專利名稱：人樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種人樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法和應用。
背景技術：
樹突狀細胞(Dendritic cells，簡稱DC)大約占血液中整個細胞群體的O. 3%，是一種專職抗原遞呈細胞，它能夠激發和調控機體的免疫應答。樹突狀細胞的以下幾個特點使得它能夠有效的遞呈抗原激發機體的免疫應答(1)能夠通過吞噬作用、胞飲作用和受體介導的內吞作用而高效的捕捉抗原(如凋亡和壞死的細胞微生物及可溶性的外源蛋白等)；(2)具有強的運動性，能夠將捕捉到的抗原從外周組織轉運到初級和次級淋巴器官；能夠高水平表達MHC-I、MHC- II分子，與細胞內加工形成的抗原決定簇形成復合體并表達于樹突狀細胞表面為激活抗原特異的淋巴細胞提供必需的第一信號；(4)能夠高水平表達共刺激分子及粘附分子，為激活抗原特異的T淋巴細胞提供必需的第二信號；(5)能夠合成重要的細胞因子(如IL-12和IFN-Y等)，激活多種免疫相關細胞。所以樹突狀細胞是最有效的抗原遞呈細胞，其抗原遞呈能力遠遠強于其他的抗原遞呈細胞(如B細胞和巨噬細胞)。腫瘤免疫治療是放療、化療和手術治療之外的另一種治療腫瘤的方法，雖然目前這種方法還只處于I期和II期臨床研究階段，但它已被公認為是最具前景的腫瘤治療方法。腫瘤免疫治療的關鍵是通過激活機體的免疫系統來清除腫瘤細胞，其中關鍵的是產生腫瘤特異的細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)。廣泛的研究表明有效的抗腫瘤CTLs應答需要專職抗原遞呈細胞——樹突狀細胞來激活T淋巴細胞。樹突狀細胞在激活抗原特異T淋巴細胞及維持T淋巴細胞活性上具有重要作用。目前樹突狀細胞腫瘤疫苗正在被迅速、廣泛的研究，并且已在動物實驗和早期的臨床實驗中取得了很有意義的結果。這些研究結果表明 樹突狀細胞腫瘤疫苗不僅能夠誘發針對原發腫瘤的免疫應答，而且也能夠誘發針對轉移腫瘤的免疫應答。
發明內容
本發明的目的之一是解決上述問題，提供一種人樹突狀細胞腫瘤疫苗。本發明的目的之二是提供上述人樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法。本發明的目的之三是提供上述人樹突狀細胞腫瘤疫苗的應用。實現本發明目的之一的技術方案是一種人樹突狀細胞腫瘤疫苗，它是由葡聚糖誘導獲得。實現本發明目的之二的技術方案是一種人樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，具有以下步驟①獲得CD14+外周血單核細胞和腫瘤抗原用含有GM-CSF和IL-4的培養基培養步驟①獲得的CD14+外周血單核細胞IOOh 140h，獲得未成熟人樹突狀細胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培養基中GM-CSF的濃度為80ng/mL 120ng/mL，IL-4的濃度為
330ng/mL 70ng/mL ;③用β -葡聚糖誘導步驟①獲得的腫瘤抗原負載到步驟②獲得的未成熟人樹突狀細胞內，獲得人樹突狀細胞腫瘤疫苗；所述β -葡聚糖的濃度為80 μ g/mL 120 μ g/mL。上述步驟①中所述的CD14+外周血單核細胞是由血細胞分離機從人外周血中先分離獲得外周血單個核細胞，再通過磁珠分選系統從外周血單個核細胞中分選獲得。上述步驟①中所述的腫瘤抗原是通過生物法和/或物理法誘導腫瘤細胞凋亡而獲得。即可以單獨通過生物法誘導腫瘤細胞凋亡，也可以單獨通過物理法誘導腫瘤細胞凋亡，還可以先通過生物法再通過物理法誘導腫瘤細胞凋亡。所述的生物法是采用抗腫瘤化療藥物處理腫瘤細胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射線照射腫瘤細胞使之凋亡，或者采用紫外線照射腫瘤細胞使之凋亡，或者對腫瘤細胞進行反復凍融使之凋亡。上述腫瘤為各種惡性實體瘤，包括肝癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌
坐寸O實現本發明目的之三的技術方案是上述人樹突狀細胞腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明具有的積極效果是本發明采用β -葡聚糖誘導腫瘤抗原負載到未成熟的人樹突狀細胞內，從而得到人樹突狀細胞腫瘤疫苗，該疫苗能夠提高人樹突狀細胞的免疫效能，促進T細胞的增殖能力，特別能夠體外刺激T細胞具有特異性腫瘤殺傷能力，從而用于治療各種惡性實體瘤。
圖I為β -葡聚糖的結構式。圖2為未成熟人樹突狀細胞吞噬β -葡聚糖的示意圖。圖3為β -葡聚糖影響共刺激分子表達的示意圖。圖4為β -葡聚糖影響細胞因子濃度的示意圖。圖5為T細胞的特異性腫瘤殺傷能力的檢測示意圖。
具體實施例方式(實施例I)
本實施例的人樹突狀細胞腫瘤疫苗由以下方法獲得
①使用費森尤斯血細胞分離機以及與其配套的一次性消耗管路，選擇雙針單個核細胞程序，輸入被采集人相應的參數(性別、身高、體重、血細胞比容等)，根據被采集人具體情況調整血液流速為50mL/min 80mL/min，抗凝劑和全血比例為I : 10，將單個核細胞從人外周血中分離出來，處理全血量不超過自身血量的2倍，獲得外周血單個核細胞。將獲得的外周血單個核細胞先置于15mL的離心管中,取10 μ L細胞進行計數,然后加入抗人⑶14+免疫磁珠抗體，在108cellS/100l·! L，4°C避光培養15min，接著用2mL的PBS (磷酸鹽緩沖液) 洗滌細胞5min，去除上清液，再加入O. 5mL的PBS，最后用自動磁珠分選系統陽性分選獲得 ⑶14+外周血單核細胞。將腫瘤細胞(本實施例的腫瘤來源于胃癌)接種于無血清培養基(市售，下同)中， 加入抗腫瘤化療藥物5-氟尿嘧啶繼續培養36h后，收集凋亡的腫瘤細胞，然后用PBS洗滌3次，接著將凋亡的腫瘤細胞收集并懸浮于無血清培養基中，在37°C和液氮之間反復凍融5 次，獲得腫瘤抗原。②將步驟①獲得的CD14+外周血單核細胞洗滌后用無血清培養基制備ImL的細胞懸液，細胞計數，調整細胞密度至3 X IOVmL,加入6孔培養板中，貼壁此后，收集懸浮細胞，-80°C保存備用。向上述6孔培養板中加入含GM-CSF和IL_4的無血清培養基(GM-CSF濃度為 100ng/mL, IL-4濃度為50ng/mL)，在37°C、5%的CO2的條件下培養CD14+外周血單核細胞， 在培養24h后換液(保證GM-CSF濃度為100ng/mL，IL-4濃度為50ng/mL，下同)一次，在培養72h后再換液一次，培養IOOh 140h獲得的細胞即為未成熟人樹突狀細胞。③將步驟②培養120h獲得的未成熟人樹突狀細胞按照I : 3的細胞數量比加入到步驟①獲得的腫瘤抗原中，同時加入β_葡聚糖(β_葡聚糖的濃度為100yg/mL)，誘導 48h，使腫瘤抗原負載到未成熟人樹突狀細胞中，最后常規離心法洗滌，收集負載了腫瘤抗原的人樹突狀細胞并懸浮于生理鹽水中，獲得人樹突狀細胞腫瘤疫苗。(實驗例I、未成熟人樹突狀細胞能夠吞噬β-葡聚糖)
取5Χ IO5個實施例I的步驟①培養120h獲得的未成熟人樹突狀細胞與熒光素DTAF 標記的β -葡聚糖(濃度為20 μ g/mL)在37°C培養lh，馬上置于冰上，用預冷的PBS洗滌3 次，進行流式細胞檢測。實驗結果見圖2。由圖2可知未成熟人樹突狀細胞能夠吞噬β -葡聚糖。(實驗例2、β-葡聚糖對共刺激分子表達以及細胞因子濃度的影響)
本實驗例采用三組人樹突狀細胞進行⑶83、⑶86、⑶40、HLA-DR、CCR7表面標志檢測， 判定成熟度。其中第一組為離心收集的實施例I的步驟①培養120h獲得的未成熟人樹突狀細胞。第二組為由葡聚糖(濃度為100 μ g/ml)激發第一組獲得的未成熟人樹突狀細胞48h后的人樹突狀細胞。第三組為由TNF- α (濃度為20ng/mL)激發第一組獲得的未成熟人樹突狀細胞48h后的人樹突狀細胞，實驗結果見圖3。由圖3可知由β_葡聚糖激發后的第二組的共刺激分子的表達明顯上升。另外，收集上述三組人樹突狀細胞的培養上清液，檢測其細胞因子濃度，結果見圖4。由圖4可知由葡聚糖激發后的第二組的細胞因子濃度明顯上升。(實驗例3、T細胞的特異性腫瘤殺傷能力)
將實施例I獲得的人樹突狀細胞腫瘤疫苗與T細胞按照I : 10的數量比混合培養24h， 加入IL-2 (濃度為500U/mL)，收集T細胞，并與靶細胞混合，分別按照效靶比為30 I、 20 UlO 1、5 I的比例加入到培養板中，同時設置最大釋放孔、效應細胞自然釋放孔、 靶細胞自然釋放孔，在37°C、5%的CO2的條件下培養4h后，加入LDH反應液檢測。實驗結果見圖5。由圖5可知由實施例I獲得的人樹突狀細胞腫瘤疫苗體外刺激的T細胞具有特異性腫瘤殺傷能力。
權利要求
1.一種人樹突狀細胞腫瘤疫苗，其特征在于它是由β-葡聚糖誘導獲得。
2.根據權利要求I所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗，其特征在于它是由以下步驟的方法獲得①獲得CD14+外周血單核細胞和腫瘤抗原；②用含有GM-CSF和IL-4的培養基培養步驟①獲得的CD14+外周血單核細胞IOOh 140h,獲得未成熟人樹突狀細胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培養基中GM-CSF的濃度為 80ng/mL 120ng/mL, IL-4 的濃度為 30ng/mL 70ng/mL ；③用β-葡聚糖誘導步驟①獲得的腫瘤抗原負載到步驟②獲得的未成熟人樹突狀細胞內，獲得人樹突狀細胞腫瘤疫苗；所述β -葡聚糖的濃度為80 μ g/mL 120 μ g/mL。
3.根據權利要求2所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗，其特征在于步驟①中所述的CD14+ 外周血單核細胞是由血細胞分離機從人外周血中先分離獲得外周血單個核細胞，再通過磁珠分選系統從外周血單個核細胞中分選獲得。
4.根據權利要求2所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗，其特征在于步驟①中所述的腫瘤抗原是通過生物法和/或物理法誘導腫瘤細胞凋亡而獲得。
5.根據權利要求4所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗，其特征在于所述的生物法是采用抗腫瘤化療藥物處理腫瘤細胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射線照射腫瘤細胞使之凋亡，或者采用紫外線照射腫瘤細胞使之凋亡，或者對腫瘤細胞進行反復凍融使之凋亡。
6.權利要求I所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于具有以下步驟①獲得CD14+外周血單核細胞和腫瘤抗原；②用含有GM-CSF和IL-4的培養基培養步驟①獲得的CD14+外周血單核細胞IOOh 140h,獲得未成熟人樹突狀細胞；所述含有GM-CSF和IL-4的培養基中GM-CSF的濃度為 80ng/mL 120ng/mL, IL-4 的濃度為 30ng/mL 70ng/mL ；③用β-葡聚糖誘導步驟①獲得的腫瘤抗原負載到步驟②獲得的未成熟人樹突狀細胞內，獲得人樹突狀細胞腫瘤疫苗；所述β -葡聚糖的濃度為80 μ g/mL 120 μ g/mL。
7.根據權利要求6所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟①中所述的CD14+外周血單核細胞是由血細胞分離機從人外周血中先分離獲得外周血單個核細胞，再通過磁珠分選系統從外周血單個核細胞中分選獲得。
8.根據權利要求6所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于步驟①中所述的腫瘤抗原是通過生物法和/或物理法誘導腫瘤細胞凋亡而獲得。
9.根據權利要求8所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于所述的生物法是采用抗腫瘤化療藥物處理腫瘤細胞使之凋亡；所述物理法是采用同位素射線照射腫瘤細胞使之凋亡，或者采用紫外線照射腫瘤細胞使之凋亡，或者對腫瘤細胞進行反復凍融使之凋亡。
10.權利要求I或2所述的人樹突狀細胞腫瘤疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人樹突狀細胞腫瘤疫苗及其制備方法和應用。該人樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備方法是獲得CD14+外周血單核細胞和腫瘤抗原；用含有GM-CSF和IL-4的培養基培養CD14+外周血單核細胞100h～140h獲得未成熟人樹突狀細胞；用β-葡聚糖誘導腫瘤抗原負載到未成熟人樹突狀細胞內獲得人樹突狀細胞腫瘤疫苗；β-葡聚糖的濃度為80μg/mL～120μg/mL。本發明采用β-葡聚糖誘導腫瘤抗原負載到未成熟的人樹突狀細胞內，從而得到人樹突狀細胞腫瘤疫苗，該疫苗能夠提高人樹突狀細胞的免疫效能，促進T細胞的增殖能力特別能夠體外刺激T細胞具有特異性腫瘤殺傷能力，從而用于治療各種惡性實體瘤。
文檔編號A61K39/00GK102600462SQ20121008875
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月29日 優先權日2012年3月29日
發明者寧永玲, 戚春建, 王仕忠, 錢科卿 申請人:戚春建