專利名稱：沙蠶蛋白酶在制備治療白血病藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明為沙蠶蛋白酶在制備治療白血病藥物中的用途，涉及沙蠶蛋白酶作為注射劑在抗血液系統腫瘤白血病中的應用，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
白血病Leukemia是由于造血系統中某一系列細胞的異常腫瘤性增生，并在骨髓、 肝、脾、淋巴結等臟器廣泛浸潤，外周血中白細胞有質和量的異常，白血病是骨髓惡性克隆性疾病。患者紅細胞和血小板數量減少，從而導致貧血、出血、感染、浸潤等臨床表現。白血病死亡率高、危害大。白血病的治療方法有化學藥物療法、骨髓移植和一般支持療法。白血病并沒有特異有效的化療藥物，和一般抗腫瘤藥物一樣，可分為影響核酸生物合成的藥物，如巰基嘌呤、阿糖胞苷、環胞苷、羥基脲；影響DNA結構和功能的藥物，如環磷酰胺、馬利蘭；破壞DNA 的抗生素，如絲裂霉素、博來霉素；干擾轉錄和阻止RNA合成的藥物，放線菌素D、阿霉素、柔紅霉素；抑制蛋白質生物合成藥物，如抑制微管蛋白合成的長春堿類，紫杉醇類；干擾核蛋白體功能藥物，三尖杉生物堿類；影響氨基酸供應的藥物，如L-門冬酰胺酶；引起細胞凋亡或誘導分化的藥物，如砷制劑、全反維甲酸，治療急性粒細胞白血病有較好的療效。上述這些抗腫瘤抗白血病藥物，大都是小分子物質，可以進入全身各個器官組織細胞，不僅抑制或殺死腫瘤細胞同時也嚴重影響了正常組織代謝、細胞活動，尤其是代謝旺盛的組織，如骨髓、毛囊、消化道。這些藥物共性的毒副作用分為近期毒性和遠期毒性作用。 近期毒性，包括骨髓抑制造成白細胞、血小板、紅細胞大量降低，消化道反應嚴重惡心嘔吐、口腔食道炎癥潰瘍，脫發，肝臟、心臟、腎臟膀胱等器官損害以及神經毒性等。遠期毒性， 包括第二原發性腫瘤，不育畸形等。因此，抗白血病治療藥物特別需要有一種能對白血病腫瘤細胞有較強的殺傷作用，而對正常白細胞、紅細胞不影響或影響較輕、在血液循環系統起作用、而不滲透到并影響其他臟器的藥物。沙蠶蛋白酶是提取自沙蠶的一類蛋白酶，包括N-V蛋白酶(Swiss prot數據庫中登錄號 Accession Number P83433)、P86330 蛋白酶(UniProt Knowledgebase 數據庫中登錄號Accession Number)和雙齒圍沙蠶纖溶酶。
發明內容
本發明公開了沙蠶蛋白酶在制備治療白血病藥物中的用途，公開了沙蠶蛋白酶的新用途。本發明涉及的沙蠶蛋白酶是等電點pi為酸性的絲氨酸蛋白酶，包括日本刺沙蠶纖溶酶(UniProt Knowledgebase 數據庫登錄號 Accession Number P86330)、N-V 蛋白酶 (Swiss prot數據庫登錄號Accession Number P83433)和雙齒圍沙蠶纖溶酶。本發明沙蠶蛋白酶抗白血病的應用，包括用沙蠶蛋白酶或含有沙蠶蛋白酶組分的復方制劑治療白血病。
采用沙蠶蛋白酶的注射劑，在體外抗白血病細胞實驗中有顯著的殺傷白血病腫瘤細胞的作用，臨床采用注射劑靜脈給藥，治療各種白血病。通過對以下腫瘤株進行實驗慢性粒細胞白血病細胞株K562、急性粒細胞白血病細胞株NB4、急性T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat，研究表明沙蠶蛋白酶抗白血病細胞藥效作用非常顯著。實驗例1、日本刺沙蠶纖溶酶對NB4白血病細胞的殺傷作用 1、實驗方法
1.1細胞培養
將人急性粒細胞白血病細胞株NB4細胞加在RPMI1640培養液中，懸浮生長，RPMI1640 培養液成分含10%胎牛血清、0.洲羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPEQ、0. 2% NaHCO3、青霉素 (100 U. πιΓ1)及鏈霉素(lOOyg.mr1 ) ；37°C 5% C02孵箱中培養傳代，兩天傳代一次，每次傳代均以1500轉離心5分鐘，收集細胞，更換新鮮培養液。1.2.臺盼藍計數
細胞以70000個/ml接種于培養瓶中，分為給日本刺沙蠶纖溶酶1、2、4、8、16 μ g/ml組及對照組。加藥后分別在對、48、7池取各組細胞，臺盼藍染色后，在光鏡下記活細胞數，整個實驗重復三次，取平均值。并以時間為橫坐標，平均活細胞數為縱坐標繪制生長曲線； 1. 3.噻唑藍(MTT)比色法測定細胞的增殖抑制率
實驗分組，空白對照組(不含細胞的完全培養基)，陰性對照組(未經藥物處理的NB4 細胞)，日本刺沙蠶纖溶酶實驗組(設5個濃度梯度分別為l、2、4、8、16/yg/ml)，每個濃度設6個復孔。取對數生長期細胞，用培養液調整濃度為70000個/ml，接種于96孔板上， 每孔ΙΟΟμΙ。空白對照組加入ΙΟΟμΙ的培養基。接種細胞過程中要不停吹打，以保證每孔接種細胞數均勻恒定。實驗組分別加藥50 μ 1，使每孔終濃度符合設定值。陰性對照組加入空白培養基50μ1。分別于37 °C、5% C02條件下培養3、6、12、24、48、72h后，每孔加入MTT20 μ 1，繼續培養，4 h后終止培養，96孔培養板2500 rpm離心5min，吸棄上清，收集細胞。每孔加入二甲基亞砜(DMS0 ) ΙΟΟμΙ。震蕩混勻后，用全自動酶標儀570nm波長測定各孔的吸光度(OD)值。按下式計算細胞的增值抑制率增值抑制率(％ )=(對照組OD 值一實驗組OD值)/對照組OD值X 100%。1. 4.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞存活與死亡狀態。取對數生長期細胞，分四組(對照組，給藥4、8、16μ g/ml組)接種于培養瓶中，。培養箱中培養對、48小時。離心收集細胞，用PBS洗滌細胞二次，細胞計數，收集適量細胞加入 500 μ 1 的 Binding Buffer 懸浮細胞，加入 5 μ 1 Annexin V-FITC 和 1 μ 1 Propidium Iodide,混勻后室溫避光反應15min。將反應好的細胞滴于載玻片上，并用蓋玻片蓋上，細胞在共聚焦顯微鏡下進行熒光分析，Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色， 兩者疊加呈黃色，應用Image-Pro Plus 6. 0熒光分析軟件進行計數分析。Armexin V-FITC 結合的細胞為早期凋亡細胞，而PI結合的是中晚期凋亡死亡細胞。1.5細胞形態學檢測——HE染色
收集細胞，離心，涂片。涂片自然干燥后，甲醇固定細胞IOmin后，細胞經過蘇木精染色，水洗，鹽酸酒精分色，水洗，伊紅染色，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明處理后于空氣中晾干。中性樹膠封片后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。
1.6細胞凋亡的檢測——流式細胞術
取對數生長期細胞，分四組接種于培養瓶中，為對照組，給藥4、8、16yg /ml組。培養箱中培養Μ、4 ι。離心收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞二次，細胞計數，收集1 X IO6 個細胞加入100μ 1的Binding Buffer，懸浮細胞，加入5 μ 1 Annexin V-FITC和1 μ 1 Propidium Iodide，混勻后室溫、避光、反應15min。反應結束后，追加400 μ 1的Binding Buffer，一小時內用流式分析儀進行凋亡的檢測。采用CELLQest軟件進行細胞周期分析。 記錄Armexin V +/PI-細胞所占比例以確定凋亡率。并比較各組凋亡率的差異。1.7統計學方法
每組實驗至少重復3次。實驗數據分析后用抑制率表示。實驗組、陽性對照組和陰性對照組之間的多重比較用方差分析。實驗結果
2. 1臺盼藍計數細胞死亡數量增長
當日本刺沙蠶纖溶酶濃度大于1 μ g/ml時，隨著藥物濃度的增加，NB4細胞生長曲線越平緩，細胞增殖越少，日本刺沙蠶纖溶酶濃度大于2 μ g/ml時，NB4細胞出現生長抑制作用，隨著日本刺沙蠶纖溶酶濃度的增加，NB4細胞的生長抑制作用增強；當給藥劑量大于 4μ g/ml，給藥時間48小時，8 μ g/ml 24小時以上時，細胞負增長，細胞增殖降低、死亡細胞增多。leyg/mL 4 的劑量組細胞已破碎。參見
圖1。檢測日本刺沙蠶纖溶酶對NB4細胞產生增殖抑制作用
表NV蛋白酶對々急性早幼粒細胞白血病NB4細胞抑制率 IR (%)_
繪藥時_
組別 .................................................................................................................................,..............................................................................................................................................................................................
3小時 β小時 12小時 24小If 48小時
對Mti Opg/mLQOOO OQ 0.00 .00
B WmL OOQ~0,000 00L 072.88*
25T. ..2:82:... ..3:92:539**2144"
沙-Ii^mL14J9"19.ββ__23.50·33.19"44—03_
餐 Βμ-gmL2S.62·32 49"4015"55 40"
^ 16pg/mL37.62"36 ？JT49.48**53.10"62.72"
_ 32 隨/mL42 J3"—420/*—[—51:84:—67Jl"金裂解
*P < 0. 05 ；**P < 0. 01
結果見表1，當日本刺沙蠶纖溶酶劑量為1 μ g/ml時，作用24h后對NB4細胞產生增殖抑制作用，劑量為2 μ g/ml時，3h產生抑制作用，4 μ g/ml及以上劑量時，則在3小時后就產生非常顯著的增殖抑制作用，與對照組相比差異顯著。隨著給藥時間的延長，細胞抑制率逐漸增高，差異顯著。日本刺沙蠶纖溶酶對NB4細胞的增殖抑制作用呈時間和劑量依賴性。參見圖2。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察
經過軟件分析后結果如圖3所示，其中，Armexin V-FITC熒光信號呈綠色，發出綠色熒
5光的細胞表示為早期凋亡細胞；PI熒光信號呈紅色，發出紅色熒光的細胞為中晚期凋亡和死亡細胞；兩者疊加呈黃色，為雙陽性細胞。8 μ g/mLU6 μ g/mL日本刺沙蠶纖溶酶作用Mh，使NB4細胞發生明顯的早期凋亡、 中晚期凋亡和死亡。參見圖3、圖4。圖3 —1，照組Mh，圖3 — 2，8μβ/πιΙ^41ι，細胞總數減少，早期和晚期凋亡細胞比例增加，大部分細胞死亡。細胞凋亡的檢測——流式細胞術
應用流式細胞儀進行細胞凋亡分析，結果表明ΝΒ4細胞對照組4 培養后凋亡率為 8. 3%。4、8、16 μ g /ml組細胞凋亡率分別為11. 3%, ,17. 3%、和30. 4%。統計學處理顯示組間 P值均< 0. 05，具有顯著性差異。參見圖5 - 1為空白對照組，圖5 — 2為16μ g/ml 24h 組，大部分細胞處于早期和中晚期凋亡。細胞形態學觀察——HE染色
圖6為日本刺沙蠶纖溶酶作用于NB4細胞后的光學顯微鏡下形態的變化照片；圖 6-1 正常 NB4 細胞 HE 染色圖片；圖 6-2 16 μ g/ml 24h 后；圖 6-3 16 μ g/ml 48h;圖 6-4: 16 μ g/ml 72h。與正常細胞圖6-1比較，給藥組細胞明顯腫脹，部分細胞膜破碎，細胞壞死溶解，部分細胞核固縮，這些改變隨著給藥時間的延長改變更明顯，在給藥7 后培養液中有大量細胞碎片，幾乎無完整細胞。實驗例2日本刺沙蠶纖溶酶對K562白血病細胞的殺傷作用 1、實驗方法
1. 1 MTT比色法實驗測定細胞的增殖抑制率
取對數生長期生長的K562細胞(慢性髓性粒細胞白血病細胞株)，離心后計數，以 5X IO4個/ ml接種于96孔板，每孔150μ1，使用日本刺沙蠶纖溶酶終濃度分別為1、2、4、8、 16,32μδ / ml，并設有不加藥的陰性對照組，每個濃度分設4個復孔。分別培養12、24、36、 48、72h后，每孔加入5mg/ml MTT 20μ 1,37°C，5%C02飽和濕度繼續孵育4h至6h，然后以 2500r/min離心10分鐘，棄上清，加入100 μ 1 DMS0，充分振蕩溶解甲瓚顆粒后，用酶標儀 (波長570nm)測定各孔OD值，計算出細胞生長抑制率，實驗重復3次。臺盼藍檢測實驗
取對數生長期的細胞，按5X IO4個/ ml接種于培養瓶中，每瓶5ml，使用日本刺沙蠶纖溶酶的終濃度分別l、2、4、8、16、32Pg / ml，陰性對照組給予等體積的空白血清，每組設五個平行對照，置37°C、5%的CO2培養箱中培養，于接種后12、24、36、48、7池分別取每組細胞， 加入0.2%臺盼藍進行活細胞計數，實驗重復三次，計算平均值繪制生長曲線。培養的細胞形態學觀察
取對數生長期的K562細胞，調整細胞濃度為5X IO4個/ ml，接種于6孔板中，分陰性對照組和實驗組，實驗組加入的終濃度分別為8、32Pg / ml的日本刺沙蠶纖溶酶，分別培養 24h,48h后，置于倒置顯微鏡下觀察活細胞形態。瑞氏-吉姆薩染色
取對數生長期的K562細胞，按5X IO4個/ ml接種于培養瓶中，每瓶5ml，分為陰性對照組和日本刺沙蠶纖溶酶的終濃度為8、32Pg / ml組，于24h、4 i收集細胞，PBS洗滌三次后，重懸于少量的PBS中，取10μ1細胞懸液涂布于載玻片上，晾干，用9:1比例的瑞氏-吉姆薩染液涂片，Imin后加入同體積的PBS覆蓋染液，用吹耳球吹勻，室溫下染色lOmin，染片完畢，流水沖洗，待干后，置于普通光學顯微鏡下觀察細胞形態并拍片。流式細胞儀及共聚焦顯微鏡檢測細胞凋亡
將日本刺沙蠶纖溶酶終濃度為8、32Pg / ml組的K562細胞作用24h后，調整濃度至 0. 5X106/mL lX106/mL ；取ImL細胞，1000轉/分，4°C離心10分鐘，棄上清液；加入ImL 冷的PBS輕輕振蕩使細胞懸浮，1000轉/分，4°C離心10分鐘，棄上清液；再用PBS洗一遍； 將細胞重新懸浮于200ul結合緩沖液，加入IOul FITC標記的Armexin-V (20 μ g/mL)，室溫避光15min 30min后；再加入PI (50 μ g/mL) 5ul，避光反應5min后，加入300ul結合緩沖液，立即用流式細胞儀進行定量檢測。另一部分加入Armexin V/FITC和PI后，室溫放置15 30min后，細胞涂片，共聚焦顯微鏡下觀察細胞凋亡死亡情況，計數凋亡細胞數及總細胞數，計算凋亡百分比。流式細胞儀檢測細胞周期
分別收集Mh、48h的對照組和用藥組的細胞，PBS洗三遍后，終濃度70%的冷乙醇固定細胞，4°C保存，上機前PBS洗三遍次后，加入適量PBS液與PI染液混勻，4°C，30min, 400 目網過濾，調整細胞數為IO6個細胞，上機分析細胞周期的變化。統計學處理
使用統計軟件SPSS12.0進行數據分析，所有數據以抑制率表示，組間均數比較用t 檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。日本刺沙蠶纖溶酶半數抑制濃度采用IC50軟件計
笪弁。、結果2.1細胞死亡數量增長
臺盼藍實驗結果顯示以上各濃度的日本刺沙蠶纖溶酶作用于K562細胞Mh、48h、72h 后各組的活細胞數量，逐漸減少并呈明顯的時效，量效依賴關系。各實驗組與對照組相比， 差別有統計學意義(P<0 · 01)，圖7為不同劑量日本刺沙蠶纖溶酶作用后K562細胞的生長曲線。日本刺沙蠶纖溶酶對K562細胞產生顯著的增殖抑制作用
MTT結果顯示，以不同終濃度(l、2、4、8、16、32Pg / ml)的日本刺沙蠶纖溶酶作用于 K562細胞12、24、36、4 ι后，對K562細胞的生長具有增殖的抑制作用，隨著日本刺沙蠶纖溶酶濃度的增加，作用時間的延長，細胞抑制率明顯增加(表1)，即表現為劑量依賴性和時間依賴性。表1日本刺沙蠶纖溶酶對K562細胞增殖抑制作用的影響MTT (抑制率，n=4)
權利要求
1.沙蠶蛋白酶在制備治療白血病藥物中的用途。
2.權利要求1涉及的沙蠶蛋白酶是等電點為酸性的絲氨酸蛋白酶，包括日本刺沙蠶纖溶酶(UniProt Knowledgebase 數據庫登錄號 Accession Number P86330)、N-V 蛋白酶 (Swiss prot數據庫登錄號Accession Number P83433)和雙齒圍沙蠶纖溶酶。
3.權利要求1所述白血病是指各種急性、慢性的髓系和淋巴系白血病等各種白血病。
4.權利要求1所述的沙蠶蛋白酶或含沙蠶蛋白酶組分的復方制劑、或沙蠶蛋白酶修飾物在制備治療白血病藥物中的用途。
5.權利要求1所述的藥物制劑包括將沙蠶蛋白酶加入一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑混合制成注射劑。
全文摘要
本發明公開一種沙蠶蛋白酶在制備白血病藥物中的用途。所用的沙蠶蛋白酶是經過提取純化的單一的沙蠶蛋白酶或其修飾物；也可以是含沙蠶蛋白酶或它們修飾物的制劑。能夠抑制多種白血病腫瘤細胞，對正常人白細胞作用不顯著、對正常紅細胞無溶血作用無凝聚作用、療效顯著、無明顯毒副作用。
文檔編號A61K38/48GK102526715SQ20121002963
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者付貴蓮, 劉劍, 崔佳樂, 李奇, 洪敏 , 洪新雨, 白若倫, 葛鑫, 薄其青 申請人:洪敏