Sparc結合肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了利用SPARC和白蛋白結合肽將治療劑和診斷劑靶向疾病位點，例如腫瘤。特別地，本發明公開了包含SPARC結合肽-抗體下C結構域融合蛋白的組合物及其應用方法。
【專利說明】SPARC結合肽及其應用
[0001]要求優先權
[0002]本申請要求2008年12月5日提交的美國臨時申請號61/120，228的優先權，其全部內容通過引用方式并入本文。
[0003]發明背景
[0004]酸性的富含半胱氨酸的分泌蛋白(Secreted Protein, Acidic, Rich inCysteines, SPARC)也被稱作骨粘連蛋白(osteonectin),是人體內表達的303個氨基酸的糖蛋白。SPARC的表達在發育上受到調控，SPARC主要在正常發育或響應于損傷而發生重塑的組織中表達。參見，例如Lane等人，FASEB J.，8，163-173 (1994)。例如，在鼠、牛和人胚胎的發育中的骨和牙齒(主要是成骨細胞、成牙質細胞、軟骨膜的成纖維細胞)以及分化中的軟骨細胞中高水平表達SPARC蛋白。SPARC也在組織重塑、創傷修復、形態發生、細胞分化、細胞遷移和血管形成過程中的細胞-基質相互作用中發揮重要作用，其中包括這些過程與疾病狀態相關的情況。例如，SPARC在腎間質纖維化中表達，并且其在宿主對肺損傷例如博來霉素誘導的肺纖維化的應答中具有重要作用。
[0005]在多種癌癥中，SPARC在腫瘤及其周圍基質中的表達相對于正常組織中是不同的，其表達模式取決于癌癥的類型。因此，沒有統一的模型來解釋其功能及其對癌癥產生和發展的作用的各個方面。在一種模式中，有報道指出在乳腺癌(Bellahcene和Castronovo, 1995 ； Jones 等人，2004 ；Lien 等人，2007 ；Porter 等人，1995)、黑素瘤(Ledda等人，1997a)和成膠質細胞瘤(Rempel等人，1998)中SPARC的表達增加。在這些癌癥中，增加的SPARC的表達在腫瘤促進或進展中具有重要作用。
[0006]因此，在炎癥和一些癌癥中SPARC的過表達使SPARC成為診斷和治療的潛在靶標。
[0007]發明概述
[0008]本發明提供了用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動物中的疾病位點的組合物，其包含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯于SPARC結合肽(〃SBP〃)的治療或診斷劑以及藥學上可接受的載體(〃本發明的組合物〃)，其中所述SBP包含SEQ IDNO: 1-117中的一項或多項。
[0009]特別優選的實施方式包括，例如，用于將治療劑遞送至哺乳動物中的疾病位點的本發明組合物，其包含一種或多種SBP，其中所述治療劑是包含功能性抗體Fe結構域的抗體片段，例如，其中所述功能性抗體Fe結構域包括SEQ ID N0:118。
[0010]另一些優選的實施方式包括，例如，用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動物中的疾病位點的本發明的組合物，例如，其中SBP包含:SEQ ID N0:l-112和117中的任意一項或多項的至少10個連續氨基酸。優選地，SBP可以由SEQ ID NO: 1-112和117中的任意一項或多項的至少10個連續氨基酸組成。其它實施方式包括這樣的組合物，例如，其中存在兩種或更多種單獨的SBP，其中每種單獨的SBP包含SEQ ID NO: 1-112和117中的任意一項、優選SEQ ID NO: 1-5中的任意一項或多項的至少10個連續氨基酸。實施方式包括這樣的組合物，例如，其中存在兩種或更多種單獨的SBP，其中每種單獨的SBP由SEQ ID NO: 1-117中的一項或多項組成。
[0011]本發明還提供了用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動物中的疾病位點的組合物，其包含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯于SBP的治療或診斷齊U，藥學上可接受的載體和藥學上可接受的載體，還包含白蛋白結合肽("ABP")，其中所述ABP 包括 SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 120 或者 SEQ ID NO: 119 與 SEQ ID NO: 120 二者。此類組合物包括:其中所述SBP和ABP在同一多肽中，以及，所述SBP和ABP在不同的多肽中的情況。
[0012]本發明還提供了用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動物中的疾病位點的方法，包含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯于SPARC結合肽的治療或診斷劑以及藥學上可接受的載體(〃本發明的方法〃)，其中所述SBP包括SEQ ID N0:l-117。優選的實施方式包括本發明的方法，其中所述組合物，例如，其中SBP包含:SEQ ID NO: 1-112和117中的任意一項或多項、更優選SEQ ID NO: 1-5和117中的任意一項或多項的至少10個連續氨基酸。
[0013]其它優選的實施方式包括本發明的方法，例如，其中存在兩種或更多種單獨的SBP，其中每種單獨的SBP由SEQ ID NO: 1-117中的一項或多項組成。本發明還提供了本發明的方法，其中存在兩種或更多種單獨的多肽，每種多肽由至少一個SBP組成，并且其中SBP包含SEQ ID NO: 1-112中任一項的至少10個連續氨基酸。
[0014]特別優選的本發明的方法包括這樣的組合物，例如，其中治療劑是包含功能性抗體Fe結構域的抗體片段，例如，其中所述抗體片段包括SEQ ID NO: 118。根據本發明的此類方法包括，例如，其中治療劑是介導下列一項或多項的抗體片段:補體激活、細胞介導的細胞毒性、誘導細胞凋亡、誘導細胞死亡和調理作用。
[0015]本發明提供的本發明的方法還包括血清白蛋白結合肽(〃ABP〃)，其包括SEQ IDNO: 119 或 SEQ ID NO: 120 或者 SEQ ID NO: 119 與 SEQ ID NO: 120 二者。根據本發明的方法還包括，例如，其中所述SBP和ABP在同一多肽中，以及，所述SBP和ABP在不同的多肽中的情況。然而，所述SBP也可以由SEQ ID NO: 1-112的任意一項或多項的至少10個連續氨基酸組成。
[0016]所提供的本發明的組合物和方法可用于其中疾病位點是腫瘤并且哺乳動物是人類患者的情況。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1顯示了將結合肽與治療或診斷劑融合的一般概念。在該圖所示的實例中，治療劑是抗體Fe結構域。
[0018]圖2顯示了用于反復篩選噬菌體顯示文庫的一般策略。
[0019]圖3顯示了通過序列被分離的次數就與SPARC的結合篩選肽噬菌體顯示文庫后鑒別的序列。
[0020]圖4顯示了通過與SPARC結合的親和性(由OD指示)就與SPARC的結合篩選肽曬菌體顯不文庫后鑒別的序列。
[0021]圖5顯示了將肽PD15或PD21克隆進入PFUSE-hIgGl_Fc2載體以產生PD15或TO21FC融合蛋白。
[0022]圖6顯示了通過將編碼肽15和肽21的序列克隆進入PFUSE-hIgGl_Fc2載體以編碼肽-Fe融合蛋白，而由此產生的DNA序列。
[0023]圖7顯示了所表達的和在聚丙烯酰胺凝膠電泳中純化的H)15-Fc和H)21-Fc融合蛋白。
[0024]圖8顯示了用于定義Η)15和TO21的脫靶結合的Protoarray。
[0025]圖9是ELISA結合測定的圖，其中將SPARC與Η)15和TO21的結合親和力與SPARC和抗-SPARC抗體的結合親和力進行了比較。
[0026]圖10顯示了在人腫瘤的切片上進行的免疫組織學研究的顯微照片，其中使用抗-SPARC抗體(R&D抗-SPARC)證明了腫瘤SPARC表達。陰性對照抗-赫賽汀抗體(僅Fe片段)和Stablin結合肽-Fe融合蛋白(stab-Fc)不使腫瘤染色。
[0027]圖11顯示了表達SPARC的腫瘤的組織學染色，其證明:H)15和TO21與腫瘤中表達SPARC的細胞結合。
[0028]圖12顯示了彈性蛋白上的潛在的SPARC結合位點。
[0029]圖13顯示了 Η)15和TO21在人前列腺癌/裸鼠模型系統中的抗腫瘤活性。
[0030]圖14顯示了 Η)15和TO21在人乳腺癌/裸鼠模型系統中的抗腫瘤活性。
[0031]圖15顯示了兩種svFc多肽ScFv3_l和ScFv3_2與SPARC的結合活性。
[0032]圖16顯示了兩種svFc多肽ScFv2_l和ScFv2_2與SPARC的結合活性。
[0033]發明詳述
[0034]SBP和ABP是“肽配體結構域”。術語“肽配體結構域”意思是指:可以以其本身存在和/或存在于更大的多肽序列內并且特異性地與另一種生物分子結合的氨基酸序列。例如，脂肪酸、膽紅素、色氨酸，鈣、類固醇激素和其它生理上重要的化合物的主要血液運輸系統涉及這些生物分子與血清白蛋白的結合。這些生物分子的結合發生于白蛋白氨基酸序列中的不連續位點，即，發生于血清白蛋白中的肽配體結構域。
[0035]本發明提供了用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動物中的疾病位點的組合物，其包含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯于SPARC結合肽(〃SBP〃)的治療或診斷劑以及藥學上可接受的載體("本發明的組合物"和"本發明的方法")。本發明包括這樣的組合物和方法，其中SBP包括具有SEQ ID NO: 1_117中的任意一項或多項、最優選SEQ ID NO: 1-5中的任意一項或多項的序列、或SEQ ID NO: 1-117中任一項的一種或多種同源物的肽。
[0036]術語“同源物”意思是具有與原始序列實質上相同的氨基酸序列并且顯示出與原始序列所顯示出的性質實質上相似的相關性質的多肽。一種此類性質的實例是調節活性試劑的組織分布的能力，其中SEQ ID NO: 1-117的同源物將能夠提供與SEQ ID NO: 1-117提供的調節水平實質上相似的調節水平。在本文中，例如以及優選地，相對于SEQ ID NO: 1-117提供的活性試劑的血液水平，顯示出這種實質上相似的調節的SEQ ID N0:l-117同源物將提供至少大約80%，優選至少大約85%，更優選至少大約90%，最優選至少大約95%的活性試劑的血液水平。或者，術語“同源物”還意指，例如，SEQ ID NO: 1-112任一項、最優選SEQ ID NO: 1-5任一項或多項的至少6個連續氨基酸，優選至少7個連續氨基酸，更優選至少8個連續氨基酸，甚至更優選至少9個連續氨基酸，最優選至少10個連續氨基酸的肽序列。
[0037]本發明提供的組合物和方法還包括包含SEQ ID NO: 119或120或者SEQ ID NO: 119與120 二者及其同源物的ABP。根據本發明的方法還包括，例如，其中所述SBP和ABP在同一多肽中，以及，所述SBP和ABP在不同的多肽中的情況。
[0038]就相對于原始序列的變化而言，原始序列的同源物優選將與原始序列至少大約80%同一,優選與原始序列至少大約90%同一，甚至更優選與原始序列至少大約95%同一，最優選與原始序列至少大約99%同一。
[0039]如本文使用的“序列同一性百分率”意思是通過在比較窗口中比較兩個優化比對的序列而測定的值。另外，為了兩個序列優化比對的目的，比較窗口中的多肽序列部分相對于參考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即空隙)。百分率是這樣計算的:測定兩個序列中的相同氨基酸殘基的位置數目以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗口中的位置的總數目，將結果乘以100以產生序列同一性百分率。優選地，使用Needleman和Wunsch (1970) J.Mol.B1l.48:443 453中的同源性比對算法來進行優化比對。
[0040]另外優選的是，當同源物不含相同的氨基酸時，突變僅產生保守性氨基酸變化。因此，那些不相同的殘基位置的變化使得氨基酸殘基被替換為其它的具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基，因此，分子的功能性質不發生改變。當序列的區別在于保守性替換時，可以上調序列同一性百分率以校正替換的保守性性質。區別在于此類保守性替換的序列被稱作具有“序列相似性”或“相似性”。進行這種調整的方法是本領域技術人員熟知的。
[0041]為了進一步例示本發明上下文中的“保守性”氨基酸取代或改變的含義，以下列出了組A-F。下列組中的一個成員被替換為同一個組中的另一個成員被認為是“保守性”取代。
[0042]組A包括:亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和具有下列側鏈的修飾的氨基酸:乙基、異丁基、-CH2CH20H、-CH2CH2CH20H、-CH2CH0HCH3 和 CH2SCH3。
[0043]組B包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和具有乙基側鏈的修飾的氨基酸。
[0044]組C包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、環己基甲基和具有取代的芐基或苯基側鏈的修飾的氨基殘基。
[0045]組D包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸的取代的或非取代的脂肪族、芳香族或芐族酯(例如，甲酯、乙酯、正丙酯、異丙酯、環己酯、芐酯或取代的芐酯)、谷氨酰胺、天冬酰胺、CO-NH-烷基化的谷氨酰胺或天冬酰胺(例如，甲基、乙基、正丙基和異丙基)，以及具有側鏈_(CH2)3C00H的修飾的氨基酸，其酯(取代的或非取代的脂肪族、芳香族或芐族酯)，其酰胺，及其取代的或未取代的N-烷基化酰胺。
[0046]組E包括組氨酸、賴氨酸、精氨酸、N-硝基精氨酸、P-環精氨酸、g-羥基精氨酸、N-脈基瓜氨酸(N-amidinocitruline)，2-氨基狐基丁酸(2_arnino guanidinobutanoicacid)、賴氨酸的同源物、精氨酸的同源物和鳥氨酸。
[0047]組F包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和具有被-OH或-SH取代的C1-C5直鏈或支鏈烷基側鏈的修飾的氨基酸。
[0048]本發明還提供了包含綴合物分子的組合物，所述綴合物分子包含綴合于活性試劑的肽配體結構域，其中所述肽配體結構域在氨基或羧基末端或者兩個末端添加至多另外大約50個氨基酸，優選至多另外大約25個氨基酸，更優選至多另外大約15個氨基酸，最優選至多另外大約10個氨基酸。得到的多肽(本發明的多肽)包括總長度小于50個，小于40，小于30，小于25或小于20個氨基酸的多肽。
[0049]本發明還提供了包含綴合物分子的組合物，其中所述綴合物分子包含綴合于活性試劑的SBP，其中存在包含SEQ ID NO:1 — 117和121 — 125中任一項、最優選SEQ ID NO:1和2中任意一項或多項的一個或多個SBP。
[0050]本發明還提供了分離的多核苷酸，其編碼具有肽配體結合結構域的氨基酸序列的多肽，包括在氨基和/或羧基末端具有所述的另外的氨基酸的那些多肽。
[0051]I1.制備本發明的肽的方法
[0052]可以使用已知的技術來合成、檢測、定量和純化本發明提供的含有肽配體結構域的多肽。例如，可以這樣產生表達含有外源肽配體結構域的多肽的細胞:通過本領域普通技術人員熟知的方法將cDNA置于強啟動子/翻譯起始點的控制下并將載體轉染或轉化進入合適的原核或真核細胞以驅動含有肽配體結構域的多肽的表達。或者，可以通過本領域普通技術人員熟知的方法化學地制備含有肽配體結構域的多肽。
[0053]可以通過標準的固相合成技術來制備含有肽配體結構域的多肽。如一般已知的那樣，可以使用商售的設備和試劑，根據生產商的說明書，通過封閉干擾性基團、保護待反應的氨基酸、偶聯、脫保護和將未反應的殘基加帽來制備所需長度的肽。合適的設備可以從下列生產商獲得，例如，Applied B1Systems, Foster City, CA或B1searchCorporat1n, San Raphael, CA。
[0054]例如，使用具有適當側鏈保護的叔丁氧羰基-α -氨基酸，應用標準的自動化固相合成程序來合成肽。使用標準的氟化氫方法從固相載體上取下完成的肽，同時使側鏈脫保護。使用0.1%三氟乙酸中的乙腈梯度，通過半制備型反相HPLC(Vydac C18)進一步純化粗制肽。將肽真空干燥以除掉乙腈并從0.1 %的TFA水溶液中冷凍干燥。通過分析型RP-HPLC驗證純度。可以將肽凍干，然后以l_2mg/mL的重量濃度溶解于水或0.0lM乙酸中。
[0055]如果肽中存在非編碼氨基酸或D形式的氨基酸，則需要使用前述合成方法。然而，對于由基因編碼的肽，也可以使用容易合成的DNA序列在商售的表達系統中通過重組技術獲得其來源。
[0056]本發明相應地提供了包含控制編碼含有肽配體結構域的多肽的多核苷酸序列表達的元件的重組載體。此外，本發明提供了包含編碼含有肽配體結構域的多肽的核酸的細胞，其中所述細胞是原核細胞或真核細胞。微生物和組織培養方法是本領域技術人員熟知的(見，例如，Sambrook&Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York (2001), pp.16.1-16.54) ? 因此，本發明提供了制備含有肽配體結構域的多肽的方法，包括:(a)以編碼權利要求1的多肽的核酸轉化細胞；(b)誘導轉化的細胞表達所述多肽；和(C)純化所述多肽。
[0057]蛋白表達取決于RNA轉錄的水平，RNA轉錄繼而又由DNA信號調節。類似地，mRNA的翻譯至少需要AUG起始密碼子，其通常位于信使的5’末端的10-100個核苷酸內。已經表明側接AUG起始密碼子的序列影響其識別。例如，對于真核細胞核糖體的識別而言，與完美“Kozak共有”序列一致的序列中鑲嵌的AUG起始密碼子引起優化的翻譯(見，例如，Kozak, J.Molec.B1l.196:947-950 (1987))。同樣，細胞中外源核酸的成功表達可能需要所得到的蛋白的翻譯后修飾。
[0058]本文描述的核酸分子優選包含與合適的啟動子可操作地連接的編碼區，所述啟動子是例如真核細胞中有功能性的啟動子。病毒啟動子，例如但不限于，RSV啟動子和腺病毒主要晚期啟動子，可用于本發明中。合適的非病毒啟動子包括但不限于，磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和延伸因子Ia啟動子。非病毒啟動子優選是人類啟動子。另外的合適的遺傳元件(很多是本領域已知的)也可以連接于或插入至本發明的核酸和構建體中以提供另外的功能、表達水平或表達模式。
[0059]此外，本文描述的核酸分子可以與增強子可操作地連接以促進轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，其刺激相鄰基因的轉錄。賦予所連接的基因在來自很多物種的多種不同細胞類型中的高水平轉錄的增強子的實例包括但不限于，來自SV40和RSV-LTR的增強子。此類增強子可以與具有細胞類型特異性效應的其它增強子組合，或者可以單獨使用任意增強子。
[0060]為了優化真核細胞中的蛋白產生，本發明的核酸分子還可以在核酸分子的編碼區之后包含多腺苷酸化位點。同樣地，優選所有的正確轉錄信號(以及翻譯信號，如果適用)將正確地排列，以使外源核酸在其所被導入的細胞中正確表達。如果需要，外源核酸中還可以引入剪接位點(即，剪接受體和剪接供體位點)以促進mRNA產生并同時保持框內的全長轉錄本。此外，本發明的核酸還可以包含合適的序列以進行加工、分泌、細胞內定位等。
[0061]可以將核酸分子插入至任何合適的載體中。合適的載體包括但不限于病毒載體。合適的病毒載體包括但不限于，逆轉錄病毒載體，α病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和禽痘病毒載體。載體優選具有天然或工程化的能力以轉化真核細胞，例如CHO-Kl細胞。另外，用于本發明上下文中的載體可以是“裸的”核酸載體(即具有極少或沒有封裝它們的蛋白、糖類和/或脂類的載體)，例如質粒或游離體，或者載體可以與其它分子復合。可以與本發明的核酸適宜地組合的其它分子包括但不限于病毒包被、陽離子脂質、脂質體、聚胺、金顆粒和靶向部分，例如靶向細胞分子的配體、受體或抗體。
[0062]如本文描述的核酸分子可以被轉化進入任意合適的細胞，通常是真核細胞，例如CHO，ΗΕΚ293或ΒΗΚ，優選引起含有肽配體結構域的多肽例如本文描述的包含SEQ IDNO: 1-120的多肽或其同源物的表達。可以培養所述細胞以提供核酸分子的表達，并由此產生含有肽配體結構域的多肽，例如本文描述的包含SEQ ID NO: 1-120所示氨基酸序列的多肽或其同源物。
[0063]因此，本發明提供了以本文描述的本發明的核酸分子轉化或轉染的細胞。以外源DNA分子轉化或轉染細胞的方法是本領域熟知的。例如但不限于，使用本領域熟知的標準轉化或轉染技術將DNA分子導入細胞中，所述技術是例如磷酸鈣或DEAE-葡聚糖-介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、脂質體和直接顯微注射(參見，例如，Sambrook&Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York (2001)，pp.1.1-1.162，15.1-15.53，16.1-16.54)。
[0064]轉化方法的另一個實例是原生質體融合法，將源自攜帶高拷貝數的目標質粒的細菌的原生質體直接與培養的哺乳動物細胞混合。細胞膜融合后(通常使用聚乙二醇)，細菌的內容物被遞送進入哺乳動物細胞的胞質中，并且質粒DNA被轉移進入細胞核。
[0065]電穿孔，即向多種哺乳動物和植物細胞施加短暫的高壓電脈沖，導致在質膜上形成納米尺寸的孔。通過這些孔或者由于膜成分的重新分布(伴隨孔的關閉)而使DNA直接被遞送進入細胞的細胞質內。電穿孔可以是非常有效率的，并且可以用于克隆的基因的瞬時表達以及用于建立攜帶整合拷貝的目標基因的細胞系。
[0066]此類技術可用于真核細胞的穩定轉化和瞬時轉化。穩定轉化的細胞的分離需要在導入目標基因的同時導入可選擇標志物。此類可選擇標志物包括賦予對新霉素抗性的基因，以及HPRT陰性細胞中的HPRT基因。選擇可能需要在選擇性培養基中進行延長的培養，至少大約2-7天，優選至少大約1_5周(見，例如，Sambrook&Russell, MolecularCloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork (2001)，pp.16.1-16.54) 0
[0067]可以從重組宿主細胞表達并純化含有肽配體結構域的多肽。重組宿主細胞可以是原核或真核細胞，包括但不限于細菌，例如大腸桿菌；真菌細胞例如酵母；昆蟲細胞，包括但不限于果蠅和蠶衍生的細胞系，以及哺乳動物細胞和細胞系。當體外或在體內在細胞例如人類細胞中表達含有肽配體結構域的多肽時，可以就給定的細胞類型(即物種)對選擇用于編碼肽的多核苷酸進行優化。很多用于密碼子優化的技術是本領域已知的(見，例如，Jayaraj 等人，Nucleic Acids Res.33 (9): 3011-6 (2005) ;Fuglsang 等人，ProteinExpr.Purif.31 (2): 247-9 (2003) ;Wu 等人，"The Synthetic Gene Designer:a FlexibleWeb Platform to Explore Sequence Space of Synthetic Genes for HeterologousExpress1n, 〃csbw，2005IEEE Computat1nal Systems B1informatics Conference-Workshops(CSBWi05)，pp.258-259(2005))。
[0068]在原核細胞中進行最佳的多肽表達時必須考慮的問題包括:所用的表達系統、宿主菌株的選擇、mRNA的穩定性、密碼子偏好性、包涵體的形成和防止、融合蛋白和位點特異性蛋白水解、腔室導向的分泌(見Sorensen等人，Journal ofB1technologyll5(2005) 113-128，通過引用方式并入本文)。
[0069]通常從遺傳背景相容性系統攜帶的質粒誘導表達。表達質粒的遺傳元件包括復制起點(ori)、抗生素抗性標志物、轉錄啟動子、翻譯起始區(TIR)以及轉錄和翻譯終止子。
[0070]可以使用任何合適的表達系統，例如大腸桿菌由于其相對的簡單性、高密度培養、熟知的遺傳學和大量的相容性工具(包括可用于多肽表達的多種可獲得的質粒，重組融合伴侶和突變菌株)而有助于蛋白表達。用于重組表達的大腸桿菌菌株或遺傳背景是非常重要的。表達菌株應該缺乏最有害的天然蛋白酶，維持表達質粒穩定，并且提供與表達系統相關的遺傳元件(例如DE3)。
[0071]質粒拷貝數由復制起點控制，優選以松弛的方式復制(Baneyx，1999)。存在于現代的表達質粒中的ColEl復制子源自pBR322(拷貝數15-20)或pUC(拷貝數500-700)質粒家族，而P15A復制子源自pACYC184 (拷貝數10-12)。重組表達質粒中最常見的藥物抗性標志物賦予對氨比西林、卡那霉素、氯霉素或四環素的抗性。
[0072]大腸桿菌表達系統包括基于T7的pET表達系統(由Novagen商業化)、λ PL啟動子 /cl 阻抑子(例如,Invitrogen pLEX)、Trc 啟動子(例如,Amersham B1sciencespTrc)、Tac 啟動子(例如，Amersham B1sciences pGEX)和雜合 lac/T5 (例如,QiagenpQE)和 BAD 啟動子(例如,Invitrogen pBAD)。
[0073]從轉錄的信使RNA的翻譯起始區(TIR)進行的翻譯起始需要核糖體結合位點(RBS),包括Shine-Dalgarno (SD)序列和翻譯起始密碼子。Shine-Dalgarno序列位于起始密碼子上游7土2個核苷酸處，在有效的重組表達系統中，起始密碼子是規范的AUG0從具有SD序列UAAGGAGG的mRNA獲得最佳的翻譯起始。
[0074]大腸桿菌中的密碼子使用由細胞質中可獲得的同源的氨基-酰基化tRNA的水平反映。主要密碼子存在于高水平表達的基因中，而少數或罕見密碼子傾向于在低水平表達的基因中。在大腸桿菌中罕見的密碼子在來源于具有不同密碼子頻率偏向的來源例如真核細胞、古細菌和其它遠相關的生物的異源基因中通常是豐富的(Kane，1995)。含有罕見密碼子的基因的表達可能導致翻譯錯誤，這是由于在需要引入偶聯于少數密碼子tRNA的氨基酸的位置處核糖體停滯所致(McNulty等人，2003)。當含有成簇(例如雙重和三重)的罕見密碼子的轉錄本大量積累時，密碼子偏向問題在重組表達系統中變得至關重要。
[0075]蛋白活性需要折疊成精確的三維結構。壓力狀況例如熱休克會破壞體內的折疊，折疊中間體傾向于結合成無定形的蛋白顆粒，其被稱作包涵體。
[0076]包涵體是一組結構上復雜的聚合體，通常被理解為當以高水平表達重組蛋白時作為壓力應答而發生。大腸桿菌的細胞質中濃度為200-300mg/ml的蛋白的大分子量密集暗示高度不利的蛋白折疊環境，尤其是在高水平重組表達過程中(van den Berg等人，1999)。尚不知道包涵體是通過非折疊鏈上暴露的碎片之間的疏水相互作用而發生的被動事件而形成還是通過特定的聚集機制而形成(Villaverde和Carr1, 2003)。可以使用去污劑例如脲和鹽酸胍溶解純化的聚集體。可以通過稀釋、透析或柱上重折疊方法，從溶解的包涵體中在體外進行重折疊以制備天然蛋白(Middelberg, 2002 ； Serensen等人，2003a)。
[0077]可以通過加入分子伴侶來改善重折疊策略(Mogk等人，2002)。然而，對于給定的蛋白，重折疊程序的優化需要耗時的努力，并不總是產生高的產品產率。防止形成包涵體的可能的策略是共同過表達分子伴侶。
[0078]已經開發了多種蛋白融合配對物以簡化重組蛋白的純化和表達(Stevens, 2000)。融合蛋白或嵌合蛋白通常包括經由特異性蛋白酶的識別位點而連接于乘客蛋白(passenger protein)或祀蛋白的配對物或“標簽”。多數融合配對物用于特異性親和純化策略。融合配對物在體內也是有利的，其中它們可以保護乘客蛋白免受細胞內蛋白水解(Jacquet 等人,1999 ；Martinez 等人,1995)、增強溶解性(Davis 等人,1999 ；Kapust 和
Waugh, 1999 ； Sorensen等人，2003b)或用作特異性表達報告蛋白(Waldo等人，1999)。
高表達水平通常可以從N-末端融合配對物轉移至低表達的乘客蛋白，最有可能是由于mRNA穩定化的結果(Arechaga等人，2003)。常見的親和標簽是聚組氨酸標簽(His-tag),其與固定化的金屬親和色譜(IMAC)相容，以及谷胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽，其用于基于谷胱甘肽樹脂上進行的純化。還有數種其它的親和標簽并且已經進行了深入評論(Terpe,2003)。
[0079]原則上可以將重組表達的蛋白導向三個不同的位置，即細胞質、周質或培養基。將重組蛋白導向特定細胞區室具有不同的優點和缺點。在細胞質中表達通常是優選的，因為廣率聞。在大腸桿囷中，_■硫鍵的形成被隔尚，在周質中被Dsb系統活性地丨隹化(Rietsch和Beckwith, 1998)。在細胞質中,硫氧還蛋白和谷氧還蛋白實現半胱氨酸的還原。硫氧還蛋白還原酶使硫氧還蛋白保持還原，谷胱甘肽使谷氧還蛋白保持還原。谷胱甘肽還原酶使低分子量的谷胱甘肽分子還原。編碼這兩種還原酶的trxB和gor基因的破壞允許在大腸桿菌細胞質中形成二硫鍵。
[0080]就產生的蛋白的質量和數量而言，基于細胞的表達系統具有缺點，并且并不總是適合于高通量生產。可以通過使用無細胞翻譯系統來克服很多這些缺點。
[0081]已經針對很多不同的原核和真核系統描述了用于體外基因表達和蛋白合成的無細胞系統(見 Endo 和 Sawasaki Current Opin1n in B1technology2006, 17:373-380)。真核的無細胞系統，例如兔網織紅細胞裂解物和小麥胚提取物，是從包含體外轉錄RNA模板的翻譯所需的所有成分的粗提取物制備而來的。真核的無細胞系統使用體內或體外合成的分離的RNA作為模板以進行翻譯反應(例如兔網織紅細胞裂解物系統或小麥胚提取物系統)。偶聯的真核無細胞系統組合了原核噬菌體RNA聚合酶與真核提取物，并且利用具有噬菌體啟動子的外源DNA或由PCR產生的模板以進行體外蛋白合成(例如，TNT?偶聯的網織紅細胞裂解物)。
[0082]使用TNT?偶聯系統翻譯的蛋白可用于多種類型的功能性研究。TNT?偶聯的轉錄/翻譯反應傳統地被用于確認開放閱讀框，研究蛋白突變和在體外制備蛋白以用于蛋白-DNA結合研究，蛋白活性測定，或蛋白-蛋白相互作用研究。最近，使用TNT?偶聯系統表達的蛋白已經被用于確認酵母雙雜交反應的測定法中，進行體外表達克隆(IVEC)和制備用于酶活性或蛋白修飾測定的蛋白底物。關于在多種應用中使用TNT?偶聯系統的最近的文獻的歹丨」舉，請訪問www.promega.com/citat1ns/。
[0083]在原核系統中，轉錄和翻譯通常是偶聯的；即，它們包含內源性的或噬菌體RNA聚合酶，其從外源DNA模板轉錄mRNA。然后,該RNA用作翻譯的模板。DNA模板可以是克隆進入質粒載體的基因(cDNA)或由PCR產生的模板。在原核系統中翻譯的模板需要核糖體結合位點(RBS)。在轉錄過程中，mRNA的5’末端可用于核糖體結合和翻譯起始，允許同時發生轉錄和翻譯。可以獲得使用含有原核啟動子(例如Iac或tac ;用于環狀和線性DNA的大腸桿菌S30提取物系統)的DNA模板或含有噬菌體RNA聚合酶啟動子的DNA模板(用于環狀DNA的大腸桿菌T7S30提取物系統)的原核系統。可以通過本領域已知的方法改善純化的含有肽配體結構域的多肽的溶解性。例如，為了增強表達的蛋白(例如，在大腸桿菌中表達的)的溶解性，可以通過降低生長溫度、使用較弱的啟動子、使用低拷貝數的質粒、降低誘導劑濃度、改變生長培養基來降低蛋白合成速率,見Georg1u和Valax(CurrentOpin1n B1technol.7:190-197(1996))的描述。這會降低蛋白合成速率，通常會獲得更可溶的蛋白。也可以添加正確折疊或蛋白穩定性必不可少的輔基或輔因子，或添加緩沖劑以控制生長過程中培養基中的PH波動，或添加1%的葡萄糖以阻止乳糖(在多數富集培養基例如LB、2xYT中存在乳糖)對Iac啟動子的誘導。也可以向培養基中添加多元醇(例如山梨醇)和蔗糖，因為這些添加物引起的滲透壓的升高會導致細胞中滲透保護劑的積累，滲透保護劑會穩定天然蛋白的結構。可以添加乙醇、低分子量的硫醇和二硫化物和NaCl。此外，可以與需要的多肽共表達伴侶和/或折疊酶。分子伴侶通過與折疊中間體的瞬時相互作用而促進正確的異構化和細胞靶向。大腸桿菌伴侶系統包括但不限于=Gr0ES-Gr0EUDnaK-DnaJ-GrpE、CIpB。
[0084]折疊酶加速折疊途徑中的限速步驟。有三種類型的折疊酶具有重要作用:肽基脯氨酰順式/反式異構酶(PPI’S)、二硫化物氧化還原酶(DsbA)和二硫化物異構酶(DsbC),蛋白二硫化物異構酶(PDI)，后者是真核蛋白，其催化蛋白半胱氨酸氧化和二硫鍵異構化。這些蛋白中的一種或多種與靶蛋白的共表達可以產生更高水平的可溶性靶蛋白。
[0085]可以以融合蛋白的形式產生包含肽配體結構域的多肽，以改善其溶解性和產量。所述融合蛋白包含含有肽配體結構域的多肽和在框內融合在一起的第二多肽。所述第二多肽可以是本領域已知的融合配對物以改善與其融合的多肽的溶解性，例如，NusA、細菌鐵蛋白(BFR)、GrpE、硫氧還蛋白(TRX)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)。Novagen Inc.(Madison, WI)提供了 pET43.1載體系統,其允許形成NusA-祀標融合物。已經表明:當用作融合配對物時，DsbA和DsbC對表達水平具有積極影響，因此它們可用于與肽配體結構域融合以實現較高的溶解性。
[0086]在此類融合蛋白的一個方面，表達的含有肽配體結構域的多肽包括連接子多肽，所述連接子多肽包含蛋白酶切割位點，所述蛋白酶切割位點包括可被蛋白酶水解的肽鍵。結果，可以在表達之后通過蛋白水解使多肽中的肽配體結構域與多肽的其余部分分離。所述連接子可以在蛋白酶的催化位點相結合的所述鍵的任一側包含一個或多個另外的氨基酸，(見，例如，Schecter&Berger, B1chem.B1phys.Res.Commun.27, 157-62 (1967))。或者，連接子的切割位點可以與蛋白酶的識別位點間隔開，并且兩個切割位點與識別位點可以被一個或多個(例如2-4個)氨基酸間隔開。在一個方面，連接子包含至少大約2、3、4、
5、6、7、8、9、大約10、大約20、大約30、大約40、大約50或更多個氨基酸。更優選地，連接子長度為大約5至大約25個氨基酸，最優選地，連接子長度是大約8至大約15個氨基酸。
[0087]在以下文獻中討論了可用于本發明的一些蛋白酶=Hooper等人，B1chem.J.321:265-279 (1997) ; Werb,Ce 119 1:439-442 (1997) ；ffolfsberg 等人，J.Cell B1l.131:275-278(1995) ；Murakami 和 Etlinger,B1chem.B1phys.Res.Comm.146:1249-1259 (1987) ；Berg 等人，B1chem.J.307:313-326 (1995)；Smyth 和 Trapani，Immuno 1gy To day I 6:202-206 (I 995) ；Talanian 等人，J.B1l.Chem.272:9677-9682 (1997);以及 Thornberry 等人，J.B1l.Chem.272:17907-17911 (1997)。根據本發明，也可以使用細胞表面蛋白酶和可切割的連接子，包括但不限于:氨肽酶N ;嘌呤霉素敏感性氨肽酶；血管緊張素轉化酶；焦谷氨酰肽酶II ;二肽基肽酶IV ;N-精氨酸二元轉化酶；內肽酶24.15 ;內肽酶24.16 ;淀粉樣蛋白前體蛋白分泌酶α、β和Y ;血管緊張素轉化酶分泌酶；TGFa分泌酶；TNF a分泌酶；FAS配體分泌酶；TNF受體-1和TNF受體-1I分泌酶KD30分泌酶；KL1和KL2分泌酶；IL6受體分泌酶KD43、⑶44分泌酶KD16-1和⑶16-11分泌酶；L_選擇素分泌酶；葉酸受體分泌酶；麗?1、2、3、7、8、9、10、11、12、13、14和15 ;尿激酶纖溶酶原激活劑；組織纖溶酶原激活物；纖溶酶；凝血酶；BMP-1(前膠原 C-肽酶);ADAM1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 和 11 ;以及 GranzymesA、B、C、D、E、F、G 和 Ho
[0088]依賴于細胞相關蛋白酶的替代性方式是使用自我切割的連接子。例如，口足病病毒(FMDV) 2A蛋白酶可用作連接子。其是17個氨基酸的短的多肽，其在2A/2B接合點切割FMDV的多聚蛋白。FMDV2A前肽的序列是NFDLLKLAGDVESNPGP。切割發生于肽C-末端的最后的甘氨酸-脯氨酸氨基酸對處，并且不依賴于其它FMDV序列的存在，即使在存在異源序列的情況下也切割。
[0089]可以單獨使用親和色譜或與離子交換、分子篩或HPLC色譜技術聯合用于純化含有肽配體結構域的多肽。可以使用柱或以批式形式進行此類色譜技術。此類色譜純化方法是本領域熟知的。
[0090]另外，本發明提供了編碼含有肽配體結構域的多肽的分離的核酸，所述多肽在SEQID NO: 1-117的序列中具有一個或多個氨基酸替換和插入或缺失:大約I至大約5個氨基酸，優選大約I至大約3個氨基酸，更優選I個氨基酸，其中相關性質基本上類似于原始肽顯示出的性質。
[0091]可以通過本領域已知的數種方法中的任意方法進行誘變。一般而言，可以通過將核酸序列克隆進入質粒或一些其它的易于操作序列的載體來進行誘變。然后，鑒定或在核酸序列中插入可以向所述核酸序列中添加另外的核酸的獨特限制性位點。通常從重疊的合成單鏈正義和反義寡核苷酸中產生雙鏈的合成寡核苷酸，從而所述雙鏈寡核苷酸中引入側接靶序列的限制性位點，并且例如可用于引入替代性DNA。以限制性酶切割質粒或其它載體，將具有相容性粘末端的寡核苷酸序列連接進入質粒或其它載體中以替換原始DNA。
[0092]其它體外定點誘變方法是本領域技術人員已知的并且是可實現的(尤其是，使用重疊延伸聚合酶鏈式反應(PCR)，見，例如，Parikh和Guengerich, B1techniques24:428-431 (1998))。與變化位點重疊的互補性引物可用于在混合物中PCR擴增完整質粒，所述混合物包含500mM dNTP，2單位的Pfu聚合酶，250ng每種正義和反義引物，以及200ng包含編碼含有肽配體結構域的多肽的序列的質粒DNA。PCR優選包括18個循環，對于每Kb的DNA，延伸時間為2.5分鐘。可以以DpnI (其僅消化腺嘌呤甲基化的質粒DNA)處理PCR產物，并轉化進入大腸桿菌DH5ci細胞。可以通過限制性酶消化就引入的變化來篩選轉化子，然后可以通過DNA序列分析來確認。
[0093]合適的蛋白檢測和含有肽配體結構域的多肽的定量測定方法包括Western印跡、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、銀染、BCA測定(見，例如，Smith等人，Anal.B1chem., 150, 76-85 (1985))、Lowry 蛋白測定(描述于，例如，Lowry 等人，J.B1l.Chem.，193，265-275(1951))(其是基于蛋白_銅復合物的比色測定)，以及Bradford蛋白測定(描述于，例如，Bradford等人，Anal.B1chem.，72，248 (1976))(其依賴于蛋白結合之后考馬斯藍G-250的吸光率的變化)。一旦被表達，可以通過傳統的純化方法來純化含有肽配體結構域的多肽，例如離子交換、大小排阻或C18色譜。
[0094]II1.偶聯肽配體結構域的方法
[0095]用于將合適的活性試劑例如治療劑、化療劑、放射性核素、多肽等“偶聯”(或“綴合”或“交聯”)至含有肽配體結構域的多肽上的方法在本領域有完善的描述。在制備本文提供的綴合物時，通過本領域目前已知用于連接兩個部分的任意方法將活性試劑直接或間接連接至肽配體結構域，只要綴合或偶聯部分與肽配體結構域的連接不實質上妨礙肽配體結構域的功能或實質上妨礙活性試劑的功能即可。偶聯可以通過任意合適的方法進行，包括但不限于，離子和共價鍵，以及任意其它足夠穩定的結合，由此將調節被靶向的試劑的分布。
[0096]用于在氨基和巰基之間形成共價鍵以及用于向蛋白中導入巰基的多種異雙官能交聯劑是本領域技術人員已知的(見，例如，Cumber等人(1992)B1conjugateChem.3，:397 401 ；Thorpe 等人(1987) Cancer Res.47:5924 5931 ；Gordon 等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.84:308 312 ;Walden 等人(1986)J.Mol.Cell Immunol.2:191197 ；Carlsson 等人(1978)B1chem.J.173:723 737 ;Mahan 等人(1987)Anal.B1chem.162:163170 ；ffawryznaczak 等人(1992)Br.J.Cancer66:361 366 ；Fattom 等人(1992)Infect1n&Immun.60:584 589)。這些試劑可用于在肽配體結構域或含有肽配體結構域的多肽與本文公開的任意活性試劑之間形成共價鍵。這些試劑包括但不限于:N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP ;二硫化物連接子)；硫代琥珀酰亞胺6-[3-(2-吡啶二硫)丙酰氨基]己酸酯(硫代-LC-SPDP);琥珀酰亞胺氧基羰基-α-甲基芐基硫代硫酸酯(SMBT，受阻的二硫酸酯連接子)；琥珀酰亞胺6-[3-(2_吡啶二硫)丙酰氨基]己酸酯(LC-SPDP);硫代琥珀酰亞胺4-(Ν-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)；琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫)丁酸酯(SH)B ;受阻的二硫鍵連接子)；硫代琥珀酰亞胺2-(7-疊氮-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1，3- 二硫丙酸酯(SAED);硫代-琥珀酰亞胺7-疊氮-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(SAMCA);硫代琥珀酰亞胺6_[ α -甲基-α _(2_吡啶二硫)甲苯酰胺(toluamido)]己酸酯(硫代-LC-SMPT) ;1，4-二-[3，_(2’-吡啶二硫)丙酰氨基]丁烷(DPDPB) ；4-琥珀酰亞胺氧基羰基-α -甲基-α - (2-吡啶硫)_甲苯(SMPT,受阻的二硫酸酯連接子)；硫代琥珀酰亞胺6[α-甲基-α_(2-吡啶二硫)甲苯酰胺]己酸酯(硫代-LC-SMPT) ；m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS) ；m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯(硫代-MBS) ;N-琥珀酰亞胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB ;硫醚連接子)；硫代琥珀酰亞胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(硫代-SIAB);琥珀酰亞胺4 (對馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(SMPB);硫代琥珀酰亞胺-4-(對馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(硫代-SMPB);疊氮苯甲酰基酰肼(ABH)。
[0097]其它的異雙官能可切割的偶聯劑包括:N-琥珀酰亞胺(4-碘乙酰)_氨基苯甲酸酯；硫代琥珀酰亞胺(4-碘乙酰)_氨基苯甲酸酯；4_琥珀酰亞胺-氧基羰基-a_(2-吡啶二硫)_甲苯；硫代琥珀酰亞胺_6-[a-甲基-a_(吡啶二硫)-甲苯酰胺]己酸酯；N-琥珀酰亞胺-3-(-2-吡啶二硫)_丙酸酯；琥珀酰亞胺6 [3 (-(-2-吡啶二硫)_丙酰氨基]己酸酯;硫代琥珀酰亞胺6 [3 (-(-2-吡啶二硫)_丙酰氨基]己酸酯；3-(2-吡啶二硫)_丙酰肼，Ellman氏試劑，二氯三嗪酸(dichlorotriazinic acid)，S-(2-硫卩比卩定)-L-半胱氨酸。另外的示例性的雙官能連接化合物公開于美國專利號5，349，066,5, 618，528,4, 569，789、4,952，394 和 5，137,877。
[0098]或者，可以使用例如多肽硫氫基進行綴合。另外，與糖蛋白例如抗體結合的糖部分可以被氧化以形成可用于本領域已知的多種偶聯程序的醛基。根據本發明形成的綴合物在體內可以是穩定的或不穩定的，例如可酶促降解的四肽鍵或酸不穩定性的順式-烏頭酰(aconityl)或腙鍵。
[0099]任選地，含有肽配體結構域的多肽通過一個或多個連接子與活性試劑連接。連接子部分根據所需的性質來選擇。例如，可以選擇連接子部分的長度以優化配體結合的動力學和特異性，包括由于配體與靶受體結合而誘導的任何構象變化。連接子部分的長度和靈活性應該足以允許多肽配體部分與靶細胞受體自由地相互作用。如果連接子太短或太剛硬，則在多肽配體部分與細胞毒素之間可能會有空間位阻。如果連接子部分太長，則活性試劑可能在生產過程中被降解，或者可能不會將所需的效應有效遞送至靶細胞。
[0100]本文中可以使用本領域技術人員已知的任意合適的連接子。一般而言，那些是融合蛋白的綴合物中將使用與通過化學方式產生的綴合物中的連接子不同的一組連接子。適合用于化學連接的綴合物的連接子和鍵包括但不限于:二硫鍵、硫醚鍵、受阻的二硫鍵和自由反應基例如胺和巰基之間的共價鍵。使用異雙功能試劑產生這些鍵以在多肽中的一個或二者中產生活性巰基，然后使一個多肽上的巰基與另一個多肽上的活性巰基或胺基(其上可以連接活性馬來酰亞胺基或巰基)反應。其它的連接子包括:酸可切割的連接子，例如雙馬來酰亞胺乙氧基丙燒(bismaleimideothoxy propane),酸不穩定性轉鐵蛋白綴合物和己二酸二酰肼，其將在更加酸性的細胞內區室內被切割；在暴露于UV或可見光后被切割的交聯連接子，以及連接子。在一些實施方式中，可以包括數種連接子以利用每種連接子的優點。可以通過將連接子共價偶聯至含有肽配體結構域的多肽和被靶向的試劑來插入化學連接子和肽連接子。如下文描述的異雙官能試劑可用于進行此類共價偶聯。還可以通過以融合蛋白形式表達編碼連接子和肽配體結構域的DNA，編碼連接子和活性試劑的DNA，或者編碼肽配體結構域、連接子和活性試劑的DNA來連接肽連接子。在本文中也考慮單獨使用或與其它連接子一起使用彈性連接子和增加綴合物溶解性的連接子。
[0101]因此，連接子可以包括但不限于:肽鍵、氨基酸和肽鍵，其通常包含I至大約30個氨基酸，更優選大約10至30個氨基酸。或者，化學連接子，例如異雙官能可切割的關聯連接子，包括但不限于:N-琥珀酰亞胺(4-碘乙酰)-氨基苯甲酸酯；硫代琥珀酰亞胺(4-碘乙酰)_氨基苯甲酸酯；4_琥珀酰亞胺-氧基羰基-a-(2-吡啶二硫)-甲苯；硫代琥珀酰亞胺_6-[a-甲基-a_(吡啶二硫)-甲苯酰胺]己酸酯；N-琥珀酰亞胺-3-(-2-吡啶二硫)_丙酸酯；琥珀酰亞胺6(3(-(-2-吡啶二硫)_丙酰氨基)己酸酯；硫代琥珀酰亞胺6 (3 (- (-2-吡啶二硫)-丙酰氨基)己酸酯；3_ (2-吡啶二硫)-丙酰肼，Ellman氏試劑，二氯二嗪酸，和S- (2-硫卩比唳)-L-半胱氨酸。
[0102]其它的連接子包括三苯甲基連接子，尤其是衍生的三苯甲基以產生一類綴合物，其提供在不同的酸度或堿度時釋放治療劑。通過預先選擇治療劑被釋放時的PH范圍而提供的靈活性允許基于需要遞送治療劑的組織之間的已知的生理差異來選擇連接子(見，例如，美國專利號5，612，474)。例如，腫瘤組織的酸度似乎比正常組織低。
[0103]也可以使用酸可切割的連接子，光可切割的連接子和熱敏感性連接子，尤其是在需要切割被靶向的試劑以允許其更容易地進入反應的情況下。酸可切割的連接子包括但不限于:二馬來酰亞胺乙氧基丙燒(bismaleimideothoxy propane)和己二酸二酰肼連接子(見，例如，Fattom等人(1992) Infect1n&Immun.60:584 589)，以及酸不穩定性轉鐵蛋白綴合物，其包含足夠的轉鐵蛋白部分以允許進入細胞內轉鐵蛋白循環途徑(見，例如，Welhoner 等人(1991) J.B1l.Chem.266:4309 4314)。
[0104]光可切割的連接子是在暴露于光后被切割的連接子(見,例如，Goldmacher等人(1992)B1conj.Chem.3:104 107,該連接子通過引用方式并入本文)，從而在暴露于光后釋放被祀向的試劑。在暴露于光后被切割的光可切割的連接子是已知的(見，例如，Hazum等人(1981) in Pept, Proc.Eur.Pept.Symp.,第 16 版，Brunfeldt, K (Ed)，pp.105 110,其描述了使用硝基苯甲基作為用于半胱氨酸的光可切割的保護性基團；Yen等人(1989)Makromol.Cheml90:69 82，其描述了水溶性的光可切割的共聚物，包括羥基丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、熒光素共聚物和甲基羅丹明共聚物；GoIdmacher等人(1992)B1conj.Chem.3:104 107，其描述了在暴露于近紫外光(350nm)后發生蛋白水解降解的交聯劑和反應劑；和Senter等人(1985)Photochem.Photob1l42:231 237，其描述了硝基芐氧基羰基氯化物交聯反應劑，其產生光可切割的鍵)，從而在暴露于光之后釋放被靶向的試齊U。此類連接子在治療可以使用纖維光學暴露于光的皮膚或眼科病況中是特別有用的。施用綴合物之后，可以使眼睛或皮膚或身體的其它部分暴露于光，從而使被靶向的部分從綴合物中釋放。此類光可切割的連接子可以與診斷程序聯合使用，其中需要除掉靶向試劑以允許迅速從動物體內清除。
[0105]IV.本發明提供了多種活性試劑
[0106]本發明的多個方面涉及偶聯于活性試劑即治療或診斷劑的含有肽配體結構域的多肽。
[0107]如本文使用的術語“治療劑”是指化學化合物，生物大分子，或從懷疑具有治療性質的生物材料例如細菌、植物、真菌或動物(尤其是哺乳動物)細胞或組織制備的提取物，例如化療劑或放療劑。如本文使用的術語“治療”是指緩解折磨哺乳動物受試者的疾病或相關病況的影響，治愈或預防(舉例而言，預防或減少靶向的疾病例如癌癥或其它增殖性疾病的機會)折磨哺乳動物受試者的疾病或相關病況。治愈性治療是指全部或部分地減輕哺乳動物中存在的疾病或病況。
[0108]試劑可以是純化的、實質上純化的或部分純化的。此外，此類治療劑可以在脂質體或免疫脂質體中或與之結合，綴合可以直接與所述試劑進行或與所述脂質體/免疫脂質體進行。“脂質體”是由多種類型的脂、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡，其可用于遞送藥物(例如，藥物、抗體、毒素)。脂質體的成分通常以類似于生物膜的脂排列的雙層形式排列。
[0109]可以按照本發明考慮到的方式偶聯于含有肽配體結構域的多肽的示例性治療劑包括但不限于:化療劑(例如，多西紫杉醇，紫杉醇，紫杉烷類化合物和鉬化合物)，抗葉酸類，抗代謝藥物，抗有絲分裂劑，DNA損傷劑，促凋亡劑，分化誘導劑，抗血管生成劑，抗生素，激素，肽，抗體，酪氨酸激酶抑制劑，生物活性劑，生物分子，放射性核素，阿霉素，安沙霉素抗生素，天冬酰胺酶，博萊霉素，白消安，順鉬，卡鉬，卡莫司汀，卡培他濱，苯丁酸氮芥，阿糖胞苷，環磷酰胺，喜樹堿，達卡巴嗪，更生霉素，柔紅霉素，右雷佐生，多西紫杉醇，阿霉素，依托泊苷，埃坡霉素，氟尿苷，氟達拉濱，氟尿嘧啶，吉西他濱，羥基脲，去甲氧柔紅霉素，異環磷酰胺，伊立替康，洛莫司汀，氮芥，巰基嘌呤，美法侖，甲氨蝶呤，雷帕霉素(西羅莫司)，絲裂霉素，米托坦，米托蒽醌，硝基脲，紫杉醇，帕米膦酸鈉，噴司他丁，光神霉素，甲基芐肼，美羅華，鏈脲菌素，替尼泊苷，硫鳥嘌呤，塞替派，紫杉烷類，長春堿，長春新堿，長春瑞濱，紫杉醇，康普立停，迪科莫奈得(discodermolides),反鉬，酪氨酸激酶抑制劑(高金雀花堿，genistein)和其它化療劑。
[0110]如本文使用的術語“化療劑”是指具有抗癌癥、腫瘤發生和/或增殖性疾病的活性的試劑。優選的化療劑包括:包含白蛋白的顆粒形式的多西紫杉醇和紫杉醇，其中50%以上的化療劑是納米顆粒的形式。最優選地，化療劑包含與白蛋白結合的紫杉醇的顆粒，例如Abraxane ⑧。
[0111]合適的治療劑還包括，例如，生物活性試劑(tTF的TNF)，放射性核素(1311，90Y，lllln, 211At, 32P和其它已知的治療性放射性核素)，抗血管生成劑(血管生成抑制劑，例如，INF-α，煙曲霉素，血管抑素，內皮抑素，薩利多胺等)，其它生物活性多肽，治療致敏劑，抗體，植物凝集素和毒素。
[0112]適合應用本發明的疾病包括惡性和良性病況，以及增殖性疾病，包括但不限于，其中增殖性疾病是例如良性前列腺增生、子宮內膜異位癥、子宮內膜增生、動脈硬化癥、牛皮癬、免疫增殖或增殖性腎小球病。
[0113]術語“治療上有效量”意思是部分或完全回復至與疾病或病況相關或誘發疾病或病況的正常生理或生化參數的量。本領域技術人員應該能夠確定相對于特定疾病或病況在治療上有效的藥物組合物的量。舉例而言，根據其中治療劑是紫杉醇的優選實施方式，施用的紫杉醇劑量可以是大約30mg/m2至大約1000mg/m2，服藥循環為大約三周(即，大約每三周施用一劑紫杉醇)，優選大約50mg/m2至大約800mg/m2,優選大約80mg/m2至大約700mg/m2,最優選大約250mg/m2至大約300mg/m2,服藥循環為大約三周,優選以大約2周循環,更優選每周循環。
[0114]本發明還具有診斷性的方面。例如，診斷劑可以是示蹤劑或標記物，包括但不限于:放射活性試劑、MRI造影劑、X射線造影劑、超聲造影劑以及PET造影劑。本發明的這個方面也考慮到這些試劑(如就治療劑所描述)的偶聯。此外，術語“診斷上有效量”是在相關的臨床環境中允許合理地精確測定組織和器官中的異常增殖、增生、重構、炎性活性的存在和/或程度的藥物組合物的量。例如，根據本發明“診斷”的病況可以是良性或惡性腫瘤。
[0115]本文教導的診斷劑包括多肽，例如抗體，其可以通過共價或非共價連接提供可檢測信號的物質而進行標記。多種標記物和綴合技術是已知的，并且在科技和專利文獻中進入了深入報道。合適的標記物包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學發光部分、磁性顆粒等。教導了此類標記物的用途的專利包括美國專利號3，817，837;3，850，752 ;3，939，350 ;3，996，345 ;4，277，437 ;4，275，149 ；和 4，366，241。同樣，可以產生重組免疫球蛋白，見Cabilly的美國專利號4，816，567 ；Moore等人的美國專利號4，642，334 ;和 Queen 等人(1989) Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA86:10029-10033。
[0116]可以通過任意合適的方法來監視和測定經由本發明的組合物和方法遞送至腫瘤或其它疾病位點的治療或診斷劑，所述方法包括例如，向組合物中添加放射活性標記物或放射不透性標記物并成像，這視情況而定，并且是本領域普通技術人員所熟知的。可以通過任意合適的方法包括例如靜脈穿刺來監測組合物在血漿區室內的隔離。
[0117]此外，在相關的方面，本發明提供了預測或測定腫瘤對化療劑的響應的方法，以及預測或測定增殖性疾病對化療劑的應答或治療增殖性疾病的方法，包括但不限于，其中所述增殖性疾病是例如良性前列腺增生、子宮內膜異位、子宮內膜增生、動脈硬化癥、牛皮癬、免疫增殖或增殖性腎小球病。
[0118]V.本發明提供了將肽配體結構域與多肽活性試劑偶聯的融合蛋白
[0119]本發明還考慮到將肽配體結構域與多肽活性試劑偶聯于融合蛋白中。例如但不限于，可以將肽配體結構域序列融合于診斷上有用的蛋白結構域(例如半抗原、GFP)、治療致敏劑、活性蛋白結構域(例如但不限于，tTF、TNF、Smarl衍生的p44肽、干擾素、TRAIL、Smac、VHL、前半胱天冬酶、半胱天冬酶和IL-2)或毒素(例如但不限于，篦麻毒素、PAP、白喉毒素、假單胞菌外毒素)的上游或下游。
[0120]“融合蛋白”和“融合多肽”是指具有至少兩個彼此共價連接的部分的多肽，其中每個部分是具有不同性質的多肽。所述性質可以是生物學性質，例如體外或體內的活性。所述性質也可以是簡單的化學或物理性質，例如與靶分子結合、催化反應等。所述部分可以通過單一的肽鍵直接連接或通過含有一個或多個氨基酸殘基的肽連接子連接。一般而言，所述部分和所述連接子將彼此處于讀碼框內。
[0121]V1.抗體或抗體片段活性劑
[0122]在本發明的一個具體方面，治療劑可以是抗體或抗體片段，其介導下列一項或多項:補體激活，細胞介導的細胞毒性，細胞凋亡，壞死性細胞死亡和調理作用。
[0123]本文中的術語“抗體”包括但不限于，單克隆抗體、多克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。抗體可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或源自其它物種。抗體是通過免疫系統產生的蛋白，其能夠識別并結合特異性抗原。靶抗原一般具有被多個抗體上的CDR識別的多個結合位點，也稱作表位。與不同表位特異性結合的每種抗體具有不同的結構。因此，一種抗原可以具有不止一種對應的抗體。抗體包括全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有免疫特異性地結合目標靶抗原或其部分的抗原結合位點的分子，此類靶標包括但不限于，產生與自身免疫病相關的自身免疫抗體的癌細胞。本文公開的免疫球蛋白可以是任意種類(例如，IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)或亞類(例如，IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl和IgA2)的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可以源自任意物種。
[0124]“抗體片段”包括全長抗體的保持所需生物活性的部分。“抗體片段”通常是抗原結合區或其可變區。抗體片段的實例包括:Fab, Fab’，F(ab') 2和Fv片段；diabodies ;線性抗體；通過Fab表達文庫產生的片段；抗-特異型(抗-1d)抗體；⑶R(互補決定區)和與癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原免疫特異性結合的上述任意項的表位結合片段；單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。然而，本文所述的“抗體片段”也可以是抗體的其它非抗原結合部分，例如但不限于，抗體片段可以是完整的或部分的Fe結構域。
[0125]單克隆抗體在本文中具體包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種的抗體或屬于特定抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的其余部分與源自另一物種的抗體或屬于另一抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或同源；以及此類抗體的片段，只要它們顯示出需要的生物學活性(美國專利號4，816，567)。本文中的目標嵌合抗體包括“靈長類源化的”抗體，其包含源自非人靈長類(例如舊世界猴或Ape)的可變域抗原結合序列和人類恒定區序列。
[0126]“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”是指細胞介導的反應，其中表達Fe受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結合的抗體，隨后引起靶細胞的裂解。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表達Fe Y RIII，而單核細胞表達Fe Y RI，Fe Y RII和Fe Y RIII。為了測定目標分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定(美國專利號55，003，621 ；U.S.Pat.N0.5,821, 337)。用于此類測定的有用的效應子細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。可替代的或另外，可以在體內測定目標分子的ADCC活性，例如，在動物模型例如在Clynes等人PNAS (USA), 95:652-656 (1998)中公開的動物模型中測定。
[0127]“誘導細胞死亡”的抗體是引起活細胞變得不存活的抗體。可以在不存在補體和免疫效應細胞的情況下測定體外細胞死亡，以區分抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)誘導的細胞死亡。因此，可以使用熱滅活的血清(即在不存在補體的情況下)和不存在免疫效應細胞的情況下進行細胞死亡測定。為了測定抗體是否能夠誘導細胞死亡，可以測定相對于未經處理的細胞而言膜完整性的喪失，這可以通過碘化丙啶(PI)、臺盼藍或7AAD的攝取來評價。誘導細胞死亡的抗體是在PI攝取測定中誘導BT474細胞攝取PI的那些抗體。
[0128]“誘導凋亡”的抗體是誘導程序性細胞死亡的抗體，如通過膜聯蛋白V的結合、DNA的片段化、細胞皺縮、內質網膨脹、細胞片段化和/或膜囊泡(稱作凋亡小體)的形成來測定。
[0129]VI1.調節活性試劑分布的方法
[0130]本發明的另一個方面利用了如本文公開的含有肽配體結構域的綴合物的性質以提供用于調節活性試劑在動物組織內的分布的方法，包括:向動物施用包含綴合物分子的組合物，所述綴合物分子包含綴合于活性試劑的肽配體結構域，其中所述肽配體結構域包括SEQ ID NO: 1- 117或121 — 125的肽或其同源物，并且相對于單獨施用活性試劑時所獲得的組織分布而言，向動物施用所述組合物引起不同的活性試劑組織分布。
[0131 ] 本發明的組合物和方法優選地提供了活性試劑向疾病位點的經調節的組織分布。優選地，其表現為:在疾病位點提供一定濃度的活性試劑，和/或增加的或延長的(半衰期)活性試劑血液水平，其大于向動物施用活性試劑(以未綴合的形式)時提供的濃度和水平。這種調節也可以表現為:增大組織攝取綴合肽分子的速率，增加分子在其靶位點即腫瘤處的保持，增大綴合的肽分子在組織中的擴散速率，和/或增加綴合的肽分子在組織中的分布，以及，使組織攝取綴合的肽分子的速率與一種或多種組織受體的內在化速率相匹配。可以通過本領域已知的任意合適的方法來測定此類增強，包括但不限于，檢測、定位和相對定量測定經適當標記的活性試劑，例如使用放射照相、顯微鏡、化學、免疫學或MRI技術。
[0132]“增大的速率”意思是至少大約高33 %，優選至少大約高25%，更優選至少大約高15%，最優選至少大約高10%的速率。“疾病位點處較大的濃度”意思是，在疾病位點處，綴合物中的活性試劑的濃度比相當的疾病位點處未綴合的活性試劑的濃度高至少大約33%，優選高至少大約25%，更優選高至少大約15%，最優選高至少大約10%。
[0133]合適的疾病位點包括但不限于，任意身體組織包括軟組織、結締組織、骨、實體器官、血管等中的異常增殖的病況、組織重構、增生、擴大的傷口愈合的位點。此類疾病的更具體的實例包括癌癥、糖尿病或其它腎病、炎癥、纖維化、關節炎、血管或人工血管移植物或血管內裝置的再狹窄等、白內障和黃斑退化、骨質疏松癥和骨的其它疾病、動脈硬化癥和其它經常觀察到鈣化的疾病。
[0134]在優選的方面，本發明提供了診斷和/或治療腫瘤的方法，其中所述腫瘤選自:口腔腫瘤、咽腫瘤、消化系統腫瘤、呼吸系統腫瘤、骨腫瘤、軟骨腫瘤、骨轉移、肉瘤、皮膚腫瘤、黑色素瘤、乳腺腫瘤、生殖系統腫瘤、尿道腫瘤、眼窩腫瘤、腦和中樞神經系統腫瘤、神經膠質瘤、內分泌系統腫瘤、甲狀腺腫瘤、食道腫瘤、胃腫瘤、小腸腫瘤、結腸腫瘤、直腸腫瘤、肛門腫瘤、肝臟腫瘤、膽囊瘤、胰腺腫瘤、喉腫瘤、肺的腫瘤、支氣管腫瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸腫瘤、子宮體腫瘤、卵巢腫瘤、外陰腫瘤、陰道腫瘤、前列腺腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、陰莖腫瘤、膀胱腫瘤、腎臟腫瘤、腎孟腫瘤、輸尿管腫瘤、頭頸腫瘤、副甲狀腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病。此外,本發明提供了預測或確定腫瘤對化療齊?的響應的方法，治療腫瘤的方法，用于預測哺乳動物腫瘤對化療劑的應答的試劑盒，其中所述腫瘤是肉瘤、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌、小細胞癌、基底細胞癌、透明細胞癌、癌細胞瘤(oncytoma)或其組合。
[0135]在另一方面，本發明提供了組合物和使用所述組合物的方法，其中，相對于單獨使用活性試劑之后獲得的血液水平，向動物施用所述組合物引起更高的活性試劑的血液水平。可以使用任意合適的活性試劑的血液水平的度量，包括但不限于，cmax，Cmin和AUC。〃大于單獨施用活性試劑后獲得的血液水平〃意思是:高至少大約33 %，優選高至少大約25 %，更優選高至少大約15%，最優選高至少大約10%的血液水平。
[0136]在另一個方面，本發明提供了組合物和使用所述組合物的方法，其中，相對于單獨使用活性試劑之后獲得的血液水平半衰期而言，向動物施用所述組合物引起更長的活性試劑的血液水平半衰期。"大于單獨施用活性試劑后獲得的血液半衰期"意思是:高至少大約33%，優選高至少大約25%，更優選高至少大約15%，最優選高至少大約10%的半衰期。
[0137]VII1.制劑和施用
[0138]對于體內使用，優選將偶聯于肽配體結構域例如SEQ ID NO: 1_117及其同源物的活性試劑配制成包含藥學上可接受的載體的藥物組合物。在本發明的上下文中可以使用任意合適的藥學上可接受的載體，這取決于施用途徑。本領域技術人員將認識到可以用于提供適合于所需施用方法的藥物組合物的那些載體。
[0139]本發明的藥物組合物的施用可以通過任意合適的途徑完成，包括但不限于:靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、腫瘤內、經口、經直腸、經陰道、膀胱內和吸入施用，其中靜脈內和腫瘤內施用是最優選的。組合物還可以包含任意其它合適的成分，尤其是用于增強組合物的穩定性和/或其終用途。因此，本發明的組合物有多種合適的制劑。以下制劑和方法僅僅是示例性的，絕不是限制。
[0140]如果需要，藥物組合物還可以包括另外的治療劑或生物活性試劑。例如，可以存在可用于治療特定適應癥的治療因子。控制炎癥的因子例如布洛芬或類固醇可以是組合物的一部分，以減少與體內施用藥物組合物相關的腫脹和炎癥以及生理疼痛。
[0141]載體通常是液體，但也可以是固體，或液體與固體成分的組合。載體優選為生理上可接受的(例如藥學上可接受的或藥理學上可接受的)載體(例如賦形劑或稀釋劑)。生理上可接受的載體是本領域熟知的并且是可以容易獲得的。載體的選擇將至少部分由靶組織和/或細胞的位置以及用于施用組合物的特定方法決定。
[0142]通常而言，此類組合物可以配制為可注射的液體溶液或懸浮液；也可以配制為適合用于在注射前通過添加液體來制備溶液或懸浮液的固體形式；制備物也可以是乳化的。適合于可注射用途的藥物制劑包括無菌水性溶液或分散液；含有已知的蛋白穩定劑和凍干保護劑的制劑；含有芝麻油、花生油或水性丙二醇的制劑；以及用于即用即配的無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。在所有的情況下，制劑必須是無菌的并且其流動性必須達到容易注射的程度。其在生產和儲存的條件下必須是穩定的，并且必須能抗微生物例如細菌和真菌的污染作用而保存。可以在水中通過適宜地與表面活性劑例如羥基纖維素混合來制備游離堿或藥學上可接受鹽形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在油中制備分散液。在通常的儲存和使用條件下，這些制備物含有防腐劑以阻止微生物的生長。
[0143]含有肽配體結構域的綴合物，可以配制為例如中性或鹽形式的組合物。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白質的游離氨基形成)以及與無機酸例如鹽酸或磷酸形成的鹽，或者與有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機堿例如異丙胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等。
[0144]適合于非腸道施用的制劑包括水性和非水性等滲無菌注射溶液，其可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與目標接受體的血液等滲的溶質；水性和非水性的無菌懸浮液，其可以包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。制劑的形式可以是單元劑量或多劑的密封的容器，例如安瓿和小瓶，并且可以儲存在冷凍干燥(凍干)的條件下，在臨使用前，僅需要添加無菌的液體賦形劑例如用于注射的水。可以從無菌粉末、顆粒和之前描述的類型的片劑來制備即用型的注射溶液和懸浮液。在本發明的一個優選實施方式中，將含有肽配體結構域的綴合物配制為用于注射(例如，非腸道施用)。在這個意義上，所述制劑優選適合于腫瘤內施用，但也可以配制為用于靜脈內注射、腹膜內注射、皮下注射等。
[0145]如果需要，本發明還提供了這樣的實施方式:其中含有肽配體結構域的綴合物(即，綴合于活性試劑的含有肽配體結構域的多肽)進一步綴合于聚乙二醇(PEG)。PEG綴合能夠增加這些多肽的循環半衰期，降低多肽的免疫原性和抗原性，并改善其生物活性。如果使用，則可以使用任意合適的PEG綴合方法，包括但不限于:使甲氧基-PEG與肽的可供利用的氨基或其它活性反應位點例如組氨酸或半胱氨酸反應。此外，可以使用重組DNA技術將具有PEG反應活性基團的氨基酸添加到含有肽配體結構域的綴合物中。此外，根據本發明的這個方面，可以使用可釋放的和雜合的聚乙二醇化策略，例如多肽的聚乙二醇化，其中，添加到含有肽配體結構域的綴合物分子上的某些位點的PEG分子在體內被釋放。PEG綴合方法的實例是本領域已知的。見,例如,Greenwald等人，Adv.Drug DeliveryRev.55:217-250(2003)。
[0146]適合于通過吸入施用的制劑包括氣溶膠制劑。可以將氣溶膠制劑置于加壓的可接受的推進劑中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等。它們還可以被配制為非加壓的制劑，用于從噴霧器或霧化器遞送。
[0147]可以通過將活性成分與多種基底例如乳化基底或水溶性基底混合而將適合用于肛門施用的制劑制備為栓劑。適合于陰道施用的制劑可以是陰道栓劑、棉塞、霜、凝膠、糊、泡沫或噴霧制劑的形式，其中除了活性成分之外，還含有例如本領域已知的這類載體。
[0148]此外，本發明的組合物可以包括另外的治療劑或生物活性試劑。例如，可以存在可用于治療特定適應癥的治療因子。控制炎癥的因子例如布洛芬或類固醇可以是組合物的一部分，以減少與體內施用藥物組合物相關的腫脹和炎癥以及生理疼痛。
[0149]在吸入式治療的情況下，本發明的藥物組合物優選是氣溶膠的形成。用于施用藥劑(如果是固體形式)的氣溶膠和噴霧發生器是可以獲得的。這些發生器提供可呼吸的或可吸入的顆粒，并以適合于人類施用的速率產生一定體積的氣溶膠，其中含有預先確定計量的劑量的藥物。此類氣溶膠和噴霧發生器的實例包括本領域已知的帶計量的劑量吸入器和吹藥器。如果是液體形式，則本發明的藥物組合物可以通過任意合適的裝置進行氣霧化。
[0150]當用于靜脈內、腹膜內或腫瘤內施用時，本發明的藥物組合物可以包含活性化合物的無菌的水性和非水性注射溶液、懸浮液或乳液，其中所述制劑優選與目標接受體的血液等滲。這些制劑可以包含下列一項或多項:抗氧化劑、緩沖劑、表面活性劑、助溶劑、抑菌齊U、使組合物與目標接受體的血液等滲的溶質和本領域已知的其它制劑成分。水性和非水性的無菌懸浮液可以包含懸浮劑和增稠劑。組合物的形式可以是單元劑量或多劑的容器，例如密封安瓿和小瓶。
[0151]本發明的方法還可以是組合治療的一部分。術語“組合治療”是指:按照順次或同時的方式與另一種治療組合物聯合施用根據本發明的治療劑，從而在接受治療的哺乳動物中實現該組合的有益效果。
[0152]IX.本發明適用于多種病況
[0153]本發明的組合物和方法適合用于診斷或治療多種疾病，包括但不限于，其中疾病位點是，任意身體組織包括軟組織、結締組織、骨、實體器官、血管等中的異常增殖的病況、組織重構、增生、擴大的傷口愈合的位點。此類疾病的更具體的實例包括癌癥、糖尿病或其它腎病、炎癥、纖維化、關節炎、血管或人工血管移植物或血管內裝置的再狹窄等、白內障和黃斑退化、骨質疏松癥和骨的其它疾病、動脈硬化癥和其它經常觀察到鈣化的疾病。
[0154]在一個優選的方面，本發明提供了診斷和/或治療腫瘤的方法，其中所述腫瘤選自:口腔腫瘤、咽腫瘤、消化系統腫瘤、呼吸系統腫瘤、骨腫瘤、軟骨腫瘤、骨轉移、肉瘤、皮膚腫瘤、黑色素瘤、乳腺腫瘤、生殖系統腫瘤、尿道腫瘤、眼窩腫瘤、腦和中樞神經系統腫瘤、神經膠質瘤、內分泌系統腫瘤、甲狀腺腫瘤、食道腫瘤、胃腫瘤、小腸腫瘤、結腸腫瘤、直腸腫瘤、肛門腫瘤、肝臟腫瘤、膽囊瘤、胰腺腫瘤、喉腫瘤、肺的腫瘤、支氣管腫瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸腫瘤、子宮體腫瘤、卵巢腫瘤、外陰腫瘤、陰道腫瘤、前列腺腫瘤、前列腺癌、睪丸腫瘤、陰莖腫瘤、膀胱腫瘤、腎臟腫瘤、腎孟腫瘤、輸尿管腫瘤、頭頸腫瘤、副甲狀腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病。此外，本發明提供了預測或確定腫瘤對化療劑的響應的方法，治療腫瘤的方法，用于預測哺乳動物腫瘤對化療劑的應答的試劑盒，其中所述腫瘤是肉瘤、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌、小細胞癌、基底細胞癌、透明細胞癌、癌細胞瘤或其組合。
[0155]本發明提供了這樣的實施方式，其中所述疾病是哺乳動物包括但不限于人中的疾病。
[0156]X.試劑盒
[0157]本發明提供了用于治療腫瘤的試劑盒，其包含藥物制劑和在治療腫瘤中使用該制劑的說明書，其中所述藥物制劑包含綴合物分子，所述綴合物分子包含綴合于活性試劑的肽配體結構域，并且其中所述肽配體結構域包括SEQ ID NO: 1- 117或121 — 125的肽或其同源物，其中所述肽配體結構域針對人血清白蛋白具有親和力，該親和力表征為大約700 μ M或更低的平衡解離常數(Kd)，任選地，其中所述綴合物分子還包含第二肽配體結構域，以及使用所述試劑盒的說明書(例如，FDA批準的包裝插頁)。
[0158]以下實施例進一步詮釋了本發明，但是，當然不應該被解釋為以任何方式限制其范圍。
[0159]實施例1
[0160]本實施例證明了使用噬菌體顯示技術鑒定SPARC結合肽，以及將此類SPARC結合肽引入到分子中以進行腫瘤治療。
[0161]具體地，主要目標是產生具有綴合于治療劑或診斷劑的SPARC結合肽的分子。特別地，目標是產生SPARC結合肽-Fe融合蛋白(圖1)，其中抗體Fe結構域作為治療劑發揮作用:其刺激免疫功能，例如，抗體依賴性細胞毒性(ADC)或細胞依賴性細胞毒性(CDC)。
[0162]顯示方法的一般原理是將配體(例如肽、蛋白)連接于編碼該配體的基因(見圖2)。在噬菌體顯示技術中，這是通過將配體基因與編碼絲狀噬菌體的包被蛋白的基因融合而獲得的。然后將重組的噬菌體基因組導入大腸桿菌，其中雜合蛋白將與所有其它的噬菌體蛋白一起被表達。然后融合蛋白將被摻入到含有噬菌體基因組(含有配體基因)的噬菌體包被中。可以在固定化的靶標上選擇顯示出所述配體的分泌的噬菌體顆粒，同時洗掉所有的非結合性噬菌體。洗脫步驟之后，回收的噬菌體用于感染大腸桿菌以允許擴增該噬菌體以進行新一輪的選擇，最終用于結合分析。
[0163]因此，就與SPARC結合的肽篩選了商售的肽噬菌體顯示文庫(M13中的12_mer的肽)。靶標SPARC是酸性的糖蛋白，PI為4.6。通過使用pH9.6的包被緩沖液固定于96孔板，使用噬菌體顯示技術對Ph.D.-12肽文庫進行了四輪篩選以選擇肽結合劑。具體地，在第一輪篩選中，使用酸性洗脫溶液洗脫結合的噬菌體。然后，通過降低靶標蛋白濃度并增加洗滌緩沖液中的Tween-20的百分率而逐漸增加篩選的嚴格性。同時，以過量的靶標進行競爭性洗脫以改進篩選的特異性。最后，經過四輪篩選，將所選的克隆的ssDNA進行DNA測序。同時，使用噬菌體ELISA驗證陽性噬菌體與靶蛋白的結合。
[0164]就SPARC結合肽篩選肽噬菌體顯示文庫的該篩選的結果顯示于圖3和4。可以通過分離的編碼具有相同序列的肽的噬菌體克隆的數目(圖3)，或者通過SPARC結合的親和性(如通過表達肽的噬菌體與SPARC包被的微量滴定板孔的結合所測定)(圖4)來定量測定SPARC的結合。對通過噬菌體顯示鑒定的兩個肽H)15 (SEQ ID NO:1)和H)21(SEQ IDNO:2)進行進一步表征。
[0165]然后將TO15和TO21克隆進入表達載體pFUSE-hIgl_Fc2 (圖5)，得到編碼H)15-Fc和TO21-FC融合蛋白的質粒(圖6)。表達并成功純化了這些融合蛋白，如通過聚丙烯酰胺凝膠電泳所證明(圖7)。
[0166]Η)15和Η)21的蛋白微陣列分析(見圖8)顯不:在陣列(Invitrogen, ProtoArrayv.3)上所測定的5，000種蛋白中，僅有極少量的與非SPARC蛋白的交叉反應活性。
[0167]濃度依賴性結合ELISA測定證明了:PD15和TO21與SPARC的結合僅稍弱于抗-SPARC抗體(圖9)。PD15與SPARC結合的Kd值是4.1±0.6X1(T8M，PD21則是
1.0±0.7Χ1(ΤΜ (所測的抗-SPARC抗體與SPARC結合的Kd值是6.2 ±3.410_9Μ，即該抗體與SPARC的結合親和性僅僅稍高些)。
[0168]圖10和11顯示了人腦腫瘤切片(已經就IHC染色進行了表位標簽化)中SPARC的共定位(如通過以抗-SPARC抗體進行的免疫組化(IHC)染色所示)和Η)15及TO21的結合。如圖10所示，文獻報道的stabilinl與SPARC的結合未得到證實，因為stab-Fc不與腫瘤組織結合，而Η)15和TO21與腫瘤組織結合(圖11)。
[0169]通過噬菌體顯示分離的SPARC結合肽的序列同源性分析證明:所分離的多個SPARC結合肽序列與如圖12所示的彈性蛋白的區域具有序列同一性。
[0170]因此，本實施例證明:可以通過噬菌體顯示鑒定SPARC結合肽，以及如何進一步表征所鑒定的肽。在建立的兩個克隆roi5和TO21中，在ELISA和IHC實驗中TO15顯示出比PD21更高的針對SPARC的親和性。
[0171]實施例2
[0172]在鼠-人PC3前列腺癌異種移植物模型中測定了 Η)15和TO21-FC融合蛋白的抗腫瘤活性。Η)15和TO21-FC融合蛋白都顯示出統計學上顯著的腫瘤生長抑制(圖13)。PD15顯示出比TO21更好的針對PC3異種移植物的抗腫瘤活性。在小鼠-人HT29結腸異種移植物模型中，FO21顯示出比FO15更好的抗腫瘤活性，PD21的活性接近等同于Abraxane (圖14)。
[0173]實施例3
[0174]本實施例證明了 SPARC結合肽的潛在的免疫原性。
[0175]ProPred是用于預測抗原性蛋白序列中的MHC II類結合區的圖形網上工具(見Singh等人:ProPrechpredict1n of HLA-DR binding sites.B1informatics2001, 17 (12):1236-7)。服務器執行基于基質的預測算法，使用從文獻中推導而來的氨基酸/位置系數表。所預測的結合劑可以顯示為圖形界面中的峰或顯示為HTML界面中的有顏色的殘基。該服務器可能是定位能夠結合數個HLA-DR等位基因的混雜結合區的有用工具。
[0176]以噬菌體顯示鑒定的SPARC結合肽(包括TO21和TO15)的ProPred分析結果表明:僅有少數幾個HLA-DR分子將呈遞這些肽，并且暗示這些肽將不會具有非常高的免疫原性。
[0177]本文公開的顯示出高親和性的任意肽，包括例如SEQ ID NO: 1_112或117，可以類似地分析為低免疫原性或無免疫原性。
[0178]實施例4
[0179]可以使用不同的形式在噬菌體上顯示抗體片段。單鏈可變片段(scFv)是免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區的融合物，通過短的(通常是絲氨酸、甘氨酸)連接子連接在一起。這種嵌合分子保留原始免疫球蛋白的特異性，雖然其除掉了恒定區并導入了連接子肽。抗體噬菌體顯示的最常見的形式包括使用scFv文庫。因此，可以就是否存在抗原結合克隆來篩選抗體變體的大的集合。
[0180]總體策略是首先以SPARC作為抗原通過ELISA來篩選人類抗體噬菌體顯示文庫。
[0181]開始的時候，對HuScL-3?進行四輪篩選(三輪使用酸性洗脫，一輪使用競爭性洗脫)，通過噬菌體ELISA選擇了 17個陽性克隆。對這些克隆進行的DNA測序揭示出兩個獨特的抗體序列，其中第一個序列在15個陽性克隆中是共有的，而第二個序列在其余2個陽性克隆中是共有的。然后，通過可溶性scFv ELISA驗證這兩個獨特抗體的結合特異性。
[0182]接下來，對HuScL-2?進行三輪篩選(兩輪使用胰蛋白酶消化洗脫，一輪使用競爭性洗脫)。最后，通過噬菌體ELISA選擇了 30個陽性克隆。根據測序結果，一個抗體序列在29個克隆中是共有的，其余I個克隆編碼另一個獨特抗體。然后，也通過可溶性scFvELISA驗證這兩種抗體的結合特異性。
[0183]鑒定了4 個獨特的針對 SPARC 的 scFv:ScFv3-l, ScFv3_2, ScFv2_l 和 scFv2_2 (SEQID NOs:113-116)。
[0184]本發明涉及以下實施方式:
[0185]實施方式1.用于將治療或診斷劑遞送至哺乳動物中的疾病位點的組合物，其包含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯于SPARC結合肽(SBP)的治療劑或診斷劑以及藥學上可接受的載體，其中所述SBP包含SEQ ID N0:l-112和117。
[0186]實施方式2.實施方式I的組合物，其中所述SBP包含
[0187]a.SEQ ID NO: 1-112中的任意一項的至少10個連續氨基酸，或
[0188]b.SEQ ID NO: 1-112中的兩項或更多項的至少10個連續氨基酸。
[0189]實施方式3.實施方式I的組合物，其中所述SBP包含SEQ ID NOs: 1-5的一項或多項。
[0190]實施方式4.實施方式I的組合物，其中所述SBP存在于兩個或更多個單獨的多肽上，并且所述SBP由下列組成:
[0191]a.SEQ ID NOs: 1-5中的任意一項的至少10個連續氨基酸或
[0192]b.SEQ ID NOs: 1-5中的兩項或更多項的至少10個連續氨基酸。
[0193]實施方式5.實施方式I的組合物，其中所述SBP包含SEQ ID NO: 117的至少10
個連續氨基酸。
[0194]實施方式6.實施方式I的組合物，其中存在兩種或更多種單獨的SBP，其中每種單獨的SBP包含SEQ ID NO: 1-112中的任意一項的至少10個連續氨基酸。
[0195]實施方式7.實施方式I的組合物，其中存在兩種或更多種單獨的SBP，其中所述單獨的SBP由SEQ ID NO: 1-5或117中的一項或多項組成。
[0196]實施方式8.實施方式I至7的任一項的組合物，其中所述治療劑或診斷劑是選自下列的治療劑:鉬化合物，抗葉酸類，抗代謝類藥物，抗有絲分裂劑，DNA損傷劑，促凋亡劑，分化誘導劑，抗血管生成劑，抗生素，酪氨酸激酶抑制劑，激酶抑制劑，生物活性劑，生物分子，激素、肽、抗體、抗體片段，及其組合。
[0197]實施方式9.實施方式8的組合物，其中所述治療劑是包含功能性抗體Fe結構域的抗體片段。
[0198]實施方式10.實施方式8的組合物，其中所述功能性抗體Fe結構域包含SEQ IDNO:118。
[0199]實施方式11.實施方式8的組合物，其中所述治療劑選自:放射性核素，阿霉素，安沙霉素抗生素，天冬酰胺酶，博萊霉素，白消安，順鉬，卡鉬，卡莫司汀，卡培他濱，苯丁酸氮芥，阿糖胞苷，環磷酰胺，喜樹堿，達卡巴嗪，更生霉素，柔紅霉素，右雷佐生，多西紫杉醇，阿霉素，依托泊苷，埃坡霉素，氟尿苷，氟達拉濱，氟尿嘧啶，吉西他濱，羥基脲，去甲氧柔紅霉素，異環磷酰胺，伊立替康，洛莫司汀，氮芥，巰基嘌呤，美法侖，甲氨蝶呤，雷帕霉素(西羅莫司)，絲裂霉素，米托坦，米托蒽醌，硝基脲，紫杉醇，帕米膦酸鈉，噴司他丁，光神霉素，甲基芐肼，美羅華，鏈脲菌素，替尼泊苷，硫鳥嘌呤，塞替派，紫杉烷類，長春堿，長春新堿，長春瑞濱，紫杉醇，康普立停，迪科莫奈得，反鉬，多西紫杉醇，紫杉醇，紫杉烷，5-氟尿嘧啶，抗-血管內皮生長因子化合物(“抗-VEGF”)，抗表皮生長因子受體化合物(“抗-EGFR”)，高金雀花堿，tTF, TNF, Smarl衍生的p44肽、干擾素、TRAIL、Smac、VHL、前半胱天冬酶、半胱天冬酶和IL-2，非-Fe結構域抗體片段，及其組合。
[0200]實施方式12.實施方式I至7的任一項的組合物，其中所述治療劑或診斷劑是選自下列的診斷劑:放射活性試劑、MRI造影劑、X射線造影劑、超聲造影劑以及PET造影劑。
[0201]實施方式13.實施方式1-12任一項的組合物，其還包含白蛋白結合肽(ABP)，其中所述 ABP 包含 SEQ ID NO: 119 或 SEQ ID NO: 120 或者 SEQ ID N0S: 119 和 120 兩者。
[0202]實施方式14.實施方式13的組合物，其中所述SBP和所述ABP存在于相同的多肽中。
[0203]實施方式15.實施方式13的組合物，其中所述SBP和所述ABP存在于不同的多肽中。
[0204]實施方式16.用于將治療劑或診斷劑遞送至哺乳動物中的疾病位點的方法，包含治療或診斷上有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含偶聯于SPARC結合肽的治療劑或診斷劑以及藥學上可接受的載體，其中所述SBP包括SEQ ID NO: 1-117的任意一項。
[0205]實施方式17.在實施方式16的方法，其中所述SBP包含
[0206]a.SEQ ID NO: 1-112中的任意一項的至少10個連續氨基酸，或
[0207]b.SEQ ID NO: 1-112中的兩項或更多項的至少10個連續氨基酸。
[0208]實施方式18.實施方式16的方法，其中存在兩種或更多種單獨的SBP，其中所述單獨的SBP由SEQ ID NO: 1-5和117中的一項或多項組成。
[0209]實施方式19.實施方式16的方法，其中存在兩種或更多種單獨的多肽，每一種多肽由至少一個SBP組成，并且其中所述SBP包含SEQ ID NO: 1-112中的任意一項的至少10
個連續氨基酸。
[0210]實施方式20.實施方式16至19的任一項的方法，其中所述治療劑或診斷劑是選自下列的治療劑:鉬化合物，抗葉酸類，抗代謝類藥物，抗有絲分裂劑，DNA損傷劑，促凋亡齊IJ，分化誘導劑，抗血管生成劑，抗生素，酪氨酸激酶抑制劑，激酶抑制劑，生物活性劑，生物分子，激素、肽、抗體、抗體片段，及其組合。
[0211]實施方式21.實施方式20的方法，其中所述治療劑是包含功能性抗體Fe結構域的抗體片段。
[0212]實施方式22.實施方式21的方法，其中所述治療劑是介導下列一項或多項的抗體片段:補體激活、細胞介導的細胞毒性、誘導細胞凋亡、誘導細胞死亡和調理作用。
[0213]實施方式23.實施方式20或21的方法，其中所述抗體片段包含SEQ ID NO: 118。
[0214]實施方式24.實施方式20的方法，其中所述治療劑選自:放射性核素，阿霉素，安沙霉素抗生素，天冬酰胺酶，博萊霉素，白消安，順鉬，卡鉬，卡莫司汀，卡培他濱，苯丁酸氮芥，阿糖胞苷，環磷酰胺，喜樹堿，達卡巴嗪，更生霉素，柔紅霉素，右雷佐生，多西紫杉醇，阿霉素，依托泊苷，埃坡霉素，氟尿苷，氟達拉濱，氟尿嘧啶，吉西他濱，羥基脲，去甲氧柔紅霉素，異環磷酰胺，伊立替康，洛莫司汀，氮芥，巰基嘌呤，美法侖，甲氨蝶呤，雷帕霉素(西羅莫司)，絲裂霉素，米托坦，米托蒽醌，硝基脲，紫杉醇，帕米膦酸鈉，噴司他丁，光神霉素，甲基芐肼，美羅華，鏈脲菌素，替尼泊苷，硫鳥嘌呤，塞替派，紫杉烷類，長春堿，長春新堿，長春瑞濱，紫杉醇，康普立停，迪科莫奈得，反鉬，多西紫杉醇，紫杉醇，紫杉烷，5-氟尿嘧啶，抗-血管內皮生長因子化合物(“抗-VEGF”)，抗表皮生長因子受體化合物(“抗-EGFR”)，高金雀花堿，tTF, TNF, Smarl衍生的p44肽、干擾素、TRAIL、Smac、VHL、前半胱天冬酶、半胱天冬酶和IL-2，非-Fe結構域抗體片段，及其組合。
[0215]實施方式25.實施方式14至19的任一項的方法，其中所述治療劑或診斷劑是選自下列的診斷劑:放射活性試劑、MRI造影劑、X射線造影劑、超聲造影劑以及PET造影劑。
[0216]實施方式26.實施方式16至25的任一項的方法，其還包含ABP，所述ABP包含SEQID NO: 119 或 SEQ ID NO: 120 或者 SEQ ID N0S: 119 和 120 兩者。
[0217]實施方式27.實施方式26的組合物，其中所述SBP和所述ABP存在于相同的多肽中。
[0218]實施方式28.實施方式26的組合物，其中所述SBP和所述ABP存在于不同的多肽中。
[0219]實施方式29.實施方式16至28的任一項的方法，其中所述疾病位點是腫瘤。
[0220]實施方式30.實施方式16至28的任一項的方法，其中所述疾病位點是任意身體組織包括軟組織、結締組織、骨、實體器官、血管等中的異常細胞增殖的病況、組織重構、增生、擴大的傷口愈合的位點。
[0221]實施方式31.實施方式16至28的任一項的方法，其中所述疾病位點是糖尿病或其它腎病、炎癥、纖維化、關節炎、血管或人工血管移植物或血管內裝置的再狹窄等、白內障和黃斑退化、骨質疏松癥和骨的其它疾病、動脈硬化癥和其它經常觀察到鈣化的疾病的位點。
[0222]實施方式32.實施方式16-28任一項的方法，其中所述哺乳動物是人患者。
[0223]本文引用的所有參考文獻，包括公開物、專利申請和專利通過引用方式并入本文，達到如同每篇參考文獻都單獨且特別被指明通過引用方式并入并以其全文顯示于本文的程度。
[0224]在描述本發明的上下文中(尤其是以下權利要求的上下文中)術語"一種/個(a) 〃和〃 一種/個(an) 〃和〃該/所述(the) 〃的使用應該被解釋為涵蓋了單數和復數，除非本文中另有指明或上下文明顯矛盾。除非另有指明，否則術語〃含有(comprising)"、〃具有(having) 〃、〃包括(including) 〃和〃含有(containing) 〃應該被解釋為開放式術語(即，意思是“包括但不限于”)。除非本文另有指明，否則本文中提及的數值范圍僅僅是作為單獨提及落在該范圍內的每個單獨數值的簡便方式，并且每個單獨數值并入本說明書中，如同在本文中單獨提及一樣。除非本文另有指明或者上下文明顯矛盾，否則本文描述的所有方法可以通過任意合適的順序進行。除非另有要求，否則本文提供的任意和所有實施例或示例性語言(例如“例如”)僅僅意在更好地詮釋本發明，而不對本發明的范圍進行限制作用。本說明書中的任何語言不應被解釋為指明未要求保護的要素對于本發明的實施是必不可少的。
[0225]在本文中描述了本發明的優選實施方式，包括本發明人已知的用于實施本發明的最佳模式。本領域普通技術人員在閱讀了上述說明書之后，那些優選實施方式的變體會變得明顯。本發明人預期技術人員視情況而應用此類變體，本發明人想到本發明可以按照除了本文特異性描述以外的方式來實施。因此，本發明包括適用法律所允許的隨附的權利要求中提及的主題的所有修飾和等同物。此外，除非本文另有指明或上下文明顯矛盾，否則本發明中包括上述要素的以其所有可能變體進行的任意組合。
【權利要求】
1.用于將功能性抗體Fe結構域遞送至哺乳動物中的腫瘤的組合物，其包含治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含與一個或多個SPARC結合肽即SBP偶聯的功能性抗體Fe結構域以及藥學上可接受的載體，其中每個SBP由SEQ ID NO: 2組成。
2.偶聯于一個或多個SPARC結合肽即SBP的功能性抗體Fe結構域在制備用于將所述Fe結構域遞送至哺乳動物中的腫瘤的藥物中的用途，其中每個SBP由SEQ ID N0:2組成。
3.權利要求2的用途，其中所述哺乳動物是人患者。
【文檔編號】A61K47/42GK104174025SQ201410346267
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2009年12月7日 優先權日:2008年12月5日
【發明者】V·特里魯 申請人:阿布拉西斯生物科學有限責任公司