專利名稱：一種靶向長循環的高分子脂質體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向長循環的高分子脂質體及其制備方法，屬于藥物技術領域。
背景技術：
脂質體是單層或多層脂質雙分子膜以同心圓的形式包封而成的微球體。由于脂質體的膜材與細胞膜的成分很相似，因此與細胞的親和能力較強，可通過內吞作用被細胞吞噬，或通過與細胞膜的融合作用進入細胞。將一些不穩定、易氧化的藥物包封在脂質體中，不僅可以保護藥物在進入病灶部位前免受機體酶的分解，提高其穩定性，而且可以保持藥物在血液中的有效濃度，實現長期持續的釋放，因此脂質體在藥物載體和基因載體領域受到越來越廣泛的關注。但是以卵磷脂和膽固醇制備的常規脂質體在體內多被網狀內皮系統 (reticuloendothelial system, RES)吞卩遼,在血液循環中駐留時間較短。并且其物理化學穩定性差，儲存和應用過程中容易發生融合聚集，疏水性藥物包封率低，包封藥物容易泄漏；表面官能團少，不易進行功能修飾，無靶向性、功能單一等。因此，開發新型脂質體的研究備受關注。專利CN102058534A使用一種雙親性高分子Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽(OQPGA)，代替傳統脂質體中的組分卵磷脂，與膽固醇組裝制得了一種新型的高分子脂質體。該脂質體原料易得、組裝簡便，長期放置仍然具有穩定的粒徑和電位。但是該脂質體在生理條件下具有較強的正電性，在正常細胞和病變細胞均有分布，缺少對病灶部位的靶向性，而且容易被網狀內皮系統(reticuloendothelial system, RES)捕捉,在血液循環中的駐留時間較短。聚乙二醇(PEG)是一種常用的藥用輔料，良好的水溶性使得其常常作為難溶藥物的助溶劑從而增加藥物的體內生物利用度，而且PEG可以延長藥物在體內的釋放時間，主藥與PEG組成的耦合體進入體內會因酶的作用而慢慢降解，主藥從PEG的羥基上緩慢脫落進入血液循環從而可延時釋放。α νβ 3整合素在各種腫瘤細胞及新生血管內皮細胞上有高表達，RGD多肽可特異性地識別這些整合蛋白受體，從而提高對腫瘤部位的靶向性。將RGD肽連接在藥物載體上不僅可以使藥物集中在病灶部位發生作用，而且可以降低使用劑量，減少藥物的毒副作用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種表面正電位低，粒徑均勻同時具有靶向和長循環功能的新型高分子脂質體及其制備方法，這種高分子脂質體表面帶有PEG和RGD多肽。本發明首先對Υ -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽(OQPGA)進行修飾，將PEG和RGD肽連接到聚合物上，然后將功能化后的OQPGA與膽固醇通過反相蒸發法或薄膜分散法組裝，制備得到這種新型高分子脂質體。如圖3透射照片所示，其粒徑均勻，分散性好，且具有明顯的層狀脂質體結構。如圖4粒度測試結果所示，其有效粒徑為99. 8nm，且多分散度較小。如圖5的Zeta電位分析圖所示,該脂質體具有較低的Zeta正電位。本發明的技術方案如下一種靶向長循環的高分子脂質體，其特征是PEG修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽，共同和膽固醇組裝得到的陽離子高分子脂質體，其粒徑在80nm 150nm之間，表面Zeta電位為5 7mV。PEG修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽，其特征是將PEG接枝到Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的側鏈上，制備步驟如下
a.將Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和PEG-2000以質量比為2 4溶解在二氯甲烷里，室溫攪拌至固體溶解；b.向上述溶液中加入質量為PEG-2000的I. I I. 5倍的二環己基碳二亞胺，室溫攪拌反應24 48小時；c.將上述反應液減壓抽濾除去懸浮固體后，用截留分子量為8000 14000的透析袋透析I 2天后真空凍干，即得到純化的PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽。RGD肽修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽，其特征是將RGD接枝到Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的側鏈上，制備步驟如下a.將I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺加入到Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的二氯甲烷溶液中，二者與Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的質量比分別為I 4和O. 25 2，室溫攪拌18 24小時；b.用旋轉蒸發儀除去反應液中的二氯甲烷后，加入乙腈使其溶解，向體系中加入RGD肽，室溫下攪拌反應I 3天；c.將得到的反應液用截留分子量為8000 14000的透析袋透析2 4天后真空凍干，即得到RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽。一種靶向長循環的高分子脂質體的制備方法，其特征是將PEG修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽(二者質量比為O. 25
2)，與膽固醇通過反相蒸發法或薄膜分散法制備得到，膽固醇的用量與前面兩者的質量和之比為O. 5 2。一種靶向長循環的高分子脂質體的制備方法，其特征是采用反相乳液蒸發法時制備步驟如下a.將PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和膽固醇，溶解于二氯甲烷中；b.將上述溶液用超聲波細胞粉碎機超聲，功率控制在200 250W，并且在超聲的過程中加入2 4倍于二氯甲烷體積的去離子水，形成均勻乳液；c.將上述乳液用旋轉蒸發儀除去體系中的二氯甲烷，即得到靶向長循環的高分子脂質體。一種靶向長循環的高分子脂質體的制備方法，其特征是采用薄膜分散法時制備步驟如下a.將PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和膽固醇，溶解于二氯甲烷中；b.將上述溶液用旋轉蒸發儀除去體系中的二氯甲烷，待反應瓶中形成脂質膜時停止蒸發;c.向上述脂質膜中加入去離子水，超聲分散均勻，即得到靶向長循環的高分子脂質體。其中原料可以采用如下方法制備本發明所述的OQPGA制備可按照常津等提供的專利方法(申請(專利)號201010563409. 6)進行制備。將Y _聚谷氨酸和二甲基環氧丙基十八烷基氯化銨加入到四口燒瓶中，加入異丙醇攪拌至固體溶解，加熱至60 V，冷凝回流反應I天；反應結束后，用旋轉蒸發儀將異丙醇蒸出，將產物透析后凍干。本發明的有益效果制備過程簡單可行，所用原料易得，且反應產率較高。本發明涉及的高分子脂質體的性能包括有效粒徑在80 150nm之間，粒徑分布均勻；Zeta電位在5 7mV，正電性低；表面有PEG和RGD肽修飾，具有體內長循環性和腫瘤靶向性；穩定性好，可在水溶液中穩定保存。
圖I :實施例I中制備的PEG修飾的OQPGA的紅外譜圖；圖2 :實施例4中制備的RGD肽修飾的OQPGA的紅外譜圖；圖3 :實施例7中制備的高分子脂質體的透射電鏡照片；圖4 :實施例10中制備的高分子脂質體的粒徑分析圖；圖5 :實施例12中制備的高分子脂質體的Zeta電位分析圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的實施例作出詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，所給出的詳細實施方式和過程，是對本發明的進一步說明，而不是限制本發明的范圍。實施例I :制備PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽將200mg Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和100mgPEG-2000溶解在二氯甲烷里，室溫攪拌至固體溶解，再加入IlOmg 二環己基碳二亞胺，室溫攪拌反應24小時，將上述反應液減壓抽濾除去懸浮固體后，用截留分子量為8000 14000的透析袋透析I天后真空凍干即可。如圖I紅外分析測試結果所示，2850. Ilcm-I和2918. Olcm-I以及721. 46cm_l附近的峰來自于OQPGA上的季銨鹽鏈鍛上的亞甲基，同時，1468. 27cm-l的峰來自于亞甲基上的C-H收縮振動峰；另外可以觀察到譜圖上 2741. 07cm-l,2695. 35cm_l，963cm_l，842cm_l 均來自 PEG，這些都說明了 PEG 修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽合成成功。實施例2 制備PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽將300mg Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和100mgPEG-2000溶解在二氯甲烷里，室溫攪拌至固體溶解，再加入130mg 二環己基碳二亞胺，室溫攪拌反應36小時，將上述反應液減壓抽濾除去懸浮固體后，用截留分子量為8000 14000的透析袋透析I. 5天后真空凍干即可。
實施例3:制備PEG修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽將400mg Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和100mgPEG-2000溶解在二氯甲烷里，室溫攪拌至固體溶解，再加入150mg 二環己基碳二亞胺，室溫攪拌反應48小時，將上述反應液減壓抽濾除去懸浮固體后，用截留分子量為8000 14000的透析袋透析2天后真空凍干即可實施例4 制備RGD肽修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽稱取IOOmg的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽溶于IOOml的CH2C12中，然后加入I-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(IOOmg)和N-羥基琥珀酰亞胺和NHS (25mg)，室溫下攪拌反應18小時；然后將CH2C12旋轉蒸發后，加入IOml的乙腈將其溶解，再加入30mgRGD多肽，在室溫下反應I天；將產物裝入透析袋(Mw =8000-14000)在蒸餾水中透析2天，真空凍干即可。如圖2紅外分析測試結果所示，2918. Olcm-I，2850. 13cm_l，1468. 27cm-l,721. 48cm-1 處的峰均來自 OQPGA上季銨鹽的亞甲基峰，而 3257. 67cm-l (NH2 峰)，1689cm_l，1570cm_l (NH2 峰)，1220cm_l 處的峰均來自RGD多肽上的峰值，從而說明RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽合成成功。實施例5 制備RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽稱取200mg的OQPGA粉末溶于IOOml的CH2C12中，然后加入I-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(400mg)和N-羥基琥珀酰亞胺和NHS (200mg)，室溫下攪拌反應20小時；然后將CH2C12旋轉蒸發后，加入IOml的乙腈將其溶解，再加入30mgRGD多肽，在室溫下反應2天；將產物裝入透析袋(Mw :8000-14000)在蒸懼水中透析3天,真空凍干即可。實施例6 制備RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽稱取150mg的OQPGA粉末溶于IOOml的CH2C12中，然后加入I-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(450mg)和N-羥基琥珀酰亞胺和NHS (225mg)，室溫下攪拌反應24小時；然后將CH2C12旋轉蒸發后，加入IOml的乙腈將其溶解，再加入30mgRGD多肽，在室溫下反應3天；將產物裝入透析袋(Mw :8000-14000)在蒸懼水中透析4天,真空凍干即可。實施例7 反相蒸發法制備高分子脂質體稱取5mg PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、20mgRGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和12. 5mg膽固醇，加入到茄形瓶中，溶于4ml的二氯甲烷中，然后加入8ml的去離子水，用超聲波細胞粉碎機以200W的功率對其進行超聲分散，直至形成白色乳液；然后于旋轉蒸發儀上進行旋蒸，當有機溶劑完全揮發后即得高分子脂質體。所制備的高分子脂質體的性能包括制備的高分子脂質體有效粒徑為100. 3nm,多分散性指數為O. 124，Zeta電位為6. 39mV。如圖3的TEM照片所示，該脂質體在水中的粒徑在IOOnm左右，粒徑分布均勻，和通過動態激光散射儀測得的粒徑結果一致。實施例8:反相蒸發法制備高分子脂質體稱取IOmg PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、IOmgRGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和20mg膽固醇，加入到茄形瓶中，溶于4ml的二氯甲烷中，然后加入12ml的去離子水，用超聲波細胞粉碎機以220W的功率對其進行超聲分散，直至形成白色乳液；然后于旋轉蒸發儀上進行旋蒸，當有機溶劑完全揮發后即得高分子脂質體。所制備的高分子脂質體的性能包括制備的高分子脂質體有效粒徑為129. 7nm,多分散性指數為O. 105，Zeta電位為5. 67mV。實施例9 反相蒸發法制備 高分子脂質體稱取20mg PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、IOmgRGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八燒基季銨鹽和60mg膽固醇,加入到爺形瓶中，溶于4ml的二氯甲烷中，然后加入16ml的去離子水，用超聲波細胞粉碎機以250W的功率對其進行超聲分散，直至形成白色乳液；然后于旋轉蒸發儀上進行旋蒸，當有機溶劑完全揮發后即得高分子脂質體。所制備的高分子脂質體的性能包括制備的高分子脂質體有效粒徑為136. 3nm，多分散性指數為O. 095，Zeta電位為6. 19mV。實施例10 薄膜分散法制備高分子脂質體將IOmgPEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、40mgRGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和25mg膽固醇，溶解于二氯甲烷中，將上述溶液用旋轉蒸發儀除去體系中的二氯甲烷，置于真空干燥箱中干燥，向上述反應瓶中加入去離子水，超聲分散，使脂質膜分散均勻后，即得到靶向長循環的高分子脂質體。所制備的高分子脂質體的性能包括如圖4粒徑分布圖所示，制備的高分子脂質體有效粒徑為99. 8nm，多分散性指數為O. 190，Zeta電位為6. 48mV。實施例11 薄膜分散法制備高分子脂質體將18mgPEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、ISmgR⑶肽修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和36mg膽固醇，溶解于二氯甲烷中，將上述溶液用旋轉蒸發儀除去體系中的二氯甲烷，置于真空干燥箱中干燥，向上述反應瓶中加入去離子水，超聲分散，使脂質膜分散均勻后，即得到靶向長循環的高分子脂質體。所制備的高分子脂質體的性能包括制備的高分子脂質體有效粒徑為119. 4nm，多分散性指數為O. 132，Zeta 電位為 6. 6ImV0實施例12 薄膜分散法制備高分子脂質體將28mgPEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、HmgRGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和84mg膽固醇，溶解于二氯甲烷中，將上述溶液用旋轉蒸發儀除去體系中的二氯甲烷，置于真空干燥箱中干燥，向上述反應瓶中加入去離子水，超聲分散，使脂質膜分散均勻后，即得到靶向長循環的高分子脂質體。所制備的高分子脂質體的性能包括制備的高分子脂質體有效粒徑為129. 8nm，多分散性指數為O. 136，如圖5電位分析圖所示，Zeta電位為6. 84mV。
權利要求
1.一種靶向長循環的高分子脂質體，其特征是由PEG修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和RGD肽修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽，與膽固醇組裝而得，其粒徑在80 150nm之間，表面Zeta電位為5 7mV。
2.如權利要求I所述的PEG修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽，其特征是將PEG接枝到Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的側鏈上，制備步驟如下 a.將Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和PEG-2000(質量比為2 4)溶解在二氯甲烷里，室溫攪拌至固體溶解； b.向上述溶液中加入質量份數為PEG-2000的11 I.5倍的二環己基碳二亞胺，室溫攪拌反應24 48小時； c.將上述反應液減壓抽濾除去懸浮固體后，用截留分子量為8000 14000的透析袋透析I 2天后真空凍干，即得到純化的PEG修飾的Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽。
3.如權利要求I所述的RGD肽修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽，其特征是將RGD接枝到Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的側鏈上，制備步驟如下 a.將I-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺加入到Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的二氯甲烷溶液中，I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺與Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的份數質量比分別為I 4和0. 25 2，室溫攪拌18 24小時； b.用旋轉蒸發儀除去反應液中的二氯甲烷后，加入乙腈使其溶解，向體系中加入RGD肽，室溫下攪拌反應I 3天； c.將得到的反應液用截留分子量為8000 14000的透析袋透析2 4天后真空凍干，即得到RGD肽修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽。
4.如權利要求I所述的一種靶向長循環的高分子脂質體的制備方法，其特征是將質量份數比為0. 25 2的PEG修飾Y -聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和RGD肽修飾Y _聚谷氨酸十八烷基季銨鹽，與膽固醇通過反相蒸發法或薄膜分散法制備得到，膽固醇的用量與PEG修飾Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和RGD肽修飾Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽的質量和之比為0. 5 2。
5.如權利要求I所述的一種靶向長循環的高分子脂質體的制備方法，其特征是采用反相乳液蒸發法時制備步驟如下 a.將PEG修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、RGD肽修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和膽固醇，溶解于二氯甲烷中； b.將上述溶液用超聲波細胞粉碎機超聲，功率控制在200 250W，并且在超聲的過程中加入2 4倍于二氯甲烷體積的去離子水，形成均勻乳液； c.將上述乳液用旋轉蒸發儀除去體系中的二氯甲烷，即得到靶向長循環的高分子脂質體。
6.如權利要求I所述的一種靶向長循環的高分子脂質體的制備方法，其特征是采用薄膜分散法時制備步驟如下 a.將PEG修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽、RGD肽修飾的Y-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽和膽固醇，溶解于二氯甲烷中； b.將上述溶液用旋轉蒸發儀除去體系中的二氯甲烷，待反應瓶中形成脂質膜時停止蒸發；C.向上述脂質膜中加入去離子水， 超聲分散均勻，即得到靶向長循環的高分子脂質體。
全文摘要
本發明涉及一種靶向長循環的高分子脂質體及其制備方法。即通過PEG和RGD對γ-聚谷氨酸十八烷基季銨鹽(OQPGA)進行修飾得到PEG-OQPGA和RGD-OQPGA，并與膽固醇通過反相蒸發法或薄膜分散法組裝，制備得到一種靶向長循環的高分子脂質體，其粒徑介于80～150nm，Zeta電位為5～7mV。通過本技術得到的新型高分子脂質體具有粒徑均一、分散性好、Zeta電位低、體內長循環性和腫瘤靶向性的優點，在水溶液中穩定性好，適于長期保存。
文檔編號A61K9/127GK102631321SQ20121012384
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月25日 優先權日2012年4月25日
發明者常津, 彭瑤, 王漢杰, 王生, 蘇文雅 申請人:天津大學