專利名稱：Pl2l60來源的ctl表位肽及其應用的制作方法
PL2L60來源的CTL表位肽及其應用技術領域
本發明屬于生物化學領域中的多肽技術領域，尤其是涉及一種PL2L60來源的CTL 表位肽，本發明還涉及該肽在制備治療性多肽疫苗中的應用。
背景技術：
PIWIL2在正常組織中僅存在于睪丸組織中，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及睪丸癌等腫瘤組織中呈現高表達，尤其是在乳腺癌中表達率高達100%，而在正常乳腺組織中不表達。
PIWIL2與腫瘤的發生、發展密切相關，是一個非常好的腫瘤診斷和治療的靶點， 更重要的是，由于其特殊的組織表達特征以及與乳腺癌發生、發展的關聯性，使其成為一個非常理想的乳腺癌免疫治療靶抗原。
最新研究發現，全長PIWIL2在腫瘤細胞中表達量比較低，在一些凋亡和正在凋亡的細胞中是檢測不到的，而在腫瘤細胞中其剪接體PL2L60是顯著表達的。
細胞毒性T細胞(CTL)的抗感染與抗腫瘤效應，主要是通過與MHC- I類分子高親和力結合的表位多肽觸發細胞免疫應答來實現的。然而在胸腺發育過程中，許多針對高親和力表位的T細胞克隆由于陰性選擇已被清除，導致基于高親和力表位的多肽疫苗在體試驗療效并不理想。因此，針對低親和力表位進行適當改造，可最大限度地激活體內免疫應答，有望構建更為有效的多肽疫苗形式。
用CTL表位多肽疫苗免疫病人以誘導抗腫瘤T細胞反應，在早期的臨床實驗中己取得了初步的療效，但總體來說反應率很低。主要原因在于表位多肽的低免疫原性及易被蛋白酶分解，通過對表位多肽進行修飾(包括單個氨基酸的替換、多肽的PMRI修飾和脂肽等)或采用多價疫苗則可有效提高其免疫原性，誘導更強的CTL活性。
CTL表位兩端錨點殘基的替換能夠增強表位與MHC-I分子的親和力。因為這些殘基深深地埋藏在MHC-I類分子的口袋中，它不會影響TCR對p/MHC-I復合物的識別。除此之夕卜，TCR和CTL表位主要是通過TCR的互補決定區3 (⑶R3)環處接觸的，而互補決定區3 (⑶R3)是高度可變的。在TCR識別p/MHC復合物的前兩步中，⑶R3環對表位的完全包圍是極其重要的。不同的TCRs以不同的方式和一個已知的p/MHC-I復合物進行結合。所以替換表位中部TCR識別的殘基要依據它與TCR空間結合構象，使表位有效地和DR3結合，這樣才能夠有效地活化T細胞增殖，并使T細胞在體內保持較長時間的免疫應答能力。改造CTL 表位應根據腫瘤病人各自的HLA類型及特點，這樣就能有助于CTL表位對腫瘤細胞的特異性免疫反應。由于在中國HLA-A*02陽性人群在我國高達50%。所以本發明選擇HLA_A*02 限制性CTL表位具有重要意義。發明內容
本發明的目的在于提供一種對腫瘤細胞MCF-7具有一定殺傷力的PL2L60來源的 CTL表位肽，同時本發明還提供了該肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。
為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案本發明所述的PL2L60來源的CTL表位肽為九肽，其氨基酸序列為a -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val ；其中 a 為 D-Tyr、1-Nal、4_Cl_Phe 或 Phe。
當a 為 D-Tyr 時，記為 P281 I-D-Tyr,其氨基酸序列為=D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
當 a 為 I-Nal 時，記為 P281 I-I-Nal，其氨基酸序列為I-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
當 a 為 4-Cl-Phe 時，記為 P281 l-4-Cl-Phe，其氨基酸序列為4-Cl-Wie -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
當a 為 Phe 時，記為 P281 IF。
其氨基酸序列為Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
上述的PL2L60來源的CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。
本發明的優點在于針對低親和力表位進行改造，篩選出能活化T細胞增殖，更有效的能激活體內免疫應答的改造肽。鑒定的九肽未見文獻報道，為研制基于抗原PL2L60的腫瘤治療性多肽疫苗提供了理論基礎，并為后續多價的抗原肽疫苗、長肽疫苗、多表位疫苗等的構建奠定了基礎。
圖 1-5 依次是表位肽 P281、P^1 l-D-Tyr,P281 1-1-Nal、l-4-Cl-Phe 和 M81 IF 的質譜分析圖。
圖6、7是本發明表位肽誘導的特異性CTL對腫瘤細胞MCF-7(HLA-A*0201-陽性， PL2L60-陽性)的殺傷作用。
圖8是本發明表位肽誘導的特異性CTL分泌IFN-γ的能力。
具體實施方式
本發明所述的PL2L60來源的CTL表位肽為九肽，基礎肽為P^l，氨基酸序列為 Lys -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val,分子量為 958. 1 ；當將第一位氨基酸改造為D-Tyr，記為P281 I-D-Tyr,氨基酸序列為=D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量為 993. 2。
當將第一位氨基酸改造為I-Nal，記為P281 l_l_Nal，氨基酸序列為I-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量為 1026. 15。
當將第一位氨基酸改造為4-Cl-Phe，記為P281 l-4-Cl-Phe，氨基酸序列為 4-Cl-Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量為 1011.46。
當將第一位氨基酸改造為Wie，記為P281 1F，氨基酸序列為 Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量為 977. 1。
所述的PL2L60來源的CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。
本發明采用理論與實踐相結合的方法，根據抗原的一級結構，采用免疫信息學手段，運用 SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL 1. 2 和 IEDB 數據庫對 PL2L60 蛋白抗原的 HLA_A*0201 限制性CTL表位進行了預測分析。分析預測的篩選，選擇相對免疫活性較好的CTL表位P281，然后對P281進行了進一步的改造，得到了 CTL表位P281 1-D-Tyr, P281 I-I-Nal, P281 l-4-Cl-Phe和P281 IF0即使用Tyr的類似物來替換抗原肽1位氨基酸殘基，在設計 Tyr類似物時保留其側鏈的芳環，著重研究酚羥基的電荷特性、形成氫鍵的能力以及芳環大小在增強母體抗原肽結合力和免疫原性中的作用，為以后表位疫苗的構建打下基礎。
所述表位JftP281l-D_Tyr、P281 l_l_Nal、P281 l-4-Cl-Phe 和 P281 IF 采用標準的Fmoc方案進行合成，經HPLC純化后，其純度大于90%，質譜分析并證實其分子量符合理論值。表位肽 P281 及 M81 l-D-Tyr、P281 l-l-Nal,P281 l-4-Cl-Phe 和 M81 IF 的質譜鑒定圖見圖1-5。
上述表位肽的合成及制備采用固相合成法。基本流程如下首先將一個氨基被 Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上；其次將氨基被Fmoc基團保護的第二個氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C 端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的肽。經HPLC純化后，其純度大于90%，質譜分析并證實其分子量符合理論值。(參見①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學出版社，1985年。②.N.休厄德、H. D.賈庫布克著，劉克良等譯，肽化學與生物學，科學出版社，2005年)本發明表位肽的人外周血單個核細胞(PBMCs)的分離與ELISP0T實驗檢測 抽取健康供者的外周血經密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加白細胞介素2 (IL-2， Peprotech公司)和人β 2微球蛋白誘導分化CTL細胞，進一步在體外LDH和ELISP0T實驗進行驗證。方法如下UPBMCs的分離與誘導⑴以40ml PBSCPH 7. 2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ； (2) 離心管中加入鈿1 Lymphoprep分離液(Axis-Shield公司);(3)加8ml步驟(1)中稀釋后的外周血于鈿1 Lymphoprep分離液液面上；(4)20°C離心(2000rmpX20min); (5)離心后， 分為四層，棄去最上層，用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs) ;(6)吸出的白膜層用PBS CpH 7. 2)離心洗滌兩次；(7)用M孔板鋪板，細胞的濃度為1X10 6/ml，每孔Iml ； (8)第二天每孔加入3 μ g人β 2微球蛋白和10 μ g表位肽，同時設立PBS組(以PBS替代表位肽)作為陰性對照組；(9)第三天每孔加入50u IL-2;每2 3天換液，于七天后進行第二輪荷肽(即每孔補加50u IL-2U0 PgAi^2微球蛋白和10 μ g表位肽/PBS)，十四天后進行第三輪荷肽。第三輪荷肽后3天，得到效應細胞CTL，然后進行LDH實驗和ELISP0T 實驗檢測待測肽的作用。
2、LDH 檢測使用 CytoiTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (細胞毒性檢測試劑盒，Promega公司)進行LDH試驗檢測細胞毒活性。步驟如下(詳見試劑盒說明書)1)設立檢測板(100 μ 1/孔)(1)設立實驗組以腫瘤細胞EC-9706(ATCC公司)作為靶細胞(最優靶細胞數5000) 按不同效靶比10:1、20:1、40:1加入上述效應細胞CTL ；(2)設立效應細胞自發釋放組；(3)設立靶細胞自發釋放組；(4)設立靶細胞最大釋放組；(5)設立體積校正對照組；(6)設立背景對照組。
2)細胞裂解及收獲上清(1)37 °C、5%C02 孵育檢測板(5h )；(2)靶細胞最大釋放組和體積校正對照組中加入裂解液，每100μ 1培養基中加入 10 μ 1裂解液(10 X )，收獲上清前45min加入裂解液；(3)250g離心4min,收獲上清。
3) LDH 檢測(1)轉移50μ 1上清至另一孔板；(2)50 μ 1/孔迅速添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30min ；(3)添加50μ 1終止溶液;(4)將孔中含有的氣泡去除，一小時內檢測490nm吸收值0D。
細胞殺傷率計算公式如下(%) = [ (0D實驗組_0D效應細胞自發釋放組—ODm細胞自發釋放組)/( OD ^細胞最大釋放組—OD^細胞自發釋放組)]X 100%(注所有實驗組、效應細胞自發釋放組、靶細胞自發釋放組的吸收值均應減去背景平均吸收值；靶細胞最大釋放組吸收值應減去體積校正對照組的平均吸收值)結果見圖6、7，由圖6、7可知，表位肽誘導的特異性CTL對腫瘤細胞MCF-7 (HLA-A*0201-陽性，PL2L60-陽性)均顯示出一定的殺傷率。
3、ELISP0T實驗具體實驗步驟如下(1)封閉取出所需板條，用含5% FCS RPMI 1640培養基的培養基封閉，200 μ L /孔，室溫下(25°C)靜置5 10 min后將其扣出(FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應)；(2)細胞上板誘導的CTL作為效應細胞(IX IO5/孔)，荷肽的T2A2細胞作為刺激細胞(IX IO5/孔)鋪板。100 μ L/孔。細胞在孔中的分布要盡量均勻(加入細胞之后，不要再震動或者拍擊ELISP0T板)；·正對照細胞濃度為IX IO5/孔、加入10 UL ΡΗΑ，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌；·背景負對照加入100 μ L的含5%FCS的RPMI 1640培養基；(3)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入0)2培養箱，37 °C培養18h; (4)裂解細胞傾倒孔內的細胞及培養基，200 μ L/孔加入冰冷的去離子水，4 ！冰浴反應10 min(低滲法裂解細胞)；(5)洗滌傾倒孔內的液體，IX的Washing Buff er，200 μ L/孔，洗滌5 7次，每次停留30 60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(6)加入檢測抗體孵育每孔加入100 μ L稀釋好的生物素標記檢測抗體，37 °C孵育Ih ； (7)洗滌傾倒孔內的液體，1 X的Washing Buffer, 200 μ L/孔，洗滌5次，每次停留時間為3(T60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(8)酶聯親和素孵育將稀釋好的酶聯親和素工作液加入到實驗孔，100 μ L/孔，37 °C孵育Ih; (9)洗滌傾倒孔內的液體， IX的Washing Buffer，200uL/孔，洗滌5次，每次停留時間為30 60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(10)顯色解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100 PL的顯色液，室溫靜置 15-45min (在20 -25° C，顯色25min較合適)，注意避光；(11)終止顯色傾倒孔內液體， 揭開板底座，以去離子水洗滌3飛遍，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干；用ELISP0T圖6象分析儀計數96孔板中每孔形成的斑點數。
體外ELISP0T 實驗結果顯示候選肽 M81 1-D-Tyr、P281 1-1-Nal, P281 1-4-Cl-Phe、P281 IF均能夠在2名健康供者的外周血中誘導獲得CTL，且獲得的CTL經刺激后分泌較高量的IFN- γ (如圖8)。
本發明鑒定出的腫瘤抗原的表位肽為研制基于抗原PL2L60的腫瘤治療性多肽疫苗提供了理論基礎，通過對表位多肽進行修飾有效提高其免疫原性，誘導出更強的CTL活性，并為后續多價的抗原肽疫苗、長肽疫苗、多表位疫苗等的構建奠定了基礎。
權利要求
1.PL2L60來源的CTL表位肽，其特征在于所述的表位肽為九肽，其氨基酸序列為a -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val ；其中 a 為 D_Tyr、l-Nal、4-Cl_Phe 或 Phe。
2.根據權利要求1所述的PL2L60來源的CTL表位肽，當a為D-Tyr時，其氨基酸序列為:D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
3.根據權利要求1所述的PL2L60來源的CTL表位肽，當a為I-Nal時，其氨基酸序列為I-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
4.根據權利要求1所述的PL2L60來源的CTL表位肽，當a為4_C1-Phe時，其氨基酸序列為4-Cl-Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
5.根據權利要求1所述的PL2L60來源的CTL表位肽，當a為Phe時，其氨基酸序列為 Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
6.根據權利要求1-5任一所述的PL2L60來源的CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了PL2L60來源的CTL表位肽，氨基酸序列為a-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a為D-Tyr時，氨基酸序列為D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a為1-Nal時，氨基酸序列為1-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a為4-Cl-Phe時，氨基酸序列為4-Cl-Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a為Phe時，氨基酸序列為Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；本發明還公開了PL2L60來源的CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應用。本發明的優點在于針對低親和力表位進行改造,篩選出能活化T細胞增殖，更有效的激活體內免疫應答的改造肽，為研制基于抗原PL2L60的腫瘤治療性多肽疫苗提供了理論基礎。
文檔編號A61K39/00GK102516363SQ20121000155
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者劉偉, 時冉冉, 祁元明, 翟明霞, 高艷鋒 申請人:鄭州大學