專利名稱：蛋白激酶Mnk2a的新用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白激酶Mnk2a的新用途。
發明背景帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)是中樞神經系統常見的神經退行性變性疾病， 其發病率在神經變性疾病中居第二，僅次于Alzheimer病(老年癡呆癥)。PD患者的主要病理改變為中腦黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經元變性壞死和病人腦內Lew小體(Lewy ’s body, LB)的形成。但是，導致多巴胺能細胞選擇性凋亡和路易小體形成的機制尚不清楚。
一般認為α -synuclein過表達或突變會引起α -synuclein聚集從而產生細胞毒性，導致多巴胺能神經元的選擇性凋亡，而這種α-synuclein聚集物正是黑質中的路易小體(LB)的主要成分，但是什么機制引發了 α-synuclein聚集形成了有毒性的物質，目前研究尚不清楚。已有的研究顯示α-synuclein的磷酸化在這個聚集過程中具有很重要的作用。尤其是第1 位絲氨酸的磷酸化，它是唯一廣泛分布于帕金森病患者大腦中的位點，這暗示著α-synuclein 1 位絲氨酸的磷酸化在PD發病過程中起著一定的作用。
如今，已發現的可以磷酸化α -synuclein絲氨酸第1 位的激酶有酪蛋白激酶 (CKl和CK2)以及G蛋白偶聯受體激酶家族(GRK2，GRK3, GRK5和GRK6)等，涉及到PD發病過程的機制有泛素-蛋白酶體系統，線粒體功能障礙和氧化應激等，然而對于導致PD發病的相關基因和分子機制仍沒有很全面的論述。發明內容
本發明的目的在于提供一種蛋白激酶Mnl^a在制備治療帕金森氏病藥物中的應用。
本發明主要包括構建細胞表達質粒載體pcDNA3. 1_ α -synuclein, pcDNA3. 1-α -synuclein_S129A 以及 pcDNA3. 1-Mnk2a_myc ；western 檢測 α -synuclein 蛋白表達水平和其1 位絲氨酸磷酸化的水平；免疫細胞熒光的手段檢測MriMa對 α -synucleinl29絲氨酸的磷酸化在SH-5Y-5Y細胞內表現出來的生理學變化。
果蠅蛋白激酶LK6可以通過ERK信號通路調節α-synuclein 1 位絲氨酸的磷酸化，本發明們克隆了 LK6的人源同源基因Mnk^i即MAI3K相互作用的激酶-2的一個可變剪接體。通過western手段鑒定出MnMa可以通過ERK信號通路調節α-Synucleinl29 位絲氨酸的磷酸化，于此同時，通過細胞免疫熒光的手段檢測到在人神經母細胞瘤細胞 (SH-5Y-5Y)核內，Mnk^i會加劇類似于路易士小體的α -synuclein顆粒狀聚集物的形成。 這為全面研究PD的發病病因提供了進一步的依據和作用機制。
圖1為HEK293T細胞內α -synuclein的表達水平和磷酸化的情況圖2為Mnk^^i α -synucleinU9位絲氨酸磷酸化水平的鑒定。其中A為Western-blot 結果，蛋白總量一致，α-synuclein作為內參；B為α-synuclein第1 位絲氨酸磷酸化的變化的統計圖(p<0. 05)。
圖3為MnMa對α -Synucleinl29位絲氨酸磷酸化的作用導致SH-5Y-5Y細胞內 α-synuclein顆粒狀聚集物的形成.(A)細胞免疫熒光圖。(B)過表達a-synuclein以及Mnk2a與α-synuclein，細胞核內小顆粒數目變化統計圖(**P<0. 001 ；*P<0. 01)。
圖4為MnMa通過ERK信號通路磷酸化α -synuclein的129位絲氨酸。其中A 為Western-blot結果，蛋白總量一致，α-synuclein作為內參；B為α-synuclein第129 位絲氨酸磷酸化的變化的統計圖(P<0. 05)。
具體實施方式
實施例一檢測MnMa對α -Synucleinl29位絲氨酸磷酸化的效果1. ^ ii i(； # pcDNA3. 1-α-synuclein, pcDNA3. 1-α-Synuclein-S129A ( α -synucleinl29位的絲氨酸突變為丙氨酸)以及pcDNA3. 1-Mnk2a_myc的構建用特定引物做PCR分別從表達人源α -synuclein的果蠅中克隆出α -synuclein以及α -synuclein-S129A基因，從HEK293T細胞內克隆出MnMa基因，然后分別構建到 pcDNA3. 1與pcDNA3. 1-myc空載中，送出去測序，將測序結果與目的基因序列進行比較，證實構建的載體成功。
用于克隆Mnk2a目的基因的上游引物序列為5’ -cccaagcttaccatgcccgccagccag cccattg -3'下游弓丨物序列為5' -ccgctcgagtcaggcgtggtctcccaccag-3， Mnk2a目的基因的全長序列為atgcccgccagccagcccattgacatcccggacgccaagaagaggggcaagaagaagaagcgcggccgggcc accgacagcttctcgggcaggtttgaagacgtctaccagctgcaggaagatgtgctgggggagggcgctcatgcccg agtgcagacctgcatcaacctgatcaccagccaggagtacgccgtcaagatcattgagaagcagccaggccacattc ggagcagggttttcagggaggtggagatgctgtaccagtgccagggacacaggaacgtcctagagctgattgagttc ttcgaggaggaggaccgcttctacctggtgtttgagaagatgcggggaggctccatcctgagccacatccacaagcg ccggcacttcaacgagctggaggccagcgtggtggtgcaggacgtggccagcgccttggactttctgcataacaaag gcatcgcccacagggacctaaagccggaaaacatcctctgtgagcaccccaaccaggtctcccccgtgaagatctgt gacttcgacctgggcagcggcatcaaactcaacggggactgetcccctatctccaccccggagctgctcactccgtg cggctcggcggagtacatggccccggaggtagtggaggccttcagcgaggaggctagcatctacgacaagcgctgcg acctgtggagcctgggcgtcatcttgtatatcctactcagcggctacccgcccttcgtgggccgctgtggcagcgac tgcggctgggaccgcggcgaggcctgccctgcctgccagaacatgctgtttgagagcatccaggagggcaagtacga gttccccgacaaggactgggcccacatctcctgcgctgccaaagacctcatctccaagctgctggtccgtgacgcca agcagaggctgagtgccgcccaagtcctgcagcacccctgggttcaggggtgcgccccggagaacaccttgcccact cccatggtcctgcagaggaacagctgtgccaaagacctcacgtccttcgcggctgaggccattgccatgaaccggca gctggcccagcacgacgaggacctggctgaggaggaggccgcggggcagggccagcccgtcctggtccgagctacct cacgctgcctgcagctgtctccaccctcccagtccaagctggcgcagcggcggcaaagggccagtctgtcctcggcc ccagtggtcctggtgggagaccacgcctga表達載體使用的是空載pcDNA3. 1-myc，雙酶切位點分別是Hind III，Β ο I。
2.轉染構建好的表達載體進入HEK293T細胞將構建好的表達載體轉染到HEK293T細胞內，培養48小時后，抽蛋白做western分析。具體步驟為a).比較不做任何處理的HEK293T細胞和單獨轉染α -synuclein的細胞 α -synuclein蛋白的表達量以及其1 位絲氨酸磷酸化的改變。實驗結果表明HEK293T細胞內α-synuclein蛋白的表達量較低檢測不到，并且HEK293T細胞內本身存在著可以磷酸化a-SynucleinU9位絲氨酸的激酶。結果見圖1。
b).比較共轉染表達載體a -synuclein與Mnk2a以及單獨轉染表達載體 a-synuclein的細胞蛋白在a-synucleinU9位的磷酸化情況。結果顯示共轉染MnMa和 α -synuclein后，Mnk2a使α -synuclein的1 位絲氨酸的磷酸化水平提高了 1. 41倍。 實驗結果表明Mnk^i可以使α -Synucleinl29位絲氨酸磷酸化。結果見圖2。
3. 細胞免疫熒光檢測用α -synuclein的抗體檢測細胞內α -synuclein的表達量以及分布情況，其熒光標記物為FITC綠色熒光蛋白。轉染的細胞為人神經母細胞瘤細胞(SH-5Y-5Y)，共轉染表達載體α-synuclein與Mnk2a明顯比單獨轉染表達載體α-synuclein在細胞核內形成的α-synuclein顆粒的數量多，而共轉染表達載體 α -synuClein-S129A與Mnk^i并沒有在細胞核內出現類似的顆粒狀聚集物。實驗結果表明 Mnk2a促進了 α -Synucleinl29位的磷酸化以及這種磷酸化作用會加劇類似于路易士小體的α-synuclein顆粒狀聚集物的形成。結果見圖3。
實施例二 檢測ERK信號通路參與調節MnMa對α -Synucleinl29位的磷酸化作用使用ERK信號通路的激活劑PMA和抑制劑PD98059分別對共轉染了表達載體 α -synuclein與Mnk2a的細胞進行處理，然后抽提細胞蛋白，用于western手段分析。使用了 PMA處理的細胞α -synuclein第1 位絲氨酸磷酸化的水平提高了 1. 65倍，使用了 PD98059處理的細胞α -synuclein第1 位絲氨酸磷酸化的水平降低了 0. 80倍，而PMA的激活作用可以被PD98059處理后顯著的降低。實驗結果表明，MriMa可能是通過ERK信號通路來調節α-synuclein第1 位絲氨酸的磷酸化。結果參見圖4。
權利要求
1. 一種蛋白激酶MriMa在制備治療帕金森氏病藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白激酶Mnk2a的新用途，本發明通過western手段鑒定出Mnk2a可以通過ERK信號通路調節α-synuclein129位絲氨酸的磷酸化，于此同時，通過細胞免疫熒光的手段檢測到在人神經母細胞瘤細胞(SH-5Y-5Y)核內，Mnk2a會加劇類似于路易士小體的α-synuclein顆粒狀聚集物的形成。這為全面研究PD的發病病因提供了進一步的依據和作用機制。
文檔編號A61P25/16GK102526713SQ20121000810
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月12日 優先權日2011年5月18日
發明者夏瑩, 文鐵橋 申請人:上海大學