專利名稱：雙水相萃取分離黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法
技術領域：
本發明屬于天然產物有效成分的分離純化領域，涉及一種雙水相萃取分離黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法。
背景技術：
黃苗為豆科植物蒙古黃苗(Astragalus mem branaceus)或膜莢黃苗(Astragalusmembranaceus)的干燥根，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效。黃苗中的主要有效成分為黃酮類、皂苷類和多糖。其中黃酮類化合物主要包括芒柄花素(formononetin)、芒柄花苷(ononion)、毛蕊異黃酮(calycosin )及其糖苷等。研究證實黃芪總黃酮具有清除02_ 和OH- 防止生物膜過氧化的作用，也能顯著抑制OH- 對DNA的損傷作用，是黃芪抗氧化作用的主要成分，表現為顯著的抗肝臟毒性、抗炎、抗菌及保護心血管系統的作用。黃芪總皂苷在免疫調節、心肌缺血保護等方面有顯著活性，其藥理作用廣泛，包括抗病毒、保肝、抑瘤、改善心臟功能、抗炎鎮痛、抑制滑膜成纖維細胞增殖等。近年來，由于雙水相萃取技術具有高效、溫和、操作簡便、容易放大和能有效保持生物活性等優點，被廣泛應用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領域。具體涉及到細胞、膜、病毒、蛋白質、核酸等生物產品以及其他天然藥物有效成分的分離和純化。但傳統的雙水相體系有原料成本較高，高聚物回收利用困難等缺點。隨著對雙水相技術研究的不斷深入，以無機鹽代替高聚物的普通有機物雙水相體系以其價廉、低毒、體系簡單、溶劑的回收利用及后續處理容易等優點，且由于體系組分極性較大，尤其適用于極性物質的提取和純化，使雙水相萃取的工業化成為可能。
發明內容
本發明的目的是為了克服上述現有技術存在的不足而提出一種雙水相萃取分離黃芪粗提物中黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法，其不但避免了有毒溶劑的使用，提高了黃芪中總黃酮的提取率，且能將粗提品中的黃酮與親水性皂苷和少量多糖進行分離，達到純化黃芪黃酮并分離皂苷的目的，且方法本身操作簡單經濟。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是雙水相萃取分離黃芪粗提物中黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法，其特征在于包括有以下步驟
1)固液浸提向黃芪藥材中加入溶劑，固液浸提，過濾除雜后靜置24-48小時，沉淀為多糖，濾液為黃芪粗提液；
2)雙水相萃取將步驟I)所得黃芪粗提液，濃縮至原體積的1/5，加入無水乙醇、磷酸氫二鉀和水，形成體系內乙醇/磷酸氫二鉀的雙水相系統，混勻，保持pH為6. 0-9. 0，靜止后分為上下兩相；
3)減壓蒸餾，真空干燥將步驟2)中所得含有大量黃芪總黃酮的乙醇上相，對其進行減壓蒸餾、真空干燥，得到黃芪總黃酮提取物，下相為富含黃芪皂苷的水相。按上述方案，在固液浸提中，所述的溶劑體積分數為50-90%，黃芪藥材與溶劑固液比為Ig 5ml- I g 30 ml，加熱回流提取3次，每次I小時，將提取液合并得到黃芪粗提液。按上述方案，步驟I)所述溶劑為甲醇、乙醇和水中的任意一種或者它們的混合。按上述方案，步驟2)所述的無水乙醇加入的質量分數為體系的22%_40%，所述的磷酸氫二鉀加入的質量分數為體系的15%-22%。按上述方案，步驟2)所述的雙水相萃取中靜止分相溫度為8_80°C，分相時間為10分鐘。按上述方案，在減壓蒸餾，真空干燥中，減壓蒸餾的溫度為50-80°C。本發明的反應原理當能與水混溶的普通的有機溶劑，如乙醇、異丙醇、丙酮等，力口入到某些電解質水溶液中，利用鹽離子的水化作用，使鹽離子奪取原來與有機溶劑水合的水分子而釋放出有機溶劑分子，可形成有機溶劑/無機鹽雙水相體系。當生物物質或天然 產物中的有效成分進入雙水相體系時，由于表面性質、電荷作用和各種力(憎水鍵、氫鍵和離子鍵)的存在和環境因素(濃度、溫度、PH值以及離子的種類和強度等)的影響，生物物質或天然產物中的有效成分易在兩相間形成選擇性的分配。利用這一點，可以實現生物物質和天然產物中有效成分的提取、濃縮和分離。與已有技術相比，本發明的優點在于
1)分相迅速，回收率高
在實驗中觀察到，采用雙水相萃取法，約10分鐘即可分相，并且沒有乳化層，縮短了實驗周期，且回收率高；
2)過程集成
雙水相萃取既達到了純化的目的，又濃縮了料液，濃縮倍數達到4倍以上；
3)避免了有毒溶劑正丁醇的使用，采用低毒的無水乙醇，利用環保且節約試劑；
4)界面張力小，有助于兩相之間的質量傳遞；
5)黃芪黃酮在體系中的分配系數K為10.33，萃取率Y高達96. 6%，同時對該體系萃余后上下相中黃芪皂苷和多糖含量進行測定，上相中黃芪皂苷去除率達到92. 01% ;黃芪多糖全部富集在下相水相，即去除率高達100%，這有利于黃芪粗提取液中總黃酮的分離和純化；
6)易于工藝放大和連續操作，與后續純化工序可直接相連，無需進行特殊處理。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實施例I :
(1)固液浸提
取粉碎的黃芪藥材I. 0 g，精密稱定，在70°C水浴中用20 mL體積分數為60%乙醇加熱回流提取lh，重復3次后過濾，合并濾液，靜置24小時后，過濾得沉淀為多糖，濾液即為黃芪粗提液；
(2)雙水相萃取
取上述黃芪粗提液，濃縮至原體積的1/5，加入磷酸氫二鉀、乙醇和水組成雙水相系統，使其中無水乙醇占體系質量分數為25%,磷酸氫二鉀占體系質量分數為16%,混勻，保持pH為6. 8，室溫下放置10分鐘，靜置分相，其中總黃酮在乙醇上相的收率為86. 8%，皂苷在下相中的收率為89. 2%。(3)濃縮萃取液
取出乙醇上相，置于70°C減壓蒸餾，真空干燥后得到黃芪總黃酮提取物。
利用紫外分光光度法測定雙水相萃取體系中黃芪總黃酮和總皂苷的濃度，按下列公式進行計算
相比計算公式
權利要求
1.雙水相萃取分離黃芪粗提物中黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法，其特征在于包括有以下步驟 1)固液浸提向黃芪藥材中加入溶劑，固液浸提，過濾除雜后靜置24-48小時，沉淀為多糖，濾液為黃芪粗提液； 2)雙水相萃取將步驟I)所得黃芪粗提液，濃縮至原體積的1/5，加入無水乙醇、磷酸氫二鉀和水，形成體系內乙醇/磷酸氫二鉀的雙水相系統，混勻，保持pH為6. 0-9. 0，靜止后分為上下兩相； 3)減壓蒸餾，真空干燥將步驟2)中所得含有大量黃芪總黃酮的乙醇上相，對其進行減壓蒸餾、真空干燥，得到黃芪總黃酮提取物，下相為富含黃芪皂苷的水相。
2.根據權利要求I所述的雙水相萃取分離黃芪粗提物中黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法，其特征在于在固液浸提中，所述的溶劑體積分數為50-90%，黃芪藥材與溶劑固液比為Ig 5ml- I g 30 ml，加熱回流提取3次，每次I小時，將提取液合并得到黃芪粗提液。
3.根據權利要求I或2所述的雙水相萃取分離黃芪粗提物中黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法，其特征在于步驟I)所述溶劑為甲醇、乙醇和水中的任意一種或者它們的混合。
4.根據權利要求I所述的雙水相萃取分離黃芪粗提物中黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法，其特征在于步驟2)所述的無水乙醇加入的質量分數為體系的22%-40%，所述的磷酸氫二鉀加入的質量分數為體系的15%-22%。
5.根據權利要求I所述的雙水相萃取分離黃芪粗提物中黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法，其特征在于步驟2)所述的雙水相萃取中靜止分相溫度為8-80°C，分相時間為10分鐘。
6.根據權利要求I所述的雙水相萃取分離黃芪粗提物中黃芪黃酮、皂苷和多糖的方法，其特征在于在減壓蒸餾，真空干燥中，減壓蒸餾的溫度為50-80°C。
全文摘要
本發明涉及一種雙水相分離黃芪中總黃酮、皂苷和多糖的方法，將黃芪藥材粉碎，加入溶劑，固液浸提，過濾除雜后得到黃芪總黃酮和皂苷粗提液，取上述黃芪粗提液，濃縮，加入無水乙醇/磷酸氫二鉀形成的雙水相系統，加水使系統總量為一定值，混勻，靜置后分為上下兩相；取出含有大量黃芪總黃酮和皂苷的乙醇相，對其進行減壓濃縮，得到黃芪總黃酮提取物。本發明的有益效果是提高了黃芪總黃酮、總皂苷的萃取率，同時能與粗提物中的黃芪多糖進行分離，所使用的溶劑低毒，有利于環保，同時生產成本低，不引起黃芪黃酮、皂苷的失活或變性、分相時間短、界面張力小、不存在有機溶劑的殘留。
文檔編號A61P31/12GK102697839SQ20121017821
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者余軍霞, 張越非, 徐志高, 池汝安, 肖春橋, 鐘玲 申請人:武漢工程大學