾臟腫大、淋巴結生發濾泡增生、新生兒糖尿病、甲狀腺功能低下、胃腸炎、貧血、血小板減少等)與CD4+CD25+調節性T細胞缺陷小鼠出現的諸多免疫疾病相似。 FoxP3是Treg的最重要的功能標志，檢測R)xP3表達可作為判定Treg數量和功能的方法。[Sakaguchi, 2003 ； Ko et al. , 2005 ； Setoguchi et al. , 2005 ； Sakaguchi et al., 2006；Nomura and Sakaguchi, 2007；Ono et al. , 2007；Onishi et al., 2008；Sakaguchi et al.，2010]
Treg細胞在維持自身免疫穩定、預防自身免疫性疾病以及控制移植排斥反應等免疫調節方面發揮非常重要的保護作用。在自身免疫性疾病、過敏性疾病、器官移植術后免疫排斥反應、移植物抗宿主反應(GVHR)等免疫病理過程中，Treg細胞數量較健康人明顯減少，并且缺乏正常免疫調節活性。將⑶4+⑶25+ Treg細胞缺陷小鼠的T細胞轉移至裸鼠中會導致許多自身免疫病，而預先輸入Treg細胞可預防這類疾病的發生；將正常小鼠脾臟的Treg 細胞去除后轉移給同基因型T細胞缺陷小鼠，將導致各種器官特異性自身免疫病(包括I 型糖尿病、甲狀腺炎和胃炎)和系統性消耗疾病，而注射CD4+CD25+Treg細胞群可以抑制這些自身免疫病的發生，從而證明了 Treg細胞具備免疫調節能力，可以預防自身免疫病的胃；[Sakaguchi et al. , 1985；Sakaguchi and Sakaguchi, 1988；Sakaguchi et al., 1995；Sakaguchi, 2005；Setoguchi et al.，2005]
研究顯示，通過誘導Treg細胞介導的免疫抑制和免疫適應，可以有效地改善自身免疫性疾病(如NOD小鼠I型糖尿病)、過敏性疾病(如哮喘)、移植免疫排斥反應、GVHR等免疫病理。[Singer et al. , 1993；Sgouroudis and Piccirillo, 2009；Fan et al. , 2010；Gaidot et al.，2011;Leslie, 2011]
胰島淀粉樣多肽(Islet amyloid polypetitide)又稱胰淀素(Amylin)，于1987年由瑞典病理學家Westermark P和新西蘭學者Cooper GJ分別從人胰島素瘤和II型糖尿胰腺組織中發現。[Cooper et al. , 1987；Westermark et al. , 1987]人 IAPP (Human IAPP, hIAPP)由37個氨基酸組成，分子中第二和第七位半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，羥基末端酰胺化，中間第20 - 29位氨基酸組成具有種屬差異性，與致淀粉樣變能力密切相關。電鏡和免疫組化染色顯示，hIAPP與胰島素(insulin)共存于成人胰島b細胞內。正常人胰腺組織中含有與胰島素相當數量的hIAPP陽性細胞，血液中hIAPP含量也與血胰島素水平密切相關。I型糖尿病病人胰腺組織內和血液里幾乎檢測不到hIAPP ；胰島素抵抗和高胰島素血癥的患者，hIAPP的含量也高；晚期II型糖尿病病人胰腺組織內和血液里的hIAPP 水平也常常下降。hIAPP是胰島淀粉樣變的主要組分，胰島淀粉樣變又是人類II型糖尿病的病理特征。加之hIAPP調節糖代謝和胰島素、胰高血糖素(glucagon)等相關激素分泌的作用，因此自hIAPP發現以來，hIAPP與糖尿病的關系就一直為人關注。自1999年至2010 年，我們收集了香港中文大學醫學院、北京協和醫院和解放軍總醫院病理科436例2型糖尿病的人體解剖組織樣本以及相應臨床資料，詳細觀察了胰腺組織改變，系統研究了胰島淀粉樣變的臨床病理學特征，結果顯示hIAPP有可能具有重要內分泌調節作用。Bhao et al. , 2003;Zhao et al. , 2008;Zhao et al. , 2009a;Zhao et al. , 2009b;Zhao et al.,2010] 在體內外研究hIAPP的生物學功能和藥理療效過程中，我們發現hIAPP不僅對體內糖穩態 (glucose homeostasis)起調節作用，而且可以誘導Treg細胞形成，調節炎癥反應和免疫因子分泌。目前罕有利用人類多肽來誘導Treg細胞介導免疫抑制，從而改善自身免疫性疾病、過敏性疾病、組織器官移植術后免疫排斥反應和GVHR。國內外目前還未見有關hIAPP能誘導Treg細胞并具免疫抑制作用的報道。
發明內容
本發明的目的是將人類多肽(hIAPP)應用于制備免疫調節劑，供自身免疫疾病、組織器官移植、GVHR或炎癥疾病使用。本發明的技術方案如下一種人類多肽的新用途，它是用于誘導人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)轉化為 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞，干預自身免疫性疾病，即是將人類多肽制成增強CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞抑制效應的注射劑或口服劑，以干預自身免疫性疾病，其使用濃度為1 lOOOOnmol/L新鮮的 hIAPP溶液/日，一次性使用。本發明所述的人類多肽，其氨基酸序列為KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVG SNTY，它能誘導⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞，可應用于防治自身免疫性I型糖尿病。經實驗表明，上述的人類多肽體外預處理人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，顯著增加了 CD4+CD25+Foxp3+調節性 T 細胞的構成比，能誘導⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞，具有增強⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞抑制效應的作用，可以制成作為增強CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞抑制效應的免疫調節劑，以干預自身免疫性疾病。經hIAPP干預NOD小鼠自身免疫性糖尿病實驗表明，hIAPP成功誘導NOD小鼠脾臟淋巴細胞轉化為⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞，可以有效防治自身免疫性糖尿病。本發明所述的人類多肽為全長肽hIAPPij，由美國康乃狄格州紐黑文市耶魯大學 fl(Keck Biotechnology Center, Yale University, New Haven, CT) 供。使用時需配制成新鮮的hIAPP溶液。所述hIAPP溶液的配制，包括如下步驟
1. 1 人胰淀粉樣素(islet amyloid polypeptide, hIAPP/Amylin)的氨基酸序列
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY
1.2 hIAPP合成與純化
全長肽hIAPP^由位于美國耶魯大學凱克生物技術中心(Keck Biotechnology Center, Yale University, New Haven, CT)提供，該中心應用 t_boc 化學合成 hIAPP，應用反相高壓液相層析純化，純度超過99. 95%。1.3 hIAPP 溶液配制
用1 1的三氟乙酸(TFA)和六氟異丙醇(HFIP)混合溶液預先處理凍干肽hIAPP。將溶解的hIAPP轉移到一個新試管中，經過溫和的氮氣流動5 10分鐘，使TFA/HFIP蒸發消失。凍干肽溶解在0.5%的醋酸溶液中制備成50 mmol/L的儲備溶液。在使用之前，用培養基稀釋儲備溶液，制備新鮮的hIAPP溶液。本發明的積極意義是首次發現了氨基酸序列為KCNTATCATQRLANFLVHSSNNF GAILSSTNVGSNTY的人類多肽，于體外預處理人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)后，顯著增加了人⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞的數量；體內免疫自發性自身免疫性糖尿病NOD小鼠后，顯著增加小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的數量，降低自身免疫性糖尿病的發生率；可有效改善免疫病理反應，防治自身免疫性疾病，且無副作用，在自身免疫病、組織器官移植以及炎癥病理等方面，具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式以下通過實施例說明本發明。實施例1:制備hIAPP
(1)人胰淀粉樣素(isletamyloid polyp印tide，hIAPP/Amylin)的氨基酸序列 KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY
(2)hIAPP合成與純化
全長肽hIAPP^由位于美國耶魯大學凱克生物技術中心(Keck Biotechnology Center, Yale University, New Haven, CT)提供，該中心應用 t_boc 化學合成 hIAPP，應用反相高壓液相層析純化，純度超過99. 95%。(3)hIAPP 溶液配制
用1 1的三氟乙酸(TFA)和六氟異丙醇(HFIP)混合溶液預先處理凍干肽hIAPP。將溶解的hIAPP轉移到一個新試管中，經過溫和的氮氣流動5 10分鐘，使HFIP/TFA蒸發消失。凍干肽溶解在0.5%的醋酸溶液中制備成50 mmol/L的儲備溶液。在使用之前，用培養基稀釋儲備溶液，制備新鮮的hIAPP溶液。
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實施例2 :hIAPP對小鼠脾細胞和人外周血單個核細胞的影響 2.1 小鼠脾臟原代細胞培養
清潔級5 6月齡C57BL/6小鼠6只由校動物實驗中心提供，麻醉處死小鼠，在無菌條件下取出脾臟，研磨制備成新鮮的單細胞懸液，然后用銨酸溶血緩沖液(BD公司試劑盒) 處理脾細胞，去除紅細胞后，洗滌3次，調整細胞濃度為5 X IO4細胞/毫升。原代脾細胞培養使用美國hvitrogen Gibco公司的RPMI培養基1640。在96孔板上的脾細胞(100ml) 中，分別加入1，5，10，50，100，500，1000或10000 nmol/L hIAPP新鮮配制溶液，對照組不加 hIAPP，在(X)2培養箱分別培養M，48，或72小時。最后使用奧林帕斯相差顯微鏡CKX41-32PH 觀察細胞的密度、形態、生長情況。實驗結果顯示濃度為1 10000 nmol/L的hIAPP溶液，作用M 72小時后，脾細胞形態規則，比較亮，未見明顯損傷、死亡或者細胞碎片。培養48小時后細胞鋪滿度超過 80%。與對照組相比，未見明顯不同。2.2 外周血單個核細胞原代培養
從健康獻血者采取外周血300毫升，經乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，使用密度梯度法，分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。經紅細胞裂解和3 次洗滌后，PBMC計數達5' IO6細胞/毫升。在96孔板上的PBMC (100ml)中，分別加入1， 5，10，50，100，500，1000 或 10000 nmol/L hIAPP 新鮮配制溶液，對照組不加 hIAPP,在 CO2 培養箱分別培養對，48，或72小時。然后用PHA (lPg/ml)和LPS (2Pg/ml)刺激淋巴細胞計數。最后使用奧林帕斯相差顯微鏡CKX41-32PH觀察細胞的密度、形態、生長情況。實驗結果顯示濃度為1 10000 nmol/L的hIAPP溶液，作用M 72小時后，人 PBMC形態規則，比較亮，未見明顯損傷、死亡或者細胞碎片。培養對小時后細胞鋪滿度超過 70%。與對照組相比，未見明顯不同。2. 3 上述2. 1和2. 2實驗證實使用濃度范圍為1 10000 nmol/L的hIAPP溶液，作用M 72小時后，小鼠脾細胞和人PBMC生長未見毒性。 實施例3 :hIAPP誘導人PBMC轉化為⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞 3. 1 分離人PBMC
從3位健康獻血者采取分別采取外周血300毫升(共900毫升)，經乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝，使用密度梯度法，分離PBMC。經紅細胞裂解和3次洗滌后，PBMC計數達5' IO6 細胞/毫升；
3. 2 hIAPP 誘導 PBMC
在37°C條件下，應用hIAPP溶液(10 nmol/L)孵育M小時，對照組除了不加hiAPP外， 其余相同；
3. 3 流式細胞儀檢測⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞
經處理后的人PBMC，在37°C條件下用T細胞表面抗體⑶4和⑶25反應30分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗。接著，按50:1加入BD Foxp3緩沖液，固定10分鐘。固定后的PBMC用 BD Perm緩沖液增加細胞膜通透性30分鐘，再洗滌2次。在37°C條件下用細胞內染色劑 Foxp3染色30分鐘。最后，洗滌3次，并將染色后的PBMC重新懸浮在1 FBS緩沖液中，進行流式細胞儀(Becton Dickinson FACScan)檢測。小鼠免疫球蛋白G同型抗體用作背景信號參照，結果根據⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞在⑶4陽性T細胞中的所占百分率來計算。 3. 4實驗結果如表1所示
表1.人胰淀粉樣素(hIAPP)誘導人PBMC轉化為⑶4+⑶25+Foxp3+調節性T細胞
權利要求
1.一種人類多肽在制備免疫調節劑中的應用，其特征是它是將氨基酸序列為KCNTAT CATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY 的人類多肽制成作為誘導 CD4+CD25+Foxp3+ 調節性 T 細胞的免疫調節劑。
2.一種人類多肽在制備防治自身免疫性糖尿病藥物中的應用，其特征是它是將氨基酸序列為KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY的人類多肽制成防治自身免疫性糖尿病藥物。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征是將人類多肽制成濃度為1 lOOOOnmol/ L的注射劑或口服劑劑型。
全文摘要
本發明公開了一種人類多肽在制備免疫調節劑中的應用，它是將氨基酸序列為KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY的人類多肽制成作為誘導CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的免疫調節劑。該多肽體外預處理人外周血單個核細胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)后，顯著增加了人CD4+CD25+Foxp3+調節性Ｔ細胞的數量；體內免疫NOD小鼠，可以有效防治自身免疫性糖尿病，改善免疫病理反應，防治自身免疫性疾病，在自身免疫病、組織器官移植以及炎癥病理等方面，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61P37/06GK102441159SQ20111040368
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者張均智, 牟學晶, 趙海潞 申請人:趙海潞