專利名稱：一種基因和疏水藥物共負載peg化納米粒子的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的制備方法。它結合了基因治療和化學治療，屬于基因治療領域新型高效非病毒基因傳遞體系的制備方法和技術。
背景技術：
癌癥(惡性腫瘤)由于缺乏有效治療手段，已成為影響人類健康的重要疾病，每年直接用于腫瘤治療的費用數以百億計。癌癥成為科學家尚未攻克的最頑固堡壘之一，也是當代科學研究最具有挑戰性的課題之一。化學療法是惡性腫瘤綜合治療的重要手段之一。但由于其藥物用量大，缺乏專一性，使得在抑制癌組織的同時對正常人體細胞也造成嚴重的毒副作用，患者在治療期間容易產生多重耐藥性。因此，為減少抗癌藥對人體正常細胞的毒副作用，尋找安全穩定的藥物載體對化學療法的進一步發展至關重要。基因治療是將人的健康基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體細胞，以糾正基因的缺陷或發揮治療作用，從而治療疾病的生物醫學新技術。其關鍵是選擇合適的基因載體及基因導入方法，使目的基因能夠在靶細胞中獲得安全、高效、可控且穩定的表達。聚陽離子由于具有制備簡單、免疫原性低、載基因容量大等特點，成為基因治療載體的主要發展方向之一。但這類聚陽離子/DNA組裝體在體內容易發生聚集，而被網狀內皮系統清除出體內，降低基因傳遞體系在體內的循環時間并影響基因轉染效率。制備聚乙二醇(PEG)化的基因傳遞體系可有效解決上述問題。已有研究發現，將治療基因與抗癌藥物同時輸送到腫瘤細胞中，構建高效安全的基因藥物復合載體，達到基因療法和化學療法的協同作用，實現基因和抗癌藥物的有效傳遞，有效解決癌細胞的多藥耐藥性，具有重要的科學和應用價值。因此通過￠-環糊精與二茂鐵的主客體作用引入PEG鏈段，通過￠-環糊精與疏水藥物的包結作用負載藥物，可制備基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子，為采用化學藥物與基因聯合治療惡性腫瘤提供了新的制備方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的制備方法。基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的制備方法的步驟如下
1)配置濃度為0.5 4 mg/mL的P -環糊精修飾聚陽離子溶液；
2)配置濃度為0.5 4 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇溶液；
3)將步驟I)和步驟2)溶液混合，使P-環糊精與二茂鐵的摩爾比為4:1 2:1，超聲30 min后靜直；
4)配置濃度為2mg/mL的疏水藥物溶液； 5)將步驟4)制備的疏水藥物溶液滴加到步驟3)溶液中，使3-環糊精與疏水藥物的摩爾比為1:1 1:4，避光攪拌24 h，透析8 24h，凍干，得到￠-環糊精修飾聚陽離子/二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物粉末；6)配置濃度為0.05 I mg/mL的P -環糊精修飾聚陽離子/ 二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物溶液；
7)配置濃度為75 100l^g/mL的DNA溶液；
8)將步驟6)溶液加入到等體積步驟7)溶液中，漩渦混合并靜置30min，獲得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。所述的0 -環糊精修飾聚陽離子包括P -環糊精修飾聚乙烯亞胺、P -環糊精修飾聚賴氨酸或3-環糊精修飾殼聚糖。所述的疏水藥 物包括阿霉素或紫杉醇。本發明通過主客體作用制備基因和疏水藥物共負載的PEG化納米粒子，通過 環糊精與二茂鐵的主客體作用引入PEG鏈段，通過￠-環糊精與疏水藥物的包結作用負
載藥物，為采用化學藥物與基因聯合治療惡性腫瘤提供了新的制備方法。制備方法簡單易操作，PEG化的程度、藥物及基因的裝載量易調節，顯著提高了基因和疏水藥物共負載納米粒子在生理鹽溶液中的穩定性。
圖I為基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子與PEI-g-CD/DOX/ DNA組裝體在生理鹽溶液中放置不同時間的粒徑變化；
圖2為基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子在生理鹽溶液放置Ih后的透射電鏡照
片;
圖3為基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子與PEI-g-CD/DNA組裝體及PEI-g-CD/DOX/ DNA組裝體的(-電位值；
圖4為基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的體外藥物釋放曲線。
具體實施例方式一種基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的制備方法的步驟如下
1)配置濃度為0.5 4 mg/mL的P -環糊精修飾聚陽離子溶液；
2)配置濃度為0.5 4 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇溶液；
3)將步驟I)和步驟2)溶液混合，使P-環糊精與二茂鐵的摩爾比為4:1 2:1，超聲30 min后靜直；
4)配置濃度為2mg/mL的疏水藥物溶液；
5)將步驟4)制備的疏水藥物溶液滴加到步驟3)溶液中，使3-環糊精與疏水藥物的摩爾比為1:1 1:4，避光攪拌24 h，透析8 24h，凍干，得到￠-環糊精修飾聚陽離子/二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物粉末；
6)配置濃度為0.05 I mg/mL的P -環糊精修飾聚陽離子/ 二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物溶液；
7)配置濃度為75 100l^g/mL的DNA溶液；
8)將步驟6)溶液加入到等體積步驟7)溶液中，漩渦混合并靜置30min,獲得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。所述的0 -環糊精修飾聚陽離子包括^ -環糊精修飾聚乙烯亞胺、0 -環糊精修飾聚賴氨酸或3 -環糊精修飾殼聚糖。所述的疏水藥物包括阿霉素或紫杉醇。
實施例I :
配置濃度為4 mg/mL的P -環糊精修飾聚乙烯亞胺(PEI-g-⑶)溶液和濃度為4 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按PEI-g-⑶中P -⑶與PEG-Fc的摩爾比為2:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亞砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶與DOX的摩爾比為I: I的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h 24 h，凍干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。按上述制備的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末，采用紫外-可見光分光光度計(UV)測定阿霉素(DOX)的載藥量和包封率，測得載藥量為9%，包封率為57%，說明3 -環糊精修飾聚乙烯亞胺可以有效包合疏水藥物DOX。配置濃度為0. 5 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和濃度為 75 l^g/mL 的 p53(抗癌基因)溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液與250ML DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min，制備得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。按上述制備的基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子，利用動態光散射(DLS)和透射電鏡(TEM)研究共負載納米粒子 在生理鹽濃度下的穩定性，結果見圖I、圖2。圖I為共負載納米粒子與PEI-g-⑶/DOX/ DNA組裝體在生理鹽溶液中放置不同時間的粒徑的變化情況，圖2為共負載PEG化納米粒子在生理鹽溶液放置Ih后的透射電鏡照片。實驗結果表明共負載PEG化納米粒子在生理鹽溶液中較少聚集，穩定性較好。采用電位分析儀研究上述制備的基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的表面電位，由于PEG鏈段的屏蔽作用和體積排斥作用，組裝體的;-電位顯著降低，見圖3。實施例2:
配置濃度為2 mg/mL的P -環糊精修飾聚賴氨酸(PLL-g-⑶)溶液和濃度為2 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按PLL-g-⑶中￠-⑶與PEG-Fc的摩爾比為3:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL紫杉醇(PTX)氯仿溶液滴加到上述的混合溶液中，使PLL-g-⑶中⑶與PTX的摩爾比為1:2的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h^24 h，凍干，得到PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX包合物粉末。配置濃度為0. 5 mg/mL的PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液和濃度為75 l^g/mL的pl6 (多腫瘤抑制因子I基因)溶液。取上述的PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液與250 ML DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min，制備得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。實施例3
配置濃度為0. 5 mg/mL的P -環糊精修飾殼聚糖(CS-g-⑶)溶液和濃度為I mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按CS-g-⑶中P -⑶與PEG-Fc的摩爾比為4:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL紫杉醇(PTX)氯仿溶液滴加到上述的混合溶液中，使CS-g-⑶中⑶與PTX的摩爾比為1:4的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h^24 h，凍干，得到CS-g-CD/PEG-Fc/PTX包合物粉末。配置濃度為0. 5 mg/mL的CS-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液和濃度為75 l^g/mL的p53溶液。取上述的CS-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液與250 MLDNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min，制備得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。實施例4:
配置濃度為I mg/mL的￠-環糊精修飾聚乙烯亞胺(PEI-g-⑶)溶液和濃度為0.5 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按PEI-g-⑶中P -⑶與PEG-Fc的摩爾比為3:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亞砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶與DOX的摩爾比為1:3的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h 24 h，凍干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。配置濃度為I mg/mL的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液和濃度為100 l^g/mL的pORF_hTRAIL (腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體質粒)溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液與3. 75 mL DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min,制備得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。
按上述制備的基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子，運用紫外-可見光分光光度計(UV)測定阿霉素(DOX)的釋放曲線。將5 mL實施例4制備的共負載納米粒子溶液加入到截留分子量為3500 Da的透析袋中，將透析袋置于10 mL PBS溶液中，然后于37°C恒溫水浴、搖床震蕩下透析。每隔一段時間，取出I mL透析液，并加入I mL新鮮的PBS溶液。通過檢測釋放溶液中DOX的紫外吸收值來計算DOX的釋放量，結果如圖4所示。實施例5:
配置濃度為I mg/mL的￠-環糊精修飾聚乙烯亞胺(PEI-g-⑶)溶液和濃度為2 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。將兩種溶液按PEI-g-⑶中P -⑶與PEG-Fc的摩爾比為2:1的比例混合，超聲30 min后靜置待用。將2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亞砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶與DOX的摩爾比為1:4的比例，避光攪拌24 h，再透析8 h 24 h，凍干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。按上述制備的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末，采用紫外-可見光分光光度計(UV)測定阿霉素(DOX)的載藥量和包封率，測得載藥量為5. 6%，包封率為48%。配置濃度為0. 05 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和濃度為 100 l^g/mL 的含P53 (抗癌基因)的DNA溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液與24 ML DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min,制備得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。配置濃度為0. 05 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和濃度為 100 l^g/mL 的含PEGFP (綠色熒光蛋白質粒，不含抗癌基因)的DNA溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液與24 m DNA溶液等體積漩渦混合并靜置30 min，制備得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。按上述制備的基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子，采用MTT法，利用酶標儀進行細胞毒性動力學實驗。將本發明實施例5制備的含兩種不同質粒的基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子分別置于人肝癌細胞H印G2細胞中孵育48 h、72 h、96 h、144 h，然后于細胞培養液中加入5 mg/mL四唑鹽(MTT)溶液，繼續培養4 h，吸去原培養液，每孔加入200U LDMSO溶解結晶，最后于570 nm處用酶標儀測定每孔OD值，并算出不同濃度下的細胞活性。由結果可知，含有p53抗癌基因的共負載PEG化納米粒子比不含抗癌基因共負載PEG化納米粒子毒性大，說明P53抗癌基因與阿霉素共同作用，逐漸殺死HepG2細胞。
權利要求
1.一種基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的制備方法，其特征在于它的步驟如下 1)配置濃度為0.5 4 mg/mL的P -環糊精修飾聚陽離子溶液； 2)配置濃度為0.5 4 mg/mL的二茂鐵修飾聚乙二醇溶液； 3)將步驟I)和步驟2)溶液混合，使P-環糊精與二茂鐵的摩爾比為4:1 2:1，超聲30 min后靜直； 4)配置濃度為2mg/mL的疏水藥物溶液； 5)將步驟4)制備的疏水藥物溶液滴加到步驟3)溶液中，使3-環糊精與疏水藥物的摩爾比為1:1 1:4，避光攪拌24 h，透析8 24h，凍干，得到￠-環糊精修飾聚陽離子/二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物粉末； 6)配置濃度為0.05 I mg/mL的P -環糊精修飾聚陽離子/ 二茂鐵修飾聚乙二醇/疏水藥物包合物溶液； 7)配置濃度為75 100l^g/mL的DNA溶液； 8)將步驟6)溶液加入到等體積步驟7)溶液中，漩渦混合并靜置30min，獲得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。
2.根據權利要求I所述的一種基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的制備方法，其特征在于所述的P -環糊精修飾聚陽離子包括^ -環糊精修飾聚乙烯亞胺、P -環糊精修飾聚賴氨酸或3-環糊精修飾殼聚糖。
3.根據權利要求I所述的一種基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的制備方法，其特征在于所述的疏水藥物包括阿霉素或紫杉醇。
全文摘要
本發明公開了一種基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子的制備方法。它的步驟如下1)配置β-環糊精修飾聚陽離子溶液；2)配置二茂鐵修飾聚乙二醇溶液；3)將步驟1)和步驟2)溶液混合，超聲后靜置；4)配置疏水藥物溶液；5)將步驟4)制備的疏水藥物溶液滴加到步驟3)溶液中，避光攪拌，透析，凍干，得到包合物粉末；6)配置包合物溶液；7)配置DNA溶液；8)將步驟6)溶液加入到等體積步驟7)溶液中，漩渦混合并靜置，獲得基因和疏水藥物共負載PEG化納米粒子。本發明通過主客體作用制備基因和疏水藥物共負載的PEG化納米粒子，制備方法簡單易操作，顯著提高了基因和疏水藥物共負載納米粒子在生理鹽溶液中的穩定性。
文檔編號A61K31/337GK102697732SQ20121015349
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者唐三, 李文宇, 王幽香, 陳麗娜 申請人:浙江大學