專利名稱：腫瘤化療藥物敏感基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種對腫瘤細胞化療藥物敏感性具有決定作用的基因及應用，特別是涉及將該基因作為靶目標進行檢測以預測病人對化療藥物是否敏感、以及誘導或提高該基因在病人體內的表達以達到增強病人的化療效 果。
背景技術：
癌癥的主要治療手段為手術切除、放射治療、化學藥物治療和免疫學治療等。其中化學藥物治療-既化療是腫瘤的全身治療方法，應用較廣，已成為惡性腫瘤治療的主要手段，尤其是對于血液腫瘤，如白血病，淋巴瘤及骨髓瘤，以及中、晚期癌癥的治療。但腫瘤化療藥物存在很大的毒副作用并且極易產生耐藥性，極大地限制了化療的使用以及治療效果。目前雖然有多種化療藥物可供醫生選擇，但由于無法在治療前判斷不同腫瘤患者對藥物的敏感性和耐藥性，因此臨床醫生主要根據經驗對患者進行治療，故具有相當的盲目性。 不恰當的藥物治療不僅使患者正常機體細胞和免疫系統遭到破壞，使患者遭受治療的痛苦，更主要的是還可誘導腫瘤細胞產生對多種藥物的聯合耐藥性，稱之為多藥耐藥性，從而導致化療的失敗，使患者失去了治療的機會，也使患者造成了沉重的經濟損失。如前所述，腫瘤細胞耐藥性的產生是腫瘤化療失敗的主要原因。特別是對于嚴重依賴化療為主要治療手段的血液腫瘤(包括骨髓瘤)來講，解決耐藥性產生的原因、找到決定化療敏感性的基因是一個迫切且意義重大的課題。以多發性骨髓瘤為例，在過去十年中，多發性骨髓瘤已成為血液腫瘤中應用實驗研究成果而成功地取得了治療效果的典范。在國際上，已有4種治療骨髓瘤的新藥相繼獲得上市，包括萬珂(Velcade)、沙利度胺 (Thalidomide)、聚乙二醇脂質體阿霉素(pegylated liposomaldoxorubicin)，以及雷納立多胺(lenalidomide)。那些新藥起初被用在復發性或者難見效的多發性骨髓瘤患者身上， 現在也廣泛應用在初患病人身上，并顯示出明顯的治療效果。然而，盡管取得了上述令人鼓舞人心的進展，骨髓瘤仍然無法治愈，而且實際上所有病人都將復發此惡性疾病，并表現出對化療的更大抗性。更重要的是，即使在初期用藥表現出治療效果的時候，實際上對特定化療藥物有反應性的病人比例也是有限的，比如說臨床觀察發現治療效果最好的萬珂也僅對 41%的多發性骨髓瘤患者有完全反應性(CR)和部分反應性(PR)萬珂與而聚乙二醇脂質體阿霉素聯合治療也只表現出 44%的CR和ra。傳統的化療藥物則效果更差，僅為 4%的CR。這里就帶來一個很大的問題，那就是如果臨床上對病人進行化療時藥物選擇出現錯誤，必將錯過病人的最佳治療時機，也會加重病人的經濟負擔。因此，對腫瘤耐藥性發生的機制研究就成為了癌癥生物學領域的研究熱點。仍以骨髓瘤為例子，多發性骨髓瘤是一種惡性漿細胞瘤，主要發生在骨髓中，占血液腫瘤的大約 10%，是僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二惡性血液腫瘤。過去十年來，大量的努力已被用于探索骨髓瘤化療耐藥性的分子機理，其中一個主要機制被認為是歸功于骨髓瘤細胞與細胞外基質和基質細胞的黏附特性，例如由integrin β 1介導的細胞黏附抑制藥物誘導的骨髓瘤細胞的細胞凋亡。最近的研究表明Wnt3對VLA-6(integrin α 6/β 1)介導的由細胞黏附引起的藥物耐藥性(CAM-DR)起重要作用，這種抑制是通過骨髓瘤細胞的自分泌方式經過Wnt/RhoA/ROCK信號通路來實現的。另外，通過integrins與其配體的相互作用，抗細胞凋亡bcl-2家族的成員以及多藥耐藥性基因-1的表達被誘導起來，從而使得腫瘤細胞對化療藥物失去了應答。盡管上述研究進展令人鼓舞，現在仍不清楚對腫瘤耐藥性發生中的關鍵因子是什么，特別是那些將來可作為新的治療靶目標的基因，它們的表達可以顯著改善病人的治療，并可用于預測腫瘤病人的化療效果。國內外 對藥物敏感基因的研究和產品開發還處于探索階段。近年來，由于RNA干擾技術及其文庫的問世，使尋找化療藥物敏感基因組成為可能。但有關利用RNA干擾技術系統、大規模篩選腫瘤化療藥物敏感基因組，在國內外還尚未見報道。我們利用RNA干擾文庫，首次在國際上篩選出了 34個對阿霉素、順鉬、萬珂等一系列化療藥物敏感的基因，經過進一步的驗證，確定了其中TJPl基因的表達是病人對多種化療藥物是否敏感的關鍵因子。 TJPl是一種緊密連接蛋白，主要表達在細胞表面與其它細胞的聯結處。在我們的前期工作中，我們發現靶向抑制TJPl的表達導致Hela細胞對阿霉素、順鉬、甲氨蝶呤的耐藥性，意味著TJPl的表達可以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。由于血液惡性腫瘤的主要治療手段嚴重依賴化療，而病人對藥物的耐藥性是導致治療失敗的主要原因，尤其是骨髓瘤病人， 會在初期治療后表現出更嚴重的反復、更強的耐藥性、以及更惡性的發病程度，使得骨髓瘤是至今仍無法治愈的不治之癥。因此我們對264例骨髓瘤臨床病人的樣本進行了基因表達譜分析，發現TJPl的表達與病人對萬珂的治療應答密切相關。在我們建立的萬珂耐藥細胞株RPMI 8226/BR中，定量PCR檢測發現TJPl的表達完全丟失。而我們對萬珂敏感的骨髓瘤細胞系進行TJPl靶向沉默，可以誘導其耐藥性的產生，充分證明TJPl與骨髓瘤細胞的化療敏感性相關，病人體內TJPl表達的缺失會導致病人對包括萬珂、阿霉素、和順鉬在內的化療藥物產生耐藥性。
發明內容
本發明的目的是提供一種腫瘤化療藥物敏感基因。本發明的另一個目的是提供一種預測腫瘤化療效果的方法。本發明的再一個目的是提供一種提高腫瘤化療敏感度的方法。本發明的再一個目的是提供上述基因在預測腫瘤化療效果、提高腫瘤化療敏感度、制備腫瘤治療藥物中的應用。本發明所提供的基因命名為TJPl (tightjunction protein 1)，或者 Z0-1 (zona occludens-1)，是具有下列mRNA或者氨基酸序列的基因及其所編碼的蛋白質序列表中SEQ ID#1序列表中的SEQ ID#2序列表中的SEQ ID#3序列表中的SEQ ID#4序列表中SEQ ID#1的序列由7165個堿基組成；序列表中SEQ ID#2的序列由1748 個氨基酸組成；SEQ ID#3的序列由6925個堿基組成；序列表中SEQ ID#4的序列由1668個
氨基酸組成。本發明提供了一種決定腫瘤化療藥物敏感性的基因，腫瘤化療藥物包括所有對腫瘤細胞具有殺傷作用的化學藥物。本發明提供了應用TJPl基因來預測腫瘤化療效果的方法。當病人體內有TJPl表達時，病人對化療藥物具有敏感性；當病人體內TJPl表達缺失時，病人表現出對化療藥物的 耐藥性。本發明還提供了一種通過提高或誘導TJPl的表達來改進化療效果的方法。這種方法包括外源TJPl基因引入病人體內的表達，也包括將各類化學或生物分子引入體內誘導病人天然TJPl的表達。本發明將有助于開發出針對TJP1/Z0-1表達的診斷試劑盒，以預測病人對化療的治療效果；也有助于抗癌藥物的篩選來尋找誘導TJP1/Z0-1表達的化學和生物分子，最終達到使患者減少化療次數，增加治愈率，減輕化療藥物的毒副作用，使患者節約醫療費用， 產生顯著的經濟和社會效益。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的描述圖1、圖2為TJPl的表達與骨髓瘤患者在萬珂治療后的效果呈正相關關系
，其中NR 無效組，R 有效組；圖3為TJPl在骨髓瘤細胞系中的表達圖譜分析；圖4、圖5為骨髓瘤細胞對阿霉素和順鉬的半致死量與TJPl的表達負相關；圖6為TJPl在萬珂耐藥性RPMI 8226細胞中的表達，RPMI 8226野生型和耐藥型細胞在不同萬珂濃度作用下的生長曲線；圖7為TJPl在萬珂耐藥性RPMI 8226細胞中的表達，IOnM萬珂處理細胞24小時后的細胞凋亡測定圖8為TJPl在萬珂耐藥性RPMI 8226細胞中的表達，定量PCR測定TJPlmRNA的表達。圖9、圖10、圖11為靶向抑制TJPl表達后導致Hela細胞對阿霉素、順鉬、和甲氨蝶呤的抗性；圖12 為 TJPl shRNA (shT2)有效抑制了 TJPl 的表達；圖13為TJPl表達抑制消除了 RPMI 8226細胞對萬珂Gl期停滯效應的應答；圖14為TJPl表達抑制導致耐藥性產生，使萬珂失去對細胞增殖的抑制作用。
具體實施例方式實施例一TJPl基因表達與腫瘤病人化療效果的相關性分析。通過我們建立的高通量、大規模RNA干擾文庫篩選工作，我們篩選出TJPl為潛在的化療藥物敏感基因。如果TJPl決定了腫瘤病人對化療藥物的敏感性，那么TJPl表達陽性的病人對化療藥物就應有反應，否則就表現為對化療藥物不敏感。為此，我們進行了基因圖譜表達分析，以確定是否TJPl基因表達與病人的治療效果有顯著相關性。我們采用的基
自 Bl Multiple Myeloma Genomics Portal (http: //www. broad, mit. edu/mmgp/pages/publicPortalHome. jsf)，胃巾 Millermium人經萬珂或者地塞米松治療后的基因表達芯片數據，以及每一病人對藥物治療的效果。進行分析時，我們首先對病人進行分類，共分為兩大類，即126例無效組，113例有效或部分有效組(統稱為有效組)。另有25例病人的基因芯片數據噪音過大，沒有加入統計分析。我們應用雙樣品t-test的方法比較34個基因是否在無效組和有效組中有顯著差異表達，并使用BUM來獲取錯誤發現率(FDR)。經過分析，我們發現化療藥物對TJPl基因表達的病人有治療效果，而對不表達TJPl的病人則無效(參考圖1、圖2，其中NR 無效組，R 有效組)。實施例二 定量確定TJPl基因在腫瘤細胞中的表達。定量PCR被用來確定TJPl在腫瘤細胞中的表達水平。采用QIAGENRNeasy試劑盒 (產品目錄號74104)從腫瘤細胞制備總RNA，制備步驟嚴格按照產品說明書執行。其中，組織和細胞的勻漿采用QIAGEN的QIAshredder (產品目錄號79654)來進行。應用分光光度法測定所制備的RNA濃度和質量，取1 μ g RNA進行eDNA合成。cDNA 合成試劑盒米用 Invitrogen 公司的 SuperScript IIIFirst-Strand Synthesis Super Mix(產品目錄號18080-400)進行，合成步驟嚴格按照產品說明書執行。進行定量PCR反應時，將所合成的cDNA用無核酸酶去離子水作5倍稀釋，取1 μ 1 稀釋的 cDNA 于 0. 2ml MicroAmp Optical 反應管中，加入 1 μ 1 TJPlTaciMan 探針、 10 μ 1 TaqMan Gene Expression Master Mix、以及 8 μ 1 無核酸酶去離子水。GAPDH 基因被作為對照物同時進行定量PCR反應。反應被置于Applied Biosystems的7900HT Fast Real-Time PCR System 中進行。我們應用此建立的定量PCR方法對11個代表性骨髓瘤細胞株中TJPl的表達進行了測定，我們發現有三個細胞株(ARP-1，INA6, and M0LP-8)缺失TJPl的表達，有一個細胞株只表達極低的 TJPl (0PM-2)，其余 7 個細胞株(ANBL6，ARK, H929，KAS-6/1，RPMI 8226， MMl. s，and U266)有不同程度的TJPl表達(如圖3所示)。實施例三TJPl基因表達與腫瘤細胞化療藥物半致死劑量(IC50)顯著相關。我們對具有代表性的M0LP-8 (無TJPl表達)和MMl. s (TJP1高表達)細胞系進行 IC50比較，實驗的具體內容驟是WST-1 (購自RocheDiagnostics公司)被用來確定阿霉素和順鉬對細胞增殖的影響，從而獲得IC50數據。細胞以2x104/培養孔的密度接種于96孔培養板中，24小時后分別暴露在不同濃度的阿霉素和順鉬中，對照細胞用不含藥物的溶劑處理。48小時后，細胞增殖用WST-I測定，測定方法按產品說明書嚴格執行。結果發現TJPl 表達的匪1. s細胞對阿霉素和順鉬的IC50(分別為38. 2nM和13nM)均顯著低于M0LP-8 (分別為112nM和70. 2nM)(參考圖4、圖5)，證明TJPl的表達與腫瘤細胞對藥物的敏感性密切相關。實施例四TJPl的表達在骨髓瘤萬珂耐藥細胞株中被丟失。由于萬珂是骨髓瘤病人的主要化療藥物，而我們的基因圖譜分析也顯示TJPl的表達與萬珂的治療效果密切相關。因此，我們決定采取進行下一步的實驗以獲取更直接的證據。我們對TJPl表達陽性的萬珂敏感型骨髓瘤細胞株RPMI 8226進行藥物篩選實驗，即在較低濃度萬珂(5nM)的長期培養下(3月)，篩選出對萬珂產生耐藥性的新型細胞株RPMI8226/BR，該細胞株表現出對萬珂抗腫瘤生長活性的明顯抗性，并可以在較高濃度(50nM) 的萬珂存在下繼續存活(參考圖6、圖7)。之后，我們應用定量PCR檢測了 TJPl的表達，結果發現TJPl的表達在RPMI 8226/BR中完全丟失，強烈意味著TJPl可能在RPMI 8226/BR 對萬珂產生抗性的作用中發揮重要的作用(圖8)。實施例五TJPl在化療增敏中的作用。雖然上述實驗結果令人鼓舞，但我們仍需要直接證據來證明TJPl的確可以起到化療增敏的作用。因此，我們首先對TJPl表達沉默的Hela細胞(HeLa/TJPl-knockdown 細胞)進行了化療藥物敏感測定試驗。阿霉素、順鉬、以及甲氨蝶呤被分別用于對HeLa/ TJPl-knockdown細胞進行處理，結果發現與非靶向對照組相比，HeLa/TJPl-knockdown細胞表現出了對上述藥物的抗藥性(參考圖9、圖10、圖11)，表明TJPl代表者一個新型的多藥物敏感性基因。實施例六由于RNA干擾中可能存在非特異假陽性以及脫靶效應(off-targeteffect)，并為了更進一步驗證TJPl在化療增敏中的作用，我們選用了另外5個新的SiRNA序列(分別稱作:shTl, shT2，shT3，shT4，和shT5)的慢病毒對RPMI 8226中的TJPl表達進行了基因沉默試驗。上述慢病毒購自美國Sigma公司。RPMI 8226細胞被分別感染慢病毒，對照細胞感染非特異靶向病毒。感染24小時后，1500轉/分鐘離心細胞，丟棄舊培養液，換成新鮮培養液，24小時后用含有1 μ g/ml嘌呤霉素的培養液培養10天，其中每兩天換一次培養液。最后用定量PCR檢測TJPl基因的表達，結果發現其中一個siRNA序列(shT2)可以有效抑制 > 75% TJPl的表達(參考圖12)。然后，我們對非靶向(shN)、shT2、以及shT4細胞的細胞周期進行了分析。細胞用 70%乙醇固定過夜，經磷酸緩沖液清洗后，在50 μ g/ml的碘化丙啶(Propidium Iodide)和 RNaseA (20 μ g/ml)中于37C處理20分鐘，然后在細胞流式儀上進行細胞周期分析。結果發現shN和sh4(無TJPl表達抑制)細胞在萬珂和順鉬處理后具有相似的細胞周期圖譜，其 Gl期細胞明顯增加；而sh2細胞則表現出可以忽略不計的Gl期變化(參考圖13)。我們還同時對細胞的增值進行了 WST-I檢測，與細胞周期數據相一致，sh2細胞增殖沒有受到化療藥物的明顯影響(參考圖14)。上述結果強烈證明TJPl的表達抑制會導致細胞對化療藥物的耐藥性。應當指出，對于經充分說明的本發明來說，還可具有多種變換及改型的實施方案， 并不局限于上述實施方式的具體實施例。上述實施例僅僅作為本發明的說明，而不是限制。 總之，本發明的保護范圍應包括那些對于本領域普通技術人員來說顯而易見的變換或替代以及改型。
權利要求
1.一種腫瘤化療藥物敏感基因，該基因是TJPl基因。
2.一種對腫瘤細胞具有增強化療藥物藥效的基因及其編碼蛋白，該基因是TJPl基因。
3.一種預測腫瘤化療效果的方法，其特征在于所述方法包括將TJPl基因作為檢測的靶目標，當病人體內有TJPl表達時，病人對化療藥物具有敏感性；當病人體內TJPl表達缺失時，病人表現出對化療藥物的耐藥性。
4.一種提高腫瘤化療敏感度的方法，其特征在于所述方法包括將TJPl基因作為靶目標，誘導和/或提高天然的TJPl基因的表達，以提高化療敏感度。
5.權利要求1所述的TJPl基因在預測腫瘤化療效果中作為檢測靶目標的應用。
6.權利要求1所述的TJPl基因作為提高腫瘤化療敏感度的靶目標的應用。
7.權利要求1所述的TJPl基因在制備腫瘤治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種對腫瘤細胞化療藥物敏感性具有決定作用的基因，該基因命名為TJP1或ZO-1。本發明還公開了應用該基因來預測腫瘤化療效果的方法，當病人體內有TJP1表達時，病人對化療藥物具有敏感性；當病人體內TJP1表達缺失時，病人表現出對化療藥物的耐藥性。本發明還公開一種通過提高或誘導TJP1的表達來改進化療效果的方法，及該基因在預測腫瘤化療效果、提高腫瘤化療敏感度、制備腫瘤治療藥物中的應用。本發明將有助于開發針對TJP1/ZO-1表達的診斷試劑盒，以預測病人對化療的治療效果；也有助于抗癌藥物的篩選來尋找誘導TJP1/ZO-1表達的化學和生物分子，最終達到使患者減少化療次數，增加治愈率，減輕化療藥物毒副作用，節約患者醫療費用，產生顯著經濟和社會效益。
文檔編號C12Q1/68GK102220336SQ20101014861
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月14日 優先權日2010年4月14日
發明者吳小軍, 楊文榮, 楊林, 楊楠, 錢建飛, 黃行許 申請人:吳小軍, 楊林, 黃行許