專利名稱：一種對日本血吸蟲病肝纖維化具有治療作用的dna疫苗及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種對日本血吸蟲病肝纖維化具有治療作用的DNA疫苗及其應用，此種DNA疫苗可直接用于動物試驗。
背景技術：
血吸蟲病(schistosomiasis)是一種流行廣泛、嚴重危害人類健康和社會經濟發展的人畜共患寄生蟲病。全球每年死于血吸蟲病的人數超過2萬。在我國流行的是日本血吸蟲病。日本血吸蟲(Schistosoma Japonicum, Sj)致病的主要原因是雌蟲所產的大量蟲卵沉積于肝、腸等組織中，形成蟲卵肉芽腫、組織損傷和繼發性肝纖維化，肝纖維化可進一步導致門脈高壓綜合癥如食管胃底靜脈曲張、肝脾腫大和脾功能亢進，患者可因并發上消化道出血、肝性昏迷及結腸息肉癌變等嚴重病癥而致死。目前，血吸蟲病疫苗的研究絕大多數集中在抗感染等預防性疫苗的研究上，而針對已經感染者，治療性疫苗的研究則極少見。血吸蟲感染人體后，雌蟲產出蟲卵為未成熟蟲卵，部分沉積于肝臟，經過初產期、空泡期、胚胎期發育至成熟蟲卵約需11日，雖然臨床上可以使用高效的抗蟲藥吡喹酮殺蟲治療，但吡喹酮只能殺滅3d以上的童蟲、成蟲，而肝臟內的未成熟蟲卵仍可繼續發育，并引起組織內蟲卵肉芽腫反應，目前血吸蟲性肝纖維化研究的重點在于對已經形成的纖維化的治療，尚無針對吡喹酮殺蟲后由未成熟蟲卵引起的肉芽腫反應的治療方法。且血吸蟲病患者發現時多已轉為慢性，體內早已形成肉芽腫或肝纖維化，殺蟲后病人依然有晚期轉化的可能，蟲卵等抗原的免疫病理反應并不因殺蟲治療而終止。因此，在血吸蟲病患者殺蟲化療后，如何有效應對那些已經沉積在肝內的蟲卵尤其是未成熟蟲卵所產生的免疫病理反應而導致的肝纖維化的進一步發展則成為當務之急。現已證實，細胞免疫和體液免疫均參與日本血吸蟲病性肝纖維化的發生、發展， 并以細胞免疫為主。肝纖維化的主要病理改變為血吸蟲卵抗原的持續刺激引起TH2型反應持續存在，導致肝星狀細胞異常激活轉化為肌成纖維細胞并大量增殖，產生的細胞外基質(ECM)超過了機體的降解能力，致使ECM在肝內過量沉積。在肝肉芽腫、纖維化形成過程中，THZffl2極化及其免疫調節起到非常重要的作用。現已普遍認為TH1類細胞因子可以抑制肝星狀細胞的增殖和膠原蛋白的合成。TH1類細胞因子中與抗纖維化作用相關主要有IFN-y、IL-12、IL-18。IL-18又名IFN-γ誘導因子，能強烈誘導NK細胞、T細胞產生 IFN-γ。Feng Wei等將含小鼠IL-18的質粒pVAX/IL-18與含日本血吸蟲14kDa脂肪酸結合蛋白(SjFABP)的質粒pVAX/SjFABP、含日本血吸蟲^kDa谷胱甘肽S轉移酶(SB6GST) 的質粒pVAX/Sj26GST聯合免疫小鼠。結果發現，聯合注射pVAX/IL_18組均顯著增加了 IFN- γ和IL-2產物，指示著IL-18能加強Th-I優勢性免疫反應。^iang等將IL-18基因修飾的肝細胞經脾移植入感染日本血吸蟲尾蚴的小鼠后，發現IL-2、IFN-Y的表達水平明顯升高，而IL-4、IL-10表達水平卻顯著降低，形成典型的Th1型免疫應答。感染20周后， 檢測發現羥脯氨酸等表達水平降低，肝臟I、III型前膠原、羥脯氨酸及膠原含量明顯降低，說明IL-18可誘導日本血吸蟲感染慢性期從促進肉芽腫、肝纖維化形成的Tti2型免疫應答轉化為抗纖維化的Th1型應答優勢，提示通過IL-18調控ThZft2極化的方向可減輕蟲卵肉芽腫和肝纖維化的反應強度，以達到干預治療肝纖維化的目的。目前抗纖維化治療著力于消除和抑制炎癥的發生發展，尚無有效治療能明顯改善或逆轉纖維化相關的炎癥進程。TH1細胞因子能直接抑制成纖維細胞的膠原合成，說明TH1 細胞因子是一種潛在的抗纖維化治療靶點，其中能明顯改善感染肝臟纖維化且已應用于臨床的TH1細胞因子有IFN- γ。然而傳統的細胞因子免疫治療是將利用生物工程技術生產的細胞因子注入患者體內，通過血液循環到達免疫原局部而起作用，這種治療必需連續、大劑量用藥，這勢必導致毒副作用增加及宿主體內細胞因子嚴重失衡。因此，理想的治療方法是即能有效的利用此類細胞因子進行抗肝纖維化治療，同時又能將其導致的毒副作用和其它部位正常組織的細胞因子失衡減至最低。單鏈抗體(single chain Fv antibody, scFv)作為基因工程抗體的一種，是具有完整抗原結合位點的最小功能片段，與完整抗體比較，具有更大的優越性分子量小，免疫原性低，組織穿透力強，定位迅速，清除快，易于基因工程制備和改造等，目前已有多種單鏈抗體用于腫瘤的臨床檢測，取得了較滿意的效果。而且已有多個人源性單鏈抗體獲美國FDA 的批準，但目前尚無單鏈抗體用于血吸蟲病治療的報道。本課題組利用噬菌體展示技術構建了日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原單鏈抗體庫，集落挖掘法從中篩選得到一株與天然分子候選疫苗SIEA^5-28kDa特異性結合的scFv，通過大腸桿菌表達系統誘導可溶性單鏈抗體高效表達，并將增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein, EGFP) 與特異性SIEA^-28kDa單鏈抗體進行融合表達，通過對EGFP的綠色熒光檢測顯示，特異性單鏈抗體能與未成熟蟲卵及雌蟲生殖系統特異性結合，結合部位主要在未成熟卵卵胚、 雌蟲卵黃腺、卵巢及與生殖系統鄰近的腸壁內膜，與運用親本抗體檢測結果相似。Western blotting檢測也發現此scFv蛋白不僅能與SIEA，而且能與成熟蟲卵可溶性抗原(SEA)和成蟲抗原(AWA)特異性結合，說明此scFv對日本血吸蟲從雌成蟲到未成熟蟲卵、成熟蟲卵各個階段都具有高特異性靶向免疫識別能力。隨后，我們利用高度純化的scFv為探針篩選日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫，獲得兩個編碼SIEA^-28kDa疫苗候選分子的基因，通過構建真核重組質粒免疫小鼠，獲得了較好的抗日本血吸蟲感染的免疫保護效果。證實了此抗 SIEA26-28kDa的scFv具有潛在應用價值。細胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技術是當今疾病免疫研究的一個熱點方向。該方法是利用基因工程技術將兩種或多種具有相同或相關功能活性但各自作用靶點不同的細胞因子融合在一起，使融合基因表達的產物既具有各因子獨特的生物學活性或使其某些活性顯著提高，又可能通過協同效應發揮出較單一細胞因子簡單配伍所不具備的復合生物學功能。在此基礎上，將抗體分子的片段與細胞因子融合，表達的融合蛋白不但可以保留抗體分子片段與抗原特異性結合的特性，還具有細胞因子的多功能免疫學活性， 從而可借助抗體將細胞因子導向到特定的靶部位發揮高效生物學功能，同時減輕全身毒副作用。Heuser等構建了抗黏蛋白的scFv-Fc-IL-2融合蛋白(C595scFv-Fc-IL_2)，證實此融合蛋白能同時特異性地結合MUCI+的腫瘤細胞和CD25+的免疫效應細胞。Halin等采用抗纖連蛋白(fibronectin，FN)的scFv L-19與IL-12融合，發現應用該融合蛋白治療比應用等量的IL-12具有更強的抗轉移效應。Helguera等將鼠GM-CSF與HER2抗體融合，觀察到該融合蛋白既保持了與人HER2/neU抗原的特異性結合能力，同時也保持了與重組鼠 GM-CSF相似的生物學活性，在小鼠體內能夠明顯抑制表達HER2/neU的腫瘤細胞生長，能同時增強Th1和Ttl2型細胞的免疫應答。
發明內容
本發明的目的是提供一種對日本血吸蟲病肝纖維化具有有效治療作用的DNA疫苗及其應用方法。一種對日本血吸蟲病肝纖維化具有治療作用的DNA疫苗，以具有免疫靶向和抗血吸蟲卵胚作用的單鏈抗體scFv與細胞因子IL-18DNA融合，轉入真核表達載體構成，所述的具有免疫靶向和抗血吸蟲卵胚作用的單鏈抗體的核苷酸序列為SEQ ID NO :1。所述的DNA疫苗制備如下以具有免疫靶向和抗血吸蟲卵胚作用的單鏈抗體scFv和細胞因子 IL-18DNA為模板，同時根據兩個模板和兩個模板之間45bp的鏈接片段glycine-rich linker[(GlyJer)3]設計特異性引物(含5’或3’酶切位點)，經PCR擴增分別得到scFv+1 inker和lingker+IL_18DNA，隨后經重疊PCR擴增得到scFv和IL-18融合 DNA:scFv-IL18 ；將其轉入真核表達載體pVAXl即得。擴增scFv+1 inker的引物序列為SEQ ID NO 2 Pl :5，-CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3’SEQ ID NO 3 P2
5 ‘ - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC
CCGTTTGATTTCCA-3‘；擴增lingker+IL-18的引物序列為SEQ ID NO 4 P3
5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCG
ATGGCTGCTGAACCAGTAG-3‘SEQ ID NO 5 P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3‘。所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18融合DNA: scFv_IL18的核苷酸序列為SEQ ID NO :6。所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18融合DNA: scFv_IL18的氨基酸序列為SEQ ID NO :7。所述的DNA疫苗可用于制備治療日本血吸蟲病肝纖維化藥物。傳統的細胞因子免疫治療需要連續、大劑量的注射，對人體正常器官損傷較大。因此本發明旨在利用scFv對日本血吸蟲從雌成蟲到未成熟蟲卵、成熟蟲卵各個階段均具有高特異性靶向免疫識別能力的特性，同時具有抗生殖產卵和卵胚發育的效果，將該單鏈抗體與對血吸蟲性肝纖維化具有免疫調理作用的細胞因子IL-18融合表達，產生scFv-IL18融合蛋白，借助scFv的靶向和免疫作用，通過IL-18對蟲卵肉芽腫和肝纖維化形成的干擾， 誘導日本血吸蟲感染慢性期從Tti2型免疫應答轉化為Th1型優勢的免疫應答，在病灶局部調控ThZft2極化的方向以減輕蟲卵肉芽腫和肝纖維化的反應強度，同時還能大大降低IL-18 對其它正常組織器官的毒副作用，達到增強scFv-IL18治療日本血吸蟲病肝纖維化的效果。
圖1是本發明全套scFv、IL-18基因的PCR擴增圖；圖2是本發明全套scFv_IL18基因的S0E-PCR擴增圖；圖3是本發明構建的真核質粒pVAXl/SjscFv-ILlS雙酶切鑒定圖；圖4是本發明在正常小鼠體內表達后產生的IL-18圖；圖5是本發明對日本血吸蟲性肝纖維化BALB/c鼠體內Thl/Th2型細胞因子表達的影響；圖6是本發明對日本血吸蟲性肝纖維化BALB/c鼠肝肉芽腫大小和膠原纖維含量的影響。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明日本血吸蟲病肝纖維化治療性DNA疫苗pVAXl/Sj scFv-IL18進行詳細說明，而不會構成對本發明的限制。實施例11、scFv+1 inker 禾口 1 ingker+IL—18 的擴增根據具有免疫靶向和抗血吸蟲卵胚作用的單鏈抗體scFv(其氨基酸序列見 SEQ ID NO :8)、IL-18基因序列和鏈接片段(Gly4Ser)3]序列設計特異性引物，用引物Pl 和 P2 擴增 scFv+1 inker [即(Gly4Ser)3],反應條件為-MV 預變性 5min ； 94 °C 50sec, 58°C 30sec,72°C Imin ；共30個循環。最后72°C延伸5min。引物P3和P4擴增linker [即 (GlyJer) J+IL-18，反應條件為94°C預變性 5min ；94°C 50sec,76°C 30sec,72°C Imin ；共 30個循環。最后72°C延伸5min。產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。引物序列如下(下劃線代表酶切位點，粗體部分為加入的連接片段序列)Pl :5，-CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3’ (EcoR I)P2
5 ‘ - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC
CCGTTTGATTTCCA-3‘P3
5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCG
ATGGCTGCTGAACCAGTAG-3‘P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3‘ (XhoI)2、SOE-PCR 擴增 scFv_IL18 融合 DNA上述scFv+1 inker和lingker+IL-18片段經瓊脂糖凝膠電泳后使用PCR產物純化試劑盒純化后，純化產物(各50ng)按1 1混合，行SOE-PCR進行連接，反應條件如下94°C延伸 5min，94°C 50sec,60°C lmin,72°C Imin 30sec，共 10 個循環，72°C延伸 8min。得到scFv-IL18融合DNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。3、真核質粒 pVAXl/Sj scFv_IL18 的構建從過夜培養的LB (含Kana終濃度50mg/L)平板上挑取單個含有pVAXl質粒的大腸桿菌菌落(PVAXl質粒購于hvitrogen公司)，接種于5ml LB/Kana液體培養基，37°C振搖培養過夜，按Takara公司質粒小量提取試劑盒說明書進行質粒的小量提取純化。將scFv_IL18和pVAXl質粒分別進行EcoR I和Xho I雙酶切，酶切體系如下表所示，37°C酶切4h后，在紫外燈下切下酶切片段，用Takara的瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶
切產物。
權利要求
1.一種對日本血吸蟲病肝纖維化具有治療作用的DNA疫苗，其特征在于，以具有免疫靶向和抗血吸蟲卵胚作用的單鏈抗體scFv與細胞因子IL-18DNA融合，轉入真核表達載體構成，所述的具有免疫靶向和抗血吸蟲卵胚作用的單鏈抗體的核苷酸序列為SEQ ID NO=I0
2.根據權利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗制備如下以具有免疫靶向和抗血吸蟲卵胚作用的單鏈抗體scFv和細胞因子IL-18DNA為模板，同時根據兩個模板和兩個模板之間45bp的鏈接片段glycine-rich linker [ (Gly4Ser) 3]設計特異性引物，經PCR擴增分別得到scFv+1 inker和lingker+IL_18DNA，隨后經重疊PCR擴增得到scFv 和IL-18融合DNA:scFv-IL18 ；將其轉入真核表達載體pVAXl即得。
3.根據權利要求2所述的DNA疫苗，其特征在于 擴增scFv+1 inker的引物序列為SEQ ID NO 2 Pl 5' -CGGAATTCAGCATGGCCCAGGTGCAGC-3‘ SEQ ID NO 3 P2 5' - CGAACCTCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCCGTTTGATTTCCA-3‘；擴增lingker+IL-18的引物序列為 SEQ ID NO 4 P3 5 ‘ - GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGTTCGATGGCTGCFGAACCAGTAG-3 SEQ ID NO 5 P4 5' -CCGCTCGAGTTAATAGCTAGTCTTCGCTTTG-3'。
4.根據權利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18 融合DNA:scFv-IL18的核苷酸序列為SEQ ID NO :6。
5.根據權利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗中的scFv和IL-18 融合DNA:scFv-IL18的氨基酸序列為SEQ ID NO :7。
6.權利要求1-5任意一項所述的DNA疫苗的應用方法，其特征在于，用于制備治療日本血吸蟲病肝纖維化藥物。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體為一種對日本血吸蟲病肝纖維化具有治療作用的DNA疫苗及其應用。利用自行研制的具有免疫靶向和抗血吸蟲卵胚作用的單鏈抗體scFv，將其與細胞因子IL-18融合，利用特異性單鏈抗體的免疫靶向作用和抗血吸蟲卵卵胚的作用，結合IL-18的免疫調理，增強了對血吸蟲病肝纖維化的治療效果。
文檔編號A61K48/00GK102526761SQ20121001131
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者何卓, 馮其梅, 周云飛, 尹鐵球, 張樹菊, 汪世平, 田智 申請人:中南大學