專利名稱：一種負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物制劑的制備，特別是指一種負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細 胞疫苗的制備方法。
背景技術：
腫瘤在我國多發，近年來其發生率和死亡率逐年上升，成為威脅人類健康的主要 因素之一。腫瘤是全身性疾病，在傳統的手術、放療和化療中，手術和放療屬于局部治療手 段，盡管能有效減低腫瘤負荷，但難以解決轉移和復發問題。化療是傳統手段中唯一的全身 治療手段，但存在有效率低(30%左右)、副反應大、耐藥性、和嚴重的免疫抑制等缺陷，而限 制了臨床應用。因而臨床期待一種副反應小、有效率高、安全、可靠的全身治療手段。腫瘤免疫學的迅速發展，為腫瘤免疫治療提供了一種新理念、新思路。腫瘤“免疫 監視”學說的建立，為腫瘤的發生、發展提供了一種全新的解釋。腫瘤病人機體免疫系統的 “免疫監視”功能降低，致使其自身免疫系統不能有效的識別和清除變異的細胞，造成腫瘤 的發生。“腫瘤微環境”學說解釋了腫瘤病人自身免疫系統的無能，導致腫瘤無限制生長的 原因。如何調動機體免疫系統對腫瘤的識別和殺傷功能，達到治療腫瘤的目的，成為近年來 人們關注的重點問題。大量的基礎研究證實，在“腫瘤微環境”下，會出現外周血⑶4+⑶25+的調節性T 淋巴細胞(Treg)水平增高，白細胞介素-10 (IL-10)、腫瘤生長因子-β (TGF-β)、白細胞 介素-4 (IL-4)、白細胞介素-6 (IL-6)等免疫抑制因子水平升高，以及樹突狀細胞(DC)功 能降低、腫瘤細胞的表面抗原隱匿等。特別是Treg、IL-10和TGF-β等免疫抑制因素，造成 自身免疫系統功能低下而不能有效地識別和殺傷腫瘤細胞，因而造成腫瘤的“免疫逃逸”或 “免疫耐受”。DC細胞是啟動免疫系統對腫瘤進行識別和殺傷的關鍵細胞。DC細胞被認為是唯 一的和專職的抗原提呈細胞，DC細胞能夠在致炎因子的參與下，捕獲腫瘤抗原，通過細胞內 的加工過程制備成抗原多肽，然后將這些抗原多肽轉移到細胞表面，并同MHC分子結合而 形成MHC-抗原復合物，同時完成由非成熟DC向成熟DC的轉化，獲得其提供抗原和激活T 細胞的強大功能。DC疫苗是近年來發展起來的新型腫瘤疫苗，其機理主要是將攜帶腫瘤抗原的DC 疫苗接種病人，以誘導體內產生持久、特異性的抗腫瘤免疫應答，達到識別和清除腫瘤細胞 的目的。目前DC誘導的腫瘤免疫治療已經作為三類醫療技術獲批應用于臨床。DC疫苗的制備通常包括三個步驟首先獲取腫瘤抗原，再從病人外周血獲取DC細 胞，然后用腫瘤抗原沖擊DC使其負載腫瘤抗原，即制備成DC疫苗。DC疫苗的制備方法很多。首先抗原的選擇種類很多，如腫瘤細胞性全抗原(放 射線滅活的腫瘤細胞、腫瘤細胞裂解物等)、腫瘤細胞的亞細胞成分(凋亡小體、外排小體 exosome、自噬小體autophage等)、腫瘤特異性抗原蛋白/多肽、腫瘤相關性抗原蛋白/多肽、腫瘤細胞mRNA、雜交融合的腫瘤細胞等。DC的來源種類也很多，可從外周血的直接分 離、從骨髓造血細胞分離、從外周血單狀核細胞分離、免疫磁珠法分離等。體外抗原沖擊一 般采用合適的抗原劑量，加入DC細胞的培養體系中，經過M-48小時孵育，祛除游離的抗原 和細胞碎片即獲得DC疫苗。但是目前DC疫苗的臨床應用受到限制，一是由于所用腫瘤抗原的免疫原性不夠 強，二是由于多數腫瘤病人的腫瘤抗原不易獲得，三是臨床療效有限。腫瘤特異性抗原蛋白 /多肽和腫瘤相關性抗原蛋白/多肽，抗原性弱，激活免疫的靶點單一，疫苗的免疫原性差， 目前對大多數腫瘤來說，尚無法確定其有效的腫瘤特異性或相關性抗原，且受到HLA限制， 因而很難廣泛應用。腫瘤細胞mRNA雖能代表腫瘤全抗原，但制備過程復雜、容易降解而造 成抗原的缺失，臨床難以推廣。腫瘤細胞裂解物等，含有腫瘤細胞全抗原的蛋白或多肽，抗 原性強且完整，DC細胞攝取加工后所攜帶的抗原靶點全面，激發機體產生的抗腫瘤免疫全 面，因而是一種很好的抗原選擇，但許多病人的腫瘤細胞難以獲取或細胞數量不足，是臨床 亟待解決的問題。應用蠟塊標本制備腫瘤全抗原，盡管擴大了自體腫瘤抗原的來源，但標本 處理的過程中難以避免大量抗原成分的丟失，使其臨床應用同樣受限。用以上抗原制備的 DC疫苗，經臨床應用發現療效有限。因而，臨床急需一種臨床獲取方便、抗原靶點完整、抗原性強且穩定、并能在臨床 容易操控的特定條件下，激發機體產生強大抗腫瘤免疫應答的腫瘤特異性DC疫苗。
發明內容
本發明的目的在于提供一種負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備 方法，采用一種自體腫瘤相關全抗原，制備自體腫瘤抗原特異性DC疫苗，并能在特定條件 下激發強大的抗腫瘤免疫反應。本發明的整體技術構思是
一種負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，包括如下工藝步驟
A、制備自體腫瘤相關全抗原；
B、采取和分離培養DC細胞；
C、用自體腫瘤相關全抗原沖擊DC細胞，使DC細胞成熟并制備成自體腫瘤抗原特異性 DC疫苗。本發明的具體技術解決方案和工藝路線是 所述的步驟A包括如下工藝步驟
Al、采用手術切除、內鏡或穿刺活檢獲得的新鮮腫瘤組織、胸腹水離心獲得的新鮮自體 腫瘤細胞中的一種制成自體腫瘤細胞裂解物蛋白；
A2、將步驟Al中的自體腫瘤細胞裂解物蛋白和同源的細胞株裂解物蛋白混合，制備成 自體腫瘤相關全抗原。步驟Al中手術切除、內鏡或穿刺活檢獲得的新鮮腫瘤組織采用如下方法 取腫瘤周邊部分組織0. 3-1. Ocm3，剪除周圍非腫瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反復洗滌
3-5次，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋 白定量備用。步驟Al中胸腹水離心獲得的新鮮自體腫瘤細胞采用如下方法取胸、腹水1500-2000ml，在轉速為1200轉/分鐘條件下離心5分鐘，生理鹽水洗滌離 心3次，300目鋼網過網后獲得單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白
定量備用O步驟A2中和同源的細胞株抗原混合，制備成自體腫瘤相關全抗原采用如下方法 反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量，制成同源細胞株裂解物蛋白；將同
源細胞株裂解物蛋白與步驟Al中制備的自體腫瘤細胞裂解物蛋白按照質量比為1:1的比 例混合，制備成自體腫瘤相關全抗原備用。步驟B中DC細胞的采取選用外周血直接采取獲得、外周血單狀核細胞分離獲得、 通過骨髓造血細胞分離獲得、通過骨髓或其他組織來源的間充質干細胞定向分化獲得、或 通過HLA基因半相合或全相合同種異體外周血、單狀核細胞、骨髓造血細胞、間充質干細胞 分離分化獲得方法中的一種。步驟B單狀核細胞采集和分離包括
Bi、單狀核細胞采集前，用GM-CSF 150μβ皮下注射，1次/日，行骨髓動員2_3天； Β2、用COBE SPECTRA細胞成分分離機，按照說明書中“單狀核細胞采集”的設定參數設 定程序，外周血循環6000-8000ml，采集單狀核細胞140_160ml ；
B3、將步驟B2中的單狀核細胞分裝入50ml離心管，細胞離心機1500轉/分離心5分 鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，加入質量比為10%葡萄糖酸鈣溶液2. 5ml吹打混勻， 56°C水浴35分鐘，2500轉/分離心5分鐘，收集上清制備成自體滅活血清，4°C冷藏備用； B4、收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含密度為1.077g/ml的密度梯度淋巴細胞分離 液15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機在2000轉/分鐘的轉速下離心15分鐘，一次 性吸管吸取中間白色細胞層即為單狀核細胞。分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽 水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，在1500轉/分的轉速下離心10分鐘后棄上清；加入生理 鹽水45ml輕柔吹打混勻，在1000轉/分的轉速下離心5分鐘洗滌，棄上清；重復洗滌3次 后，加入RPMI-1640培養基，細胞計數(細胞總數量6-10 X IO9)；
B5、在75cm3培養瓶中加入RPMI-1640無血清培養基20ml，室溫下放置20分鐘行培養 瓶活化；將單狀核細胞平均分裝到培養瓶中，細胞濃度控制在IX IO7個/ml，按體積百分比 為10%-20%加入自身血清，于37°C，體積百分比為5%0)2的飽和濕度培養箱中孵育30-60分 鐘取出，移除懸浮細胞和培養液，貼壁細胞即為DC細胞。步驟C包括如下工藝方法
在步驟B制備的DC細胞中加入無血清DC培養基20ml，在培養基中按照如下含量添加 各種組分
GM-CSF 500μδ/500πι1 IL-4 300μδ/500πι1 慶大霉素2. 0萬單位/500ml
其中無血清DC培養基選自美國SIGMA公司或美國BD公司的產品； 將上述培養基置于37°C，體積百分比為5% CO2的飽和濕度培養箱中擴增培養；第6天 加入步驟A制備的自體腫瘤相關全抗原5(^g/ml，次日補充體積百分比為10%_15%的自體血 清，培養2天后獲取DC疫苗，流式細胞檢測CD80、CD83、CD86、HLA-ABC, HLA-DR表達，鑒定 DC疫苗功能。
本發明所制備的DC疫苗是這樣使用的
本發明制備的自體腫瘤特異性DC疫苗，主要用途有兩個方面，一是體外誘導制備自體 腫瘤特異性CTL，過繼回輸行腫瘤的細胞免疫治療；二是表淺淋巴結接種，體內誘導腫瘤特 異性殺傷，用于DC疫苗接種的腫瘤免疫治療，或聯合過繼回輸的細胞免疫治療。DC疫苗接 種治療或聯合DC-CIK-CTL過繼回輸治療前，首先應用小劑量CTX或TBI技術，對病人的腫 瘤微環境進行干擾，可顯著下調Treg、IL-10和TGF-β等免疫抑制因子水平，消除腫瘤微環 境中的免疫抑制因素，打破腫瘤免疫耐受。干擾后次日，行DC疫苗的表淺淋巴結接種和/ 或DC-CIK-CTL過繼回輸治療。動物實驗和臨床試驗證實，在以上條件下，本發明制備的DC 疫苗，能夠有效的在體外和體內誘導腫瘤抗原特異性CTL，并能有效的對腫瘤產生高效率的 特異性殺傷。本發明所制備的疫苗的試驗結果如下 一、實驗目的
(一)應用腫瘤病人自體腫瘤相關全抗原，負載自體DC細胞，制備自體腫瘤抗原特異性 DC疫苗；
(二)應用負載自體腫瘤相關全抗原的DC，激活自體T淋巴細胞，制備自體腫瘤特異性 CTL (效應細胞)；
(三)實驗室實驗研究，證實DC疫苗誘導的CTL對自體腫瘤細胞的殺傷效率；
(四)動物實驗研究，證實DC疫苗體內誘導的特異性抗腫瘤免疫殺傷效應；
(五)臨床試驗研究證實DC疫苗在干擾腫瘤微環境、打破腫瘤免疫耐受條件下臨床應 用的實際療效。二、實驗設計
(一)自體腫瘤相關全抗原獲取手術切除、內鏡或穿刺活檢獲取的新鮮腫瘤組織、胸腹 水離心獲取的新鮮腫瘤細胞、同組織來源的細胞株。(二)自體DC和T細胞獲取應用COBE Spectra血液成分分離機，獲取外周血DC 和T細胞。(三)DC疫苗制備自體腫瘤相關全抗原負載DC細胞，獲得DC疫苗。(四)DC疫苗的功能檢測
(1)DC疫苗誘導腫瘤特異性CTL的實驗負載抗原的DC和T細胞共培養，獲得腫瘤特 異性CTL ；
(2)in vitro實驗觀察腫瘤特異性CTL對自體腫瘤細胞的殺傷效應(Cytotoxicity assay)；
(3)in vivo實驗動物實驗觀察CTL的腫瘤特異性殺傷效應；
(五)臨床試驗選擇肺癌病人10例，按照特定治療流程進行治療，觀察臨床療效和副反應。三、實驗步驟
(一)自體腫瘤相關全抗原的制備
自體腫瘤相關全抗原的制備方法如下取手術切除、內鏡或穿刺獲得的新鮮自體腫瘤 標本、胸腹水離心獲得的新鮮自體腫瘤細胞抗原，和同源的細胞株抗原混合，制備成自體腫 瘤相關全抗原。這種自體腫瘤相關全抗原的特點是一是具有和自體腫瘤相關的腫瘤全抗原，該全抗原的抗原靶點完整、穩定、抗原性強，具備個體化特征且不存在HLA限定性；二是 同源的細胞株抗原成分95%以上和自體腫瘤抗原相同，因而能有效地補充自體腫瘤抗原的 不足，而且少量的異抗原可使抗原性增強；三是大多數腫瘤病人可通過以上抗原制備方法 獲得自體腫瘤相關抗原，從而獲得免疫治療的機會；四是少數不能獲取自體腫瘤抗原的病 人，可以用相同組織來源的細胞株抗原代替，同樣不失自體腫瘤抗原相關的特征。具體步驟是
(1)手術切除的新鮮腫瘤組織取腫瘤周邊部組織(避免腫瘤中心的壞死組織) 0. 3-1. Ocm3 (可液氮或-80°C冰箱保存備用)，剪除周圍非腫瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反 復洗滌3-5次，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過 網后蛋白定量備用。(2)胸、腹水獲得的腫瘤細胞取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm離心，生理鹽水洗 滌離心3次，300目鋼網過網后獲得單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后
蛋白定量備用。(3)同組織來源細胞株反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量備用。(4)取自體腫瘤裂解物蛋白和同源細胞株裂解物蛋白各50%，混合制備成自體腫瘤 相關全抗原，定量備用。(二)DC細胞的獲取和分離
本發明采用的DC細胞，可通過外周血直接采取獲得，可通過外周血單狀核細胞分離獲 得，可通過骨髓造血細胞分離獲得，可通過骨髓或其他組織來源的間充質干細胞定向分化 獲得，還可以通過HLA基因半相合或全相合同種異體外周血、外周血單狀核細胞、骨髓造血 細胞、或其他組織來源的間充質干細胞分離或定向分化獲得。具體步驟是
(1)單狀核細胞采集單狀核細胞采集前，首先應用GM-CSF 150μβ皮下注射，1次/日， 行骨髓動員2-3天。采集日，應用COBE SPECTRA細胞成分分離機，按照說明書中“單狀核細 胞采集”的設定參數設定程序，外周血循環6000-8000ml，采集單狀核細胞140_160ml。分裝 入50ml離心管，細胞離心機1500轉/分離心5分鐘。收集上層血漿移入50ml離心管，制 備自體滅活血清(加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉/分離 心5分鐘，收集上清)，4°C冷藏備用。收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液 (Ficoll, 1. 077)15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機離心2000rpmX 15分鐘，一次性 吸管吸取中間白色細胞層(單狀核細胞)。分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的 50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清。加入生理鹽水45ml輕柔吹打 混勻，離心IOOOrpmX5分鐘洗滌，棄上清。重復洗滌3次后，加入RPMI-1640培養基，細胞 計數(細胞總數量6-10X109)。(2)DC細胞分離75cm2培養瓶分別加入RPMI-1640無血清培養基20ml，室溫下放 置20分鐘行培養瓶活化。將單狀核細胞平均分裝到培養瓶中，細胞濃度控制在IX IO7個 /ml，加入終濃度10-20%的自身血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養箱中孵育30-60分鐘取出， 移除懸浮細胞和培養液(用作CIK和CTL制備)，貼壁細胞即為非成熟DC細胞(imature DC)。(3)流式細胞檢測取培養5天的imDCs 1. 2X 106/ml，加入20%兔血清400ul，4°C 冰箱避光孵育20分鐘；分裝入流式細胞檢測管，300g離心10分鐘，棄上清，分別加入標有不同顏色熒光素的單克隆抗體工作液10μ1 (PE-IgG2a mAb, FITC-IgG2bmAb, PE-IgGlmAb, PE-HLA-ABCmAb，FITC-HLA-DRmAb，PE-CD83mAb，PE-CD80mAb，PE-CD86mAb)，避光 4°C 30 分鐘 進行標記，PBS洗2次，上機檢測。
結果
腫瘤病人非成熟DC的表面標志物⑶80、⑶83、⑶86和HLA-DR均顯著低于健康正常人 (P<0. 01, respectively ； Table 1):
Table 1. DC markers in imature DCs (n=10 ；x±s)
DCmarkersPatientswithcancerHealthyvolunteersCD8019. 17±3. 31*42. 11 ±4. 79林CD8326. 33±4. 72*54. 70 ±4. 47**CD8632. 53±6. 05*83. 62 ±10. 26**HLA-DR40. 32 ±8. 24*80. 13±13. 52**HLA-ABC94. 69±9. 24 *95. 14±10. 68 #
氺 vs 氺氺P<0.01, respectively; * vs # : P>0. 05； (三)DC疫苗的制備
自體腫瘤特異性DC疫苗，是通過自體腫瘤相關全抗原沖擊非成熟DC細胞，然后將負載 腫瘤全抗原的非成熟DC細胞培養成熟制備而成。具體步驟是
上述貼壁的DC細胞中加入RPMI-1640無血清培養基20ml (含GM-CSF 500μδ/500πι1, IL-4 30(^g/500ml，慶大霉素2. 0萬單位/500ml)，置于37°C，5%C02的飽和濕度培養箱中擴 增培養。第6天加入自體腫瘤相關全抗原5(^g/ml，次日補充10-15%的自體血清，培養48 小時獲取DC疫苗(
圖1)。DC標志物鑒定取培養7天的imDCs 1. 2X 106/ml，加入20%兔血清400μ1，4 冰 箱避光孵育20分鐘；分裝為6管，300g離心10分鐘，棄上清，分別加入標有不同顏色熒光素 的單克隆抗體工作液 10μ1 (PE-IgG2a mAb, FITC-IgG2bmAb, PE-IgGlmAb, PE-HLA-ABCmAb， FITC-HLA-DRmAb，PE_CD83mAb，PE_CD80mAb，PE_CD86mAb)，避光 4°C 30 分鐘進行標記，PBS 洗2次，上機流式細胞檢測。分泌IL-12功能檢測取培養48小時后的DC上清液，應用酶標儀在450nm波長， 按ELISA試劑盒說明，測定J值，計算各組上清中IL-12的平均濃度，并據標準曲線計算 IL-12 的量(pg/ml)。T細胞活化功能鑒定取imDC、mDC、以及自體和異體T淋巴細胞，分別按E:T=20:1 的比例加入96孔圓底培養板，37°C、5%C02培養箱共培養M小時，加入CCK-8試劑20 μ 1/ 孔，培養3小時后，酶標儀450nm波長測定OD值。結果
非成熟DC培養5天后，于第6天加入腫瘤抗原，培養2天后，完成DC的成熟過程，并制 備成DC疫苗。此時的DC為成熟DC，其特征為細胞表面出現明顯的樹突樣突起(圖2)、細 胞表面標志物的表達顯著上調(Table 2)、分泌IL-12的水平顯著提高(圖3)、并能有效的 激活自體或異體T細胞(圖4)。
權利要求
1.一種負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其特征在于包括如下 工藝步驟A、制備自體腫瘤相關全抗原；B、采取和分離培養DC細胞；C、用自體腫瘤相關全抗原沖擊DC細胞，使DC細胞成熟并制備成自體腫瘤抗原特異性 DC疫苗。
2.根據權利要求1所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟A包括如下工藝步驟Al、采用取手術切除、內鏡或穿刺獲得的新鮮腫瘤組織、以及胸腹水離心獲得的新鮮自 體腫瘤細胞中的一種，制成自體腫瘤細胞裂解物蛋白；A2、將步驟Al中的自體腫瘤細胞裂解物蛋白和同源的細胞株裂解物蛋白混合，制備成 自體腫瘤相關全抗原。
3.根據權利要求2所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟Al中手術切除、內鏡或穿刺獲得的新鮮腫瘤組織采用如下方法取腫瘤周邊部分組織0. 3-1. Ocm3，剪除周圍非腫瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反復洗滌 3-5次，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量備用。
4.根據權利要求2所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟Al中胸腹水離心獲得的新鮮自體腫瘤細胞采用如下方法取胸、腹水1500-2000ml，在轉速為1200轉/分鐘條件下離心5分鐘，生理鹽水洗滌離 心3次，300目鋼網過網后獲得單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量備用O
5.根據權利要求2所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟A2中的自體腫瘤抗原和同源的細胞株抗原混合，制備成自體腫瘤相 關全抗原采用如下方法反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量，制成同源細胞株裂解物蛋白；將同 源細胞株裂解物蛋白與步驟Al中制備的自體腫瘤細胞裂解物蛋白按照質量比為1:1的比 例混合，制備成自體腫瘤相關全抗原備用。
6.根據權利要求1所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟B中DC細胞的采取選用外周血直接采取獲得、外周血單狀核細胞分離 獲得、通過骨髓造血細胞分離獲得、通過骨髓或其他組織來源的間充質干細胞定向分化獲 得、或通過HLA基因半相合或全相合同種異體外周血、外周血單狀核細胞、骨髓造血細胞、 間充質干細胞分離或定向分化獲得方法中的一種。
7.根據權利要求6所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟B單狀核細胞采集和分離包括Bi、單狀核細胞采集前，用GM-CSF 150μδ皮下注射，1次/日，行骨髓動員2_3天； Β2、用COBE SPECTRA細胞成分分離機，按照說明書中“單狀核細胞采集”的設定參數設 定程序，外周血循環6000-8000ml，采集單狀核細胞140_160ml ；B3、將步驟B2中的單狀核細胞分裝入50ml離心管，細胞離心機1500轉/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，加入質量比為10%葡萄糖酸鈣溶液2. 5ml吹打混勻， 56°C水浴35分鐘，2500轉/分離心5分鐘，收集上清制備成自體滅活血清，4°C冷藏備用； B4、收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含密度為1.077g/ml的密度梯度淋巴細胞分離 液15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機在2000轉/分鐘的轉速下離心15分鐘，一次 性吸管吸取中間白色細胞層即為單狀核細胞；分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，在1500 轉/分的轉速下離心10分鐘后棄上清；加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，在1000轉/分 的轉速下離心5分鐘洗滌，棄上清；重復洗滌3次后，加入RPMI-1640培養基，細胞計數；B5、在75cm3培養瓶加入RPMI-1640無血清培養基20ml，室溫下放置20分鐘行培養瓶 活化；將單狀核細胞平均分裝到培養瓶中，細胞濃度控制在IX IO7個/ml，按體積百分比為 10%-20%加入自身血清，于37°C，體積百分比為5%0)2的飽和濕度培養箱中孵育30-60分鐘 取出，移除懸浮細胞和培養液，貼壁細胞即為DC細胞。
8.根據權利要求1所述的負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法，其 特征在于所述的步驟C包括如下工藝方法在步驟B制備的DC細胞中加入無血清DC培養基20ml，在培養基中按照如下含量添加 各種組分GM-CSF 500μδ/500πι1 IL-4 300μδ/500πι1 慶大霉素2. 0萬單位/500ml其中無血清DC培養基選自美國SIGMA公司或美國BD公司的產品； 將上述培養基置于37°C，體積百分比為5%0)2的飽和濕度培養箱中擴增培養；第6天加 入步驟A制備的自體腫瘤相關全抗原5(^g/ml，次日補充體積百分比為10%_15%的自體血 清，培養2天后獲取DC疫苗，流式細胞檢測CD80、CD83、CD86、HLA-ABC, HLA-DR表達，鑒定 DC疫苗功能。
全文摘要
本發明屬于生物細胞制劑的制備，特別是指一種負載自體腫瘤相關全抗原的樹突狀細胞疫苗的制備方法。包括制備自體腫瘤相關全抗原，采取和分離培養DC細胞，用自體腫瘤相關全抗原沖擊DC細胞，使DC細胞成熟并制備成自體腫瘤抗原特異性DC疫苗。本發明解決了現有技術存在的所用腫瘤抗原的免疫原性不夠強、抗原靶點不完全、多數腫瘤病人的腫瘤抗原不易獲得等問題。本DC疫苗具有能夠有效的在體外和體內誘導腫瘤抗原特異性CTL、并能高效率的對腫瘤產生特異性殺傷、臨床應用的總體有效率高、無明顯毒副作用等優點。
文檔編號A61K39/00GK102091327SQ201010606960
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月27日 優先權日2010年12月27日
發明者杰夫·梅德因, 蔡建輝, 謝紹建 申請人:蔡建輝