本發明屬于腫瘤免疫領域，涉及腫瘤細胞裂解液，具體涉及一種細胞裂解液、裂解試劑盒及在制備腫瘤全細胞抗原負載的DC腫瘤疫苗中的應用。
背景技術：
免疫治療是手術、放療、化療之后的第四種腫瘤治療方式，在腫瘤的綜合治療模式中，免疫治療在提高腫瘤治愈率、改善患者生活質量、延長生存期方面起重要作用。在腫瘤免疫中，T淋巴細胞識別的腫瘤抗原不是被腫瘤細胞提呈，而是被抗原提呈細胞提呈。樹突狀細胞(DC)是人體內目前已知功能最強大、唯一能激活靜息狀態T細胞的抗原提呈細胞，具有強大的激活輔助和細胞毒T細胞的能力。樹突狀細胞腫瘤疫苗是腫瘤治療的第四模式之一，有望成為一種很有實用前景的抗腫瘤方法。腫瘤全細胞抗原負載的樹突狀細胞腫瘤疫苗是由樹突狀細胞經腫瘤細胞裂解物或完整腫瘤細胞(兩種最常用的全細胞抗原)致敏形成，致敏樹突狀細胞能表達MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子及共刺激分子，使疫苗的抗腫瘤作用明顯提高。
將樹突狀細胞與腫瘤細胞裂解物共同培養得到的致敏樹突狀細胞稱為裂解物致敏DC疫苗；將樹突狀細胞與完整腫瘤細胞進行細胞融合得到的疫苗稱為融合疫苗。相對而言，裂解物致敏DC疫苗技術難度相對較小，易于操作。腫瘤細胞裂解物的獲得方法主要有兩種：化學裂解和物理裂解。物理裂解包括反復凍溶法(又稱為熱休克法)和超聲波處理法。化學裂解包括裂解液裂解和酶裂解。四種方法比較而言，超聲波處理法最為劇烈，容易造成DNA斷裂和蛋白質變性；酶裂解用在裂解物致敏DC疫苗方面最容易破壞腫瘤細胞裂解物，降低抗原性；反復凍溶法最為溫和，裂解效率也高，但是凍溶裂解需要將腫瘤細胞于-80℃和37℃反復凍融4個循環以上，操作耗費時間，且不易商品化、標準化；裂解液裂解比超聲波處理法溫和，沒有酶裂解法對腫瘤細胞裂解物破壞性強，比凍溶裂解法快捷方便，唯一的不足就是還是會一定程度上造成腫瘤細胞裂解物中抗原成分高級構象的破壞，降低抗原性。現有技術中，為了最大限度保留腫瘤細胞裂解物中蛋白的抗原性，凍溶裂解法較為常用，如趙增仁等采用液氮反復凍融法制備人胃癌OCUM-2MD3腫瘤抗原(腫瘤抗原致敏DC誘導T淋巴細胞增殖及殺傷效率，第四軍醫大學學報)，古濤等采用-80℃和37℃反復凍融4個循環再離心取上清的方法制備小鼠骨髓瘤SP2/0細胞裂解物(腫瘤細胞凍融裂解物上清對凋亡細胞負載的樹突狀細胞生物學特性的作用研究，中國病理生理雜志)。
因此，如果能開發一種對腫瘤細胞裂解效率高且能最大限度保持裂解物抗原性的裂解液，裂解液裂解法必將取代凍溶裂解法而一枝獨秀！
細胞裂解液的主要目的包括如下兩個方面：(1)破壞脂質雙分子層，使細胞破裂；(2)抑制蛋白酶活性，防止蛋白被蛋白酶水解。因此，現有技術中，各大實驗室自行配制的細胞裂解液或市售的細胞裂解液試劑盒主要包含以下成分：多種細胞裂解成分和蛋白酶抑制成分。當然還有其他一些成分。裂解液中常添加的化學成分有：Tris-HCl pH 7.4(緩沖體系)、NaCl(等滲體系)、EDTA(變性劑和穩定劑)、Sodium deoxycholate(中度變性劑和蛋白溶解劑)、SDS(強變性劑和蛋白溶解劑)、PMSF(強大的蛋白酶抑制劑)、Aprotinin(蛋白酶抑制劑)、Leupeptin(蛋白酶抑制劑)、脫氧膽酸鈉(強去污劑，破壞細胞膜)、Triton X-100(非離子型表面活性劑，破壞細胞膜)、CHAPS(離子型表面活性劑，破壞細胞膜)。添加蛋白溶解劑的一般主要目的是為了獲得裂解液中的核酸，而不太在乎抗原等蛋白質成分。
細胞裂解液的成分及濃度對實驗效果的影響不容小覷。劉友平等(不同細胞裂解液對肝細胞蛋白提取影響的研究，山西醫藥雜志2005年1月第34卷第1期)配制不同組成和不同濃度的細胞裂解液,分別對相同條件下培養的肝細胞進行裂解并進行蛋白定量及十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)佐證，結果發現不同組成及不同濃度的細胞裂解液對肝細胞裂解作用存在顯著差異，兩性去污劑CHAPS配制4％濃度時能有效溶解膜蛋白，而肝細胞膜蛋白本身就很豐富，同時，胞質中的蛋白質也可以徹底釋放出來，因此提取的蛋白量較多。王麗等(不同細胞裂解液提取總蛋白在免疫印跡中的效果分析，瀘州醫學院學報2010年第33卷第4期)為了尋找一種適合乳腺癌細胞MCF-7蛋白提取的裂解液配方用于免疫印跡分析，測試了兩種裂解液A(50mM pH 7.4 Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％SDS，1％NP-40，1mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM)和B(50mM pH 7.4 Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％SDS，1％NP-40，1％Triton X-100，1％脫氧膽酸鈉，1mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM)，結果發現2種細胞裂解液均可滿足免疫印跡分析的要求，B液提取的蛋白含量雖比A液高，但A液用于免疫印跡檢測β-actin和Twist的效果更佳。
由上述背景技術可得出如下結論：裂解液裂解法要想最大限度保持裂解物的抗原性，一方面要避免裂解液中的外來成分破壞細胞膜蛋白和細胞質蛋白的高級構象；另一方面要避免細胞內裂解后釋放出的內在蛋白酶對細胞膜蛋白和細胞質蛋白進行水解。
技術實現要素：
本發明旨在克服背景技術中裂解液裂解法存在的不足，提供一種腫瘤細胞裂解液及其試劑盒，以最大限度地保持裂解物的抗原性。
本發明通過如下技術方案得以實現：
化合物蓖麻油磺酸鹽或蓖麻油酸酯在誘導腫瘤細胞的細胞膜破裂方面的應用。
優選地，所述化合物蓖麻油磺酸鹽為蓖麻油磺酸鈉或蓖麻油磺酸鉀。
優選地，所述化合物蓖麻油酸酯為蓖麻油酸乙酯。
一種腫瘤細胞裂解液，包括緩沖體系成分、等滲體系成分、裂解細胞膜成分、蛋白穩定劑和蛋白酶抑制劑，所述裂解細胞膜成分選自上述化合物。
優選地，所述緩沖體系成分為50mM pH為7.4的Tris-HCl。
優選地，等滲體系成分為150mM NaCl。
優選地，蛋白穩定劑為0.5mM EDTA。
優選地，所述蛋白酶抑制劑為5μg/ml Aprotinin或5μg/ml Leupeptin或1mM PMSF。
上述腫瘤細胞裂解液在制備腫瘤全細胞抗原負載的樹突狀細胞腫瘤疫苗中的應用。
一種腫瘤細胞裂解試劑盒，包括上述緩沖體系成分、等滲體系成分、裂解細胞膜成分、蛋白穩定劑和蛋白酶抑制劑。
本發明優點：
本發明發現化合物蓖麻油磺酸鹽或蓖麻油酸酯可以溫和誘導腫瘤細胞的細胞膜破裂，不破壞細胞膜蛋白和細胞質蛋白的高級構象，用其配置的腫瘤細胞裂解液能最大限度地保持裂解物的抗原性，將樹突狀細胞與用上述裂解液裂解的腫瘤細胞裂解物共同培養得到的裂解物致敏DC疫苗具有優異的抗腫瘤效果，并與現有技術常用的凍溶裂解法進行了比較。
具體實施方式
為了更好地解釋本發明的技術方案，下面結合具體實施例進一步介紹。實施例中未特別強調的實驗材料均為常規實驗材料，屬于本領域技術人員易于獲得的范疇。
實施例1：腫瘤細胞裂解液的制備和應用
一、實驗材料
C57BL/6小鼠為8周齡雌性SPF級，購自南京大學動物中心；C57BL/6小鼠來源的肺癌細胞系3LL為本公司保存；DMEM培養基、胎牛血清購于Gibco公司。
其它所用試劑均為國產或進口分析純。
二、實驗方法
1、小鼠骨髓DC的分離制備和鑒定
脫頸處死C57BL/6小鼠，取雙后腿股骨、脛骨，除去上面附著的肌肉組織，除去骨兩端，暴露骨髓腔，用PBS沖洗骨髓腔數次，充分吹打制成單細胞懸液。用200目銅網過濾后，以PBS洗2次，重新懸浮細胞，配制成濃度1×l05/ml細胞懸液，放置于含15％％胎牛血清的DMEM培養液(含100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、1mM谷氨酰氨)中培養。在培養體系中加4ng/ml rhGM-CSF和10ng/ml rhIL-4，6天后培養體系中加入50ng/ml TNF-α繼續培養3天使之成熟。每3天半量換液，培養至第9天時收集疏松黏附的細胞。
DC表型鑒定：通過流式細胞儀測定上述方法獲得的DC表達MHCⅡ類分子、CD86水平。首先將以上制備的DC分別與FICT-抗MHCⅡ類分子、CD86單抗在PBS中反應45分鐘，反應結束后以PBS洗3次，上機分析。
2、腫瘤細胞裂解液的制備
實驗組A：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，5‰蓖麻油磺酸鈉，0.5mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM；
實驗組B：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，5‰蓖麻油磺酸鉀，0.5mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM；
實驗組C：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，5‰蓖麻油酸乙酯，0.5mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM；
對比組A：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，1％Triton X-100，0.5mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM；
對比組B：50mM pH 7.4Tris-HCl，150mM NaCl，1％脫氧膽酸鈉，0.5mM EDTA，臨用前加入PMSF使終濃度為1mM。
3、腫瘤細胞系的培養
C57BL/6小鼠肺癌細胞系3LL于含10％FBS的DMEM培養液中培養。
4、腫瘤細胞系的裂解
當培養的細胞融合率達90％以上時，選取處于對數生長期細胞，調整至5×106/mL，隨機分為6組，每組3瓶。傾去培養液，PBS沖洗2遍，瀝干。其中5組分別加入腫瘤細胞裂解液實驗組A、B、C和對比組A、B 200μl，緩慢吹打約5min，收集裂解液于EP管中，4℃冰浴下于脫色搖床上振搖20min，4℃，12000×g離心15min，收集上清液，0.2μm的微孔濾膜過濾，-80℃保存。剩余1組采用凍溶裂解法(下文稱為對比組C)，方法為：將濃度為5×106/mL的腫瘤細胞置于43℃30min，之后于-80℃和37℃反復凍融4個循環，12000r/min，20min，取上清，0.2μm的微孔濾膜過濾，置-80℃凍存。
5、腫瘤細胞裂解物對DC細胞的致敏方法(DC疫苗的制備)
按6:1的細胞比例將來自C57BL/6小鼠的DC與C57BL/6小鼠肺癌細胞裂解物共培養18小時，收集半貼壁的致敏DC細胞，包括6組：實驗組A、B、C和對比組A、B、C。
6、DC疫苗體內誘導的免疫預防作用
用DC疫苗對健康小鼠進行免疫：將各組DC疫苗懸浮于PBS中，小鼠雙側中腹部皮內注射，每側100微升，2×106/鼠；3天后對小鼠進行第二次免疫，劑量及方法同第一次免疫。兩次免疫小鼠7天后，以腫瘤細胞3LL攻擊小鼠，5×104/鼠/200微升，溶于PBS中，雙側中側腹皮下接種，100微升/側。定期觀察腫瘤生長情況，測定腫瘤體積。空白對照組注射等劑量PBS，腫瘤細胞正常接種。
7、DC疫苗對荷瘤小鼠的免疫治療作用
將對數生長期的3LL(懸浮于PBS中)以5×104/鼠/200微升雙側中側腹皮下接種攻擊小鼠，隨機分組。7天后，皮下注射經放射線滅活的DC疫苗，在第10天進行第二次免疫，免疫劑量和方法同上。記錄腫瘤生長狀況，定期測量腫瘤體積，并記錄各組小鼠180天存活率(％)。空白對照組注射等劑量PBS，腫瘤細胞正常接種。每組20只。
三、實驗結果
1、小鼠骨髓DC的分離鑒定結果
小鼠骨髓來源的DC倒置顯微鏡下觀察，具有典型DC的形態，細胞體積大，外形不規則，胞漿豐富，胞膜向外伸出毛刺狀或樹枝狀突起，有明顯的貼壁集簇生長現象。DC表型鑒定證明上述方法獲得的DC高表達MHCⅡ類分子和CD86。
2、DC疫苗體內誘導的免疫預防作用
腫瘤體積測定結果如下表：
從上表可以看出，傳統的凍溶裂解物致敏DC疫苗對腫瘤的預防效果明顯優于傳統的以Triton X-100或脫氧膽酸鈉為裂解劑的裂解物致敏DC疫苗。本發明提供的腫瘤細胞裂解液顯著優于傳統的裂解液配方，對腫瘤的預防效果與凍溶裂解接近。
3、DC疫苗對荷瘤小鼠的免疫治療作用
各組小鼠180天存活率(％)如下表：
從上表可以看出，傳統的凍溶裂解物致敏DC疫苗對腫瘤的治療效果明顯優于傳統的以Triton X-100或脫氧膽酸鈉為裂解劑的裂解物致敏DC疫苗。本發明提供的腫瘤細胞裂解液顯著優于傳統的裂解液配方，對腫瘤的治療效果與凍溶裂解接近。
上述實施例中，蛋白酶抑制劑也可選用5μg/ml Aprotinin或5μg/ml Leupeptin。
實施例2：腫瘤細胞裂解試劑盒的制備和應用
一種腫瘤細胞裂解試劑盒，包括上述緩沖體系成分、等滲體系成分、裂解細胞膜成分、蛋白穩定劑和蛋白酶抑制劑。緩沖體系成分為Tris-HCl，等滲體系成分NaCl，裂解細胞膜成分為蓖麻油磺酸鈉或蓖麻油磺酸鉀或蓖麻油酸乙酯，蛋白穩定劑為EDTA，蛋白酶抑制劑為Aprotinin或Leupeptin或PMSF。
本發明發現化合物蓖麻油磺酸鹽或蓖麻油酸酯可以溫和誘導腫瘤細胞的細胞膜破裂，不破壞細胞膜蛋白和細胞質蛋白的高級構象，用其配置的腫瘤細胞裂解液能最大限度地保持裂解物的抗原性，將樹突狀細胞與用上述裂解液裂解的腫瘤細胞裂解物共同培養得到的裂解物致敏DC疫苗具有優異的抗腫瘤效果，并與現有技術常用的凍溶裂解法進行了比較，結果發現本發明腫瘤細胞裂解液顯著優于傳統裂解液，對腫瘤的預防、治療效果與凍溶裂解接近。這表明，本發明腫瘤細胞裂解液既比凍溶裂解效率高、操作便捷，又具有相近的致敏效果。
上述實施例僅用于進一步解釋本發明的技術方案，本領域技術人員應當明白，任何簡單替換或修改均不脫離本發明，本發明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。