一種發酵黃芪的制備方法及其總皂苷的提取方法

一種發酵黃芪的制備方法及其總皂苷的提取方法
【專利摘要】本發明提供一種發酵黃芪的制備方法，是將黃芪用非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9，保藏編號CGMCC?No.4227的菌株發酵得到的；本發明還提供一種發酵黃芪總皂苷的提取方法，步驟如下:（1）將發酵黃芪用80%～90%乙醇溫浸提取，優選用85%乙醇溫浸提取；得到醇提發酵黃芪流浸膏；（2）將步驟（1）得到的醇提發酵黃芪流浸膏用水飽和正丁醇萃取，得提取液；（3）將提取液上樣于大孔吸附樹脂柱吸附，洗脫，收集洗脫液，將洗脫液進行后處理，得到純化后的發酵黃芪總皂苷。應用本發明的提取方法進一步提高了皂苷的純度，達到86%～92%。
【專利說明】一種發酵黃芪的制備方法及其總皂苷的提取方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程和醫藥【技術領域】，具體涉及發酵黃芪的制備方法及其總皂苷 的提取方法。

【背景技術】
[0002] 黃芪（Radix Astragalus)是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。味甘，性微 溫，具有益氣補虛之功效。黃芪總皂苷包括十幾種皂苷類物質，具有抗菌、消炎、抗腫瘤、降 血壓、抗心肌缺氧、中樞鎮痛、鎮靜等作用，是黃芪的主要的有效成分，其在生藥中的含量為 0.095 %?0.223 %。由于含量較低，因此，研究人員一方面不斷開發黃芪總皂苷的高效分 離提取技術，另一方面致力于通過生物轉化的方法合成具有生物活性的黃芪皂苷。
[0003] 微生物轉化是指通過微生物整體細胞或酶系將復雜的底物進行結構修飾，這種催 化反應具有條件溫和、反應專一、污染小等特點。建立合理的中藥微生物轉化工藝后，能夠 在得到收率較高的目標產物的同時，綜合利用藥物中的其它有效成分，大大節省原料，降低 生產成本，達到綜合利用中藥材有效成分的目的。常用的微生物轉化中藥有效成分的方法 有液體發酵法和固體發酵法。
[0004] 非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9 (保藏編號：CGMCC No. 4227)分泌的很多酶類可參與生 物轉化過程，但是，應用該菌發酵黃芪，黃芪中總皂苷的變化目前尚不清楚，對于應用該菌 發酵黃苗的阜苷的分離提取方法，尚未見有研究報道。
[0005] 保藏信息： 非解乳糖鏈球菌1^]\^：76]\19的拉丁文分類命名為5^-61/7(0〃0<^^/ >5<3^3<^0心^/<^/5·; 保藏日期：2010年10月19日； 保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心； 保藏單位簡稱：CGMCC ; 保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號； 保藏編號：CGMCC No. 4227。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是提出一種經濟、高效的發酵黃芪的制備方法及其總 皂苷的提取方法。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下： 本發明提供一種發酵黃芪的制備方法，步驟如下：將潔凈的黃芪生藥飲片粉碎后，發酵 黃芪，發酵菌株CGMCC No. 4227的菌液濃度為2 X 106?2 X 108個/mL，接菌量為4%?5%(占 發酵總體積)，黃芪用量為8% (黃芪質量：發酵液體積，g:mL)，溫度38°C?39°C，轉速200r/ min，pH值5. 5?6. 5,溶氧量5%?10%，中和劑為6mol/L的NaOH，發酵時間44h?52h， 發酵結束后，凍干發酵黃芪液得發酵黃芪產品；優選地，發酵菌株CGMCC No. 4227的菌液濃 度為2X 108個/mL，接菌量為5% (占發酵總體積)，黃芪用量為8% (黃芪質量：發酵液體積， g:mL)，溫度39°C，轉速200r/min，pH值6. 4,溶氧量10%，中和劑為6mol/L的NaOH，發酵時 間 48h。
[0008] 上述發酵條件是經正交試驗后得到的最佳值。
[0009] 本發明的制備方法具有以下優點： 本發明中的黃芪發酵工藝使用10L三聯發酵罐，生產操作簡便，反應條件容易控制(發 酵過程中能夠實現實時自動調節pH值、溶氧值，溫度、轉速等參數也能達到精確控制)，因而 發酵產品質量更穩定，批間差異小。同時，本方法工業化程度高，生產成本低，提高了原料的 利用率，增強了產品的市場競爭力。
[0010] 優選地，所述發酵黃芪過程中使用的液體培養基由以下重量份數的成分制備完 成：乳清粉：24?27份；蛋白胨：2. 2?2. 4份；葡萄糖：0. 5?0. 7份；酵母粉：1. 4?1. 7 份；硫酸鎂：〇. 03?0. 05份；檸檬酸三銨：0. 30?0. 50g ;硫酸氫二鉀：0. 30?0. 50g ;乙酸 鈉：0· 90?1. 10g ;黃芪粉：80?100份；水：900?1100份。
[0011] 實驗研究發現，發酵菌株CGMCC No. 4227的正常生長需要能源、碳源、氮源、礦質 元素、水和生長因子等，實驗室過去采用的培養基為"一種提取黃芪多糖的發酵培養基" (201210141832. 6)中所述的培養基，其中，無機鹽為磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，缺乏Na、Mg 等主要礦質元素及無機物銨鹽等氮源物質。本發明加入上述營養成分后，同時，對培養基組 分進行優化結合單因素實驗和響應面分析，得出培養基最佳組分及各組分比例，使用該培 養基發酵菌株CGMCC No. 4227的生長狀態明顯改善。
[0012] 更優選地，所述發酵黃芪過程中使用的液體培養基由以下重量份數的成分制備完 成：乳清粉：25. 79份；蛋白胨：2. 28份；葡萄糖：0. 60份；酵母粉：1. 56份；硫酸鎂：0. 04 份；梓檬酸三銨：〇. 40份；硫酸氫二鉀：0. 40份；乙酸鈉：1. 00份；黃芪粉：80份；水：1000 份。
[0013] 本發明還提供上述發酵黃芪作為飼料添加劑的應用。
[0014] 本發明的第三個目的是提供一種飼料添加劑，所述飼料添加劑的有效成分為權利 要求1所述的發酵黃芪。
[0015] 本發明的第四個目的是提供一種發酵黃芪總皂苷的提取方法，步驟如下： 1)將上述發酵黃芪用80%?90%乙醇溫浸提取，優選用85%乙醇溫浸提取，得到醇提發 酵黃芪流浸膏；優選地，所述流浸膏中lg流浸膏含0.9?1. lg生藥黃芪。
[0016] 2)將步驟（1)得到的醇提發酵黃芪流浸膏用水飽和正丁醇萃取，得提取液； 3)將提取液上樣于大孔吸附樹脂柱吸附，洗脫，收集洗脫液，將洗脫液進行后處理，得 到純化后的發酵黃芪總皂苷。
[0017] 優選地，所述溫浸提取是將發酵黃芪用80%?90%乙醇室溫下密閉浸泡6h?10h， 83°C?86°C溫浸lh?2h，過濾，濾渣再重復提取1次；優選地，所述溫浸提取是將發酵黃芪 用85%乙醇室溫下密閉浸泡8h，85°C溫浸lh，過濾，濾渣再重復提取1次。
[0018] 溫浸提取中選擇上述參數進行提取時，提取率最高。
[0019] 優選地，所述溫浸提取時每lg發酵黃芪用20ml 85%乙醇溫浸提取。
[0020] 該比例是單因素實驗優選出的，在上述條件下發酵黃芪流浸膏得率及其中總皂苷 含量最1?。
[0021] 優選地，步驟（2)中用水飽和正丁醇萃取時，沿同一方向勻速輕微振搖，待稍靜止 后，再反方向輕微振搖。
[0022] 優選地，步驟（3)中所述大孔吸附樹脂為AB-8或D101 ;優選為AB-8。
[0023] 優選地，步驟（3)中所述洗脫是先用30%乙醇洗脫，棄洗脫液；該極性段物質對大 孔樹脂吸附力較弱，不是總皂苷類，故棄去洗脫液；再用70%?90%%乙醇洗脫，收集洗脫液。 該極性段物質對大孔樹脂吸附力較強，為發酵黃芪總皂苷類，故收集洗脫液。優選地，所述 洗脫是先用30%乙醇洗脫，棄洗脫液；再用85%乙醇洗脫，收集洗脫液。
[0024] 進一步地，提取后洗脫液經濃縮干燥后，發酵黃芪總皂苷含量達78. 52%? 88.39%。
[0025] 本發明利用一株分離自雞腸道的非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9,保藏編號為：CGMCC No. 4227與中藥黃芪共發酵，開發出發酵黃芪產品。該產品作為飼料添加劑能夠增強肉仔雞 生長性能，提高免疫力。皂苷是發酵黃芪產品的主要藥效物質之一，研究報道，消化道中細 菌產生的酶選擇性地分解皂苷類成分，引起結構的轉變，使其分解為苷元和糖基。(如Kim等 人利用七葉苷-R2A篩選出70株表現出β -糖苷酶活性的菌株，其中12株能轉化Rbl為Rd， 哀中三株舊Burkholeria pyrrocinia GP16, Bacillus megaterium 私Sphingomonas ecAifloiofes GP50能在48小時內完全轉化。Dong等篩選了 49種微生物以考察對人參阜苷 Rgl的轉化，實驗發現黑曲霉AS3. 1858和藍色犁頭霉AS3. 3538能轉化Rgl為Rhl，轉化率 為80. 9%。）由于苷元的極性大大低于分解前的皂苷，所以更容易被腸道吸收進而進入血液， 發揮藥效作用。通過微生物轉化，有望提高有藥效作用的皂苷的含量，產生新的皂苷種類， 發現新的藥理活性。此外，生物轉化水解苷類還具有保護環境，降低生產成本等優勢，應用 于工業化生產，將對醫藥產業的發展做出貢獻。因此，發酵黃芪總皂苷顯示出較好的開發應 用前景。
[0026] 本發明還對發酵黃芪總皂苷提取分離的工藝進行了考察，采用香草醛-硫酸法， 以黃芪甲苷為標準品，檢測皂苷含量，得到了發酵黃芪總皂苷的最佳提取方法。同時，也為 其它液體發酵中藥皂苷的提取提供參考方法。
[0027] 本發明提取方法的效果和益處： 1、先用85%乙醇溫浸發酵黃芪得到醇溶部分提取總皂苷成分，藥渣用于提取其它有效 成分，利于發酵產品有效成分的充分開發和高效利用。
[0028] 2、將正丁醇法和大孔吸附樹脂法相結合，進一步提高了總皂苷的純度，達到86 % ?92 %〇
[0029] 3、經過正丁醇的純化，總皂苷的顏色已經很淺，且可回收正丁醇重復使用，省去了 大孔樹脂柱中用乙醚脫色的步驟，達到了節約資源的效果。
[0030] 4、本發明通過對大孔樹脂AB-8與D101的總皂苷的富集效果進行比較，發現AB-8 優于D101，具有總皂苷提取效率高、純度高等特點，并且填料可反復利用、資源浪費少、操作 簡便、易于推廣及擴大生產。

【具體實施方式】
[0031] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0032] 本發明中發酵黃芪總皂苷含量的測定采用香草醛-硫酸法，步驟如下： a、 標準曲線的制作：用無水乙醇溶解黃芪甲苷標準品，配制成濃度為0. 5 mg/mL的標 準品溶液。分別吸取〇. 15 mL、0. 3 mL、0. 45 mL、0. 6 mL、0. 75 mL至試管，補加無水乙醇至 0. 75 mL。隨行用0.75 mL無水乙醇做空白。精密加入8 %香草醛-無水乙醇溶液0.75 mL， 于冰浴中加入72 % H2S04 7.5 mL，搖勻，置于62 °C水浴中恒溫靜置20 min后取出。冰浴 冷卻至室溫，搖勻。30 min內于544 nm處測定吸光度，以黃芪甲苷濃度為橫坐標（X)，吸光 度值(A)為縱坐標（y)，進行線性回歸，繪制標準曲線。標準曲線方程為：y=l. 3326X+0. 0117 (R2=0. 9997)，其中：y為吸光度值，X為黃芪甲苷濃度（mg/mL)，R2為相關系數； b、 總皂苷含量測定：用無水乙醇將制得的發酵黃芪總皂苷配成濃度為0.5 mg/mL的溶 液，取0.75 mL按步驟a的方法測定544 nm的吸光度值，根據標準曲線計算發酵黃芪總皂 苷的濃度； c、 發酵黃芪總皂苷含量（％)=(標準曲線計算得皂苷質量/純化得到發酵黃芪皂苷質 量）X100% d、 發酵黃芪純化后總皂苷得率（％)=(純化得到總皂苷的質量/發酵黃芪產品的質 量）X100%。
[0033] 本發明所用的非解乳糖鏈球菌（Streptococcus alactolyticus)LZMYFGM9的保藏 編號為CGMCC No. 4227。該菌種的培養特性見中國專利201210141827.5 (發明名稱：一種 非解乳糖鏈球菌及其應用）。
[0034] 實施例1 本發明的發酵黃芪的制備方法為： 將潔凈的黃芪生藥飲片粉碎后，過20目篩，用10L發酵罐發酵黃芪，發酵菌株LZMYFGM9 的菌液濃度為2X 108個/mL，接菌量為5% (占發酵總體積)，黃芪用量為8% (黃芪質量：發酵 液體積，g:mL)，溫度39°C，轉速200r/min，pH值6. 4,溶氧量10%，中和劑為6mol/L的NaOH， 發酵時間48h。發酵結束后，凍干發酵黃芪液得發酵黃芪凍干粉。測得發酵黃芪中黃芪的質 量分數為78%，400g發酵黃芪凍干粉中含黃芪的質量為312g。
[0035] 發酵黃芪的液體培養基由以下重量份數的成分制備完成：乳清粉：25. 79份；蛋白 胨：2. 28份；葡萄糖：0. 60份；酵母粉：1. 56份；硫酸鎂：0. 04份；梓檬酸三銨：0. 40份；硫 酸氫二鉀：〇. 40份；乙酸鈉：1. 00份；黃芪粉：80份；水：1000份。
[0036] 將實施例1中發酵黃芪凍干粉按照1%的劑量添加于21日齡的肉雞飼料中飼 喂28天，試驗結束后發現發酵黃芪組肉仔雞的體重明顯高于空白對照組和生藥黃芪組 (P>0. 05)，經計算發酵黃芪組平均日增重達34. 25g/d ·只，空白對照組平均日增重達30. 15 30. 49g/d ·只，而生藥黃芪組只有26. 13g/d ·只；而將應用專利201210141832. 6中的發酵 培養基按照本發明的發酵方法發酵的產品作為對照組A，飼喂肉雞后，平均日增重為31. 69 g/d ·只。對發酵黃芪組實驗雞臟器剖檢未見任何病理變化，同時發酵黃芪組的心臟、肝臟、 腎臟指數與正常對照組相比差異不顯著（P>〇. 05)。檢測發酵黃芪組肉仔雞血液免疫球蛋白 水平，結果顯示，與空白對照組相比發酵黃芪組肉仔雞血液免疫球蛋白均有所增加，IgA含 量提高了 1.5%，IgM含量提高了 1.93 %，IgG提高了 1.88%。而對照組A與空白對照組相 比，IgA含量提高了 1. 3%，IgM含量提高了 1. 85%，IgG提高了 1. 73%。結果提示該發酵產品 作為飼料添加劑能夠增強肉仔雞生長性能，并能提高機體免疫力。
[0037] 實施例2 本發明的發酵黃芪的制備方法為： 將潔凈的黃芪生藥飲片粉碎后，過20目篩，用10L發酵罐發酵黃芪，發酵菌株LZMYFGM9 的菌液濃度為2X 106個/mL，接菌量為4%(占發酵總體積)，黃芪用量為8%(黃芪質量：發酵 液體積，g:mL)，溫度38°C，轉速200r/min，pH值5. 5,溶氧量5%，中和劑為6mol/L的NaOH， 發酵時間44h。發酵結束后，凍干發酵黃芪液得發酵黃芪凍干粉。測得發酵黃芪中黃芪的質 量分數為78%，400g發酵黃芪凍干粉中含黃芪的質量為312g。
[0038] 發酵黃芪的液體培養基由以下重量份數的成分制備完成：乳清粉：26. 35份；蛋白 胨：2. 20份；葡萄糖：0. 67份；酵母粉：1. 53份；硫酸鎂0. 05份；檸檬酸三銨0. 30份；硫酸 氫二鉀0. 50份；乙酸鈉0. 92份；黃芪粉：90份；水：900份。
[0039] 將實施例2中發酵黃芪凍干粉按照1%的劑量添加于21日齡的肉雞飼料中飼 喂28天，試驗結束后發現發酵黃芪組肉仔雞的體重明顯高于空白對照組和生藥黃芪組 (P>0. 05)。
[0040] 實施例3 本發明的發酵黃芪的制備方法為： 將潔凈的黃芪生藥飲片粉碎后，過20目篩，用10L發酵罐發酵黃芪，發酵菌株LZMYFGM9 的菌液濃度為2 X 107個/mL，接菌量為4. 5% (占發酵總體積)，黃芪用量為8% (黃芪質量： 發酵液體積，g:mL)，溫度39°C，轉速200r/min，pH值6. 0,溶氧量8%，中和劑為6mol/L的 NaOH，發酵時間52h。發酵結束后，凍干發酵黃芪液得發酵黃芪凍干粉。測得發酵黃芪中黃 芪的質量分數為78%，400g發酵黃芪凍干粉中含黃芪的質量為312g。
[0041] 發酵黃芪的液體培養基由以下重量份數的成分制備完成：乳清粉：24. 00份；蛋白 胨：2. 39份；葡萄糖：0. 50份；酵母粉：1. 68份；硫酸鎂0. 03份；檸檬酸三銨0. 50份；硫酸 氫二鉀0. 30份；乙酸鈉1. 10份；黃芪粉：100份；水：1100份。
[0042] 將實施例3中發酵黃芪凍干粉按照1%的劑量添加于21日齡的肉雞飼料中飼 喂28天，試驗結束后發現發酵黃芪組肉仔雞的體重明顯高于空白對照組和生藥黃芪組 (P>0. 05)。
[0043] 實施例4 本實施例中所用的大孔吸附樹脂D101和AB-8對發酵黃芪流浸膏皂苷的靜態吸附量分 別為30. 06mg/g和30. 58mg/g ;對生藥黃芪流浸膏皂苷的靜態吸附量分別為32. 40mg/g和 40. 56mg/g ;對發酵黃芪流浸膏皂苷的動態吸附量分別為22. 13mg/g和26. 25mg/g ;對生藥 黃芪流浸膏的動態吸附量分別為30. 53mg/g和32. 62mg/g。
[0044] 本實施例中的大孔吸附樹脂，每5mL處理好的AB-8樹脂和D 101樹脂分別相當于 干樹脂1. lg和1. 〇g。
[0045] 本發明提供的一種發酵黃芪總皂苷的提取方法，包括以下步驟： (1)稱取實施例1制備的發酵黃芪凍干粉400g，過20目篩，用20倍量（即8000 mL)85% 乙醇室溫下密閉浸泡8h，85°C溫浸lh，過濾，濾渣再重復提取1次。合并兩次上清液，過濾 除渣。藥渣用于提取水溶性的其它有效成分，如多糖等，利于發酵產品有效成分的充分開發 和高效利用。減壓蒸餾醇提液回收乙醇(泵壓力為〇. 〇8MPa，水浴溫度為55°C )，得醇提發酵 黃芪流浸膏160g，即lg流浸膏含1. 95g生藥黃芪，經香草醛-硫酸法檢測，醇提發酵黃芪流 浸膏中總皂苷含量為11.48 %。
[0046] (2)用100mL純水稀釋10g醇提發酵黃芪流浸膏，過濾，用100mL水飽和正丁醇萃 取濾液中總阜苷3次，萃取時應沿同一方向勻速輕微振搖，待稍靜止后，再行反方向輕微振 搖，以免發生乳化現象。
[0047] 合并三次正丁醇萃取液，用水洗滌正丁醇液2次，每次100mL。合并正丁醇液，減壓 蒸餾回收正丁醇(泵壓力為〇. 〇8MPa，水浴溫度為60 °C?85°C，蒸餾困難時可緩慢加入體 積百分含量為15%?30%的水)，至無正丁醇味，提取液濃縮至21g，即lg濃縮液中含0. 93g 生藥黃芪。因正丁醇萃取物干燥后不易溶于水，故將濃縮液制備成1:0. 9?1. 1，即lg濃縮 物中含0.9?1. lg生藥黃芪。
[0048] (3)用少量無水乙醇溶解發酵黃芪的正丁醇萃取濃縮液，再用100mL純水稀釋，過 濾，將上清液緩慢上樣于AB-8大孔吸附樹脂柱（Φ 2. 4cmX 70cm)，靜置30min。然后用30% 乙醇洗脫1倍柱體積（300mL)，棄洗脫液。再用85%乙醇洗脫3倍柱體積（950mL)。平均流速 為5mL/min，收集洗脫液，減壓蒸餾回收乙醇，冷凍干燥，得到純化發酵黃芪總皂苷3. 05g， 發酵黃芪純化皂苷中總皂苷含量為88. 39%。
[0049] 實施例5 本發明的生藥黃芪總皂苷的提取包括以下步驟： (1)稱取生藥黃芪312 g，過20目篩，用20倍量（6240 mL) 85 %乙醇室溫下密閉浸泡 8h，85 °C溫浸lh，過濾，濾渣再重復提取1次。合并兩次上清液，過濾除渣。減壓蒸餾醇提 液回收乙醇(泵壓力為0.08 MPa，水浴溫度為55 °C)，得醇提生藥黃芪流浸膏150 g (1 g 流浸膏含2. 08 g生藥黃芪)，經香草醛-硫酸法檢測，醇提生藥黃芪流浸膏中總皂苷含量為 16. 78 %。
[0050] (2)用100 mL純水稀釋10 g醇提生藥黃芪流浸膏，過濾，用100 mL水飽和正丁醇 萃取濾液中總阜苷3次(萃取時應沿同一方向勻速輕微振搖，待稍靜止后，再行反方向輕微 振搖，以免發生乳化現象)。
[0051] 合并三次正丁醇萃取液，用水洗滌正丁醇液2次，每次100 mL。合并正丁醇液，減 壓蒸餾回收正丁醇(泵壓力為0.08 MPa，水浴溫度為60 °C?85 °C，蒸餾困難時可緩慢加 入15 %?30 %的水)，至無正丁醇味，提取液濃縮至19 g (1 g濃縮液中含1. 09 g生藥黃 芪)。
[0052] (3)用少量無水乙醇溶解生藥黃芪的正丁醇萃取濃縮液，再用100 mL純水稀釋，過 濾，將上清液緩慢上樣于AB-8大孔吸附樹脂柱（Φ 2.4 cmX 70 cm)，靜置30 min。然后用 30 %乙醇洗脫1倍柱體積（300 mL)，棄洗脫液。再用85 %乙醇洗脫3倍柱體積（950 mL)。 平均流速為5 mL/min，收集洗脫液，減壓蒸餾回收乙醇，冷凍干燥，得到純化生藥黃芪總皂 苷3. 92 g，經香草醛-硫酸法檢測，生藥黃芪純化皂苷中總皂苷含量為91. 27 %。
[0053] 使用本發明方法提取的發酵黃芪總皂苷含量和得率均低于生藥黃芪總皂苷，說明 在黃芪的生物轉化過程中皂苷類物質發生了明顯的變化。本發明方法提取的總皂苷得率和 含量均高于單獨使用正丁醇萃取法或大孔樹脂富集法，本發明方法操作較為簡便、易于推 廣及擴大生產。
[0054] 實施例6 本實施例與實施例4的不同之處在于： 本實施例采用實施例1中的制備方法制備得到的發酵黃芪凍干粉。
[0055] 步驟（3)中，用少量無水乙醇溶解發酵黃芪的正丁醇萃取濃縮液，再用100mL純水 稀釋，過濾，將上清液緩慢上樣于AB-8大孔吸附樹脂柱（Φ 2. 4cmX 70cm)，靜置30min。然后 用30%乙醇洗脫1. 1倍柱體積（330mL)，棄洗脫液。再用70%乙醇洗脫6倍柱體積（1800mL)。 平均流速為5mL/min，收集洗脫液，減壓蒸餾回收乙醇，冷凍干燥，得到純化發酵黃芪總皂苷 2. 96g，發酵黃芪純化皂苷中總皂苷含量為78. 52%。
[0056] 其余步驟均相同。
[0057] 實施例7 本實施例與實施例4的不同之處在于： 本實施例采用實施例1中的制備方法制備得到的發酵黃芪凍干粉。
[0058] 步驟（3)中，用少量無水乙醇溶解發酵黃芪的正丁醇萃取濃縮液，再用100mL純水 稀釋，過濾，將上清液緩慢上樣于AB-8大孔吸附樹脂柱（Φ 2. 4cmX 70cm)，靜置30min。然后 用30%乙醇洗脫0. 9倍柱體積（270mL)，棄洗脫液。再用90%乙醇洗脫4倍柱體積（1200mL)。 平均流速為5mL/min，收集洗脫液，減壓蒸餾回收乙醇，冷凍干燥，得到純化發酵黃芪總皂苷 3. 24g，發酵黃芪純化皂苷中總皂苷含量為84. 81%。
[0059] 其余步驟均相同。
[0060] 實施例8 本實施例與實施例4的不同之處在于：本實施例中采用的大孔吸附樹脂為D101。得到 純化發酵黃芪總皂苷2. 83g，發酵黃芪純化皂苷中總皂苷含量為86. 39%。
[0061] 其余步驟均相同。
[0062] 實施例9 本實施例考察了 6種大孔樹對發酵黃芪總皂苷的富集純化能力，通過比較發酵黃芪總 皂苷的質量和總皂苷含量，優選出AB-8和D101效果較好，說明非極性和弱極性的大孔吸附 樹脂比較適于發酵黃芪皂苷的富集和純化。試驗的方法和步驟同實施例4，6種大孔樹脂 的比較試驗結果見表1。
[0063] 表1 6種大孔樹脂對發酵黃芪皂苷的富及純化試驗結果

【權利要求】
1. 一種發酵黃芪的制備方法，其特征在于：步驟如下：將潔凈的黃芪生藥飲片粉碎后， 發酵黃芪，發酵菌株非解乳糖鏈球菌CGMCC No. 4227的菌液濃度為2 X 106?2 X 108個/mL， 接菌量為4%?5% (占發酵總體積)，黃芪用量為8% (黃芪質量：發酵液體積，g:mL)，溫度 38°C?39°C，轉速200r/min，pH值5. 5?6. 5,溶氧量5%?10%，中和劑為6mol/L的NaOH，發 酵時間44h?52h，發酵結束后，凍干發酵黃芪液得發酵黃芪產品；優選地，發酵菌株CGMCC No. 4227的菌液濃度為2X 108個/mL，接菌量為5%(占發酵總體積)，黃芪用量為8%(黃芪質 量：發酵液體積，g:mL)，溫度39°C，轉速200r/min，pH值6. 4,溶氧量10%，中和劑為6mol/L 的NaOH，發酵時間48h ;優選地，所述發酵黃芪過程中使用的液體培養基由以下重量份數的 成分制備完成：乳清粉：24?27份；蛋白胨：2. 2?2. 4份；葡萄糖：0. 5?0. 7份；酵母粉： 1. 4?1. 7份；硫酸鎂：0. 03?0. 05份；檸檬酸三銨：0. 30?0. 50g ;硫酸氫二鉀：0. 30? 0. 50g ;乙酸鈉：0. 90?1. 10g ;黃芪粉：80?100份；水：900?1100份；更優選地，所述發 酵黃芪過程中使用的液體培養基由以下重量份數的成分制備完成：乳清粉：25. 79份；蛋白 胨：2. 28份；葡萄糖：0. 60份；酵母粉：1. 56份；硫酸鎂：0. 04份；梓檬酸三銨：0. 40份；硫 酸氫二鉀：〇. 40份；乙酸鈉：1. 00份；黃芪粉：80份；水：1000份。
2. 權利要求1所述的發酵黃芪作為飼料添加劑的應用。
3. -種飼料添加劑，其特征在于：所述飼料添加劑的有效成分為權利要求1所述的發 酵黃芪。
4. 一種發酵黃芪總皂苷的提取方法，其特征在于：步驟如下： (1) 將權利要求1所述的發酵黃芪用80%?90%乙醇溫浸提取，優選用85%乙醇溫浸提 取，得到醇提發酵黃芪流浸膏；優選地，所述流浸膏中lg流浸膏含〇. 9?1. lg生藥黃芪； (2) 將步驟（1)得到的醇提發酵黃芪流浸膏用水飽和正丁醇萃取，得提取液； (3) 將提取液上樣于大孔吸附樹脂柱吸附，洗脫，收集洗脫液，將洗脫液進行后處理，得 到純化后的發酵黃芪總皂苷。
5. 根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述溫浸提取是將發酵黃芪用 80%?90%乙醇室溫下密閉浸泡6h?10h，83°C?86°C溫浸lh?2h，過濾，濾渣再重復提 取1次；優選地，所述溫浸提取是將發酵黃芪用85%乙醇室溫下密閉浸泡8h，85°C溫浸lh， 過濾，濾渣再重復提取1次。
6. 根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于：所述溫浸提取時每lg發酵黃芪用 20ml 85%乙醇溫浸提取。
7. 根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于：步驟（2)中用水飽和正丁醇萃取時， 沿同一方向勻速輕微振搖，待稍靜止后，再反方向輕微振搖。
8. 根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于：步驟（3)中所述大孔吸附樹脂為 AB-8 或 D101 ;優選為 AB-8。
9. 根據權利要求4所述的提取方法，其特征在于：步驟（3)中所述洗脫是先用30%乙醇 洗脫，棄洗脫液；再用70%?90%乙醇洗脫，收集洗脫液；優選地，所述洗脫是先用30%乙醇 洗脫，棄洗脫液；再用85%乙醇洗脫，收集洗脫液。
10. 根據權利要求4-9任一所述的提取方法，其特征在于：提取后洗脫液經濃縮干燥 后，發酵黃芪總皂苷含量達78. 52%?88. 39%。
【文檔編號】C12R1/46GK104152491SQ201410405496
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月18日 優先權日:2014年8月18日
【發明者】秦哲, 李建喜, 楊志強, 王學智, 張景艷, 王旭榮, 王磊, 孔曉軍, 孟嘉仁, 張凱 申請人:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所