黃芪總皂苷提取物、其制備方法和質量標準控制方法

黃芪總皂苷提取物、其制備方法和質量標準控制方法
【專利摘要】本發明公開了一種黃芪總皂苷提取物，其特征在于參照中國藥典2010版附錄IX水分測定法，所述提取物的含水量不超過5％。本發明也公開了制備所述黃芪總皂苷提取物的方法，包括如下步驟：(1)黃芪粉末用乙醇浸泡或回流提取，合并提取液，得到濃縮液；(2)濃縮液上大孔樹脂柱，得到粗皂苷；(3)用中極性有機試劑反復洗滌粗皂苷，得到精制總皂苷；(4)將精制總皂苷堿化，再用稀酸中和至中性，水洗除去鹽，得到黃芪總皂苷提取物。所述提取物主要從水分、灰分、重金屬檢查，總皂苷含量、黃芪甲苷含量以及所述提取物指紋圖譜等方面進行質量標準控制。
【專利說明】黃芪總皂苷提取物、其制備方法和質量標準控制方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種中藥材黃芪的總皂苷提取物、其制備方法以及所述提取物的質量標準控制方法。
【背景技術】
[0002]黃苗(RadixAstragali)是豆科植物蒙古黃苗Astragalus membranaceus (Fisch)Bge.Var.mongholicus (Bge.) Hsiao 或者膜英黃苗 Astragalus membranaceus (Fisch) Bge.的干燥根，為常用的補益藥，味甘，性溫。傳統醫學認為其具有補氣固表，利尿脫毒，排膿，斂瘡生肌，用于氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛等，藥用歷史非常悠久。現代研究表明，黃芪具有提高免疫功能，增強抗氧化、抗輻射和抗癌，保護心腦血管、肝臟、腎臟和肺臟，抗菌及抑制病毒等作用。黃芪皂苷作為黃芪的主要活性成分，臨床和實驗表明，黃芪皂苷具有免疫調節，抗腫瘤、抗病毒、降糖和改善心血管疾病等廣泛活性。

【發明內容】

[0003]本發明的第一個目的是提供一種黃芪總皂苷提取物，參照中國藥典2010版附錄IX水分測定法，所述黃芪總皂苷提取物的含水量不超過5%。
[0004]根據本發明的一個優選的實施方式，參照中國藥典2010版附錄IX J熾灼殘渣檢查法，所述黃芪總皂苷提取物的熾灼殘渣不超過I %。
[0005]根據本發明的一個優選的實施方式，參照《中國藥典》2010版附錄IXE重金屬檢查法，所述黃芪總皂苷提取物的重金屬含量不超過lOppm。
[0006]根據本發明的一個 優選的實施方式，用比色法測定所述提取物黃芪總皂苷的含量，所述黃芪總皂苷提取物的黃芪總皂苷含量不低于90%。
[0007]根據本發明的一個優選的實施方式，用HPLC-DAD法測定所述提取物中黃芪甲苷的含量，所述提取物的黃芪甲苷含量不得低于50%。
[0008]根據本發明的一個優選的實施方式，根據所述指紋圖譜檢測法，所述黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度大于0.90。
[0009]本發明的第二個目的是提供制備所述黃芪總皂苷提取物的方法，包括如下步驟:
[0010](I)將黃芪粉末用乙醇浸泡或回流提取，合并提取液，得到濃縮液；
[0011](2)濃縮液上大孔樹脂柱，得到粗皂苷；
[0012](3)用中極性有機試劑反復洗滌粗皂苷，得到精制總皂苷；
[0013](4)將精制總皂苷堿化，再用稀酸中和至中性，水洗除去鹽，得到黃芪總皂苷提取物。
[0014]根據本發明的一個優選的實施方式，步驟(1)中所述黃芪粉末過60目篩。
[0015]根據本發明的一個優選的實施方式，步驟(1)中所述浸泡提取包括用60-90%乙醇在55°C下浸泡黃芪粉末的步驟。
[0016]根據本發明的一個優選的實施方式，步驟(1)中所述回流提取包括用60-90%乙醇回流提取黃芪粉末至少兩次，其中第一次使用6~8倍黃芪粉末重量的60-90%乙醇回流提取至少I小時，第二次使用3~5倍黃芪粉末重量的60-90%乙醇回流至少30分鐘。
[0017]根據本發明的一個優選的實施方式，步驟(2)中，先用去離子水洗脫，從而除去糖類和酚酸類；再用濃度20%~40%乙醇洗脫3~5個柱體積從而除雜,最后用濃度70%~90%洗脫3~5個柱體積，收集，濃縮蒸干得到粗皂苷。
[0018]根據本發明的一個優選的實施方式，步驟(2)中所述大孔樹脂柱選自非極性或弱極性大孔樹脂柱。所述非極性大孔樹脂柱可以選自AB-8、D101或D104，所述弱極性大孔樹脂柱可以選自HP20或HPD300。
[0019]根據本發明的一個優選的實施方式，所述大孔樹脂的用量不低于20倍黃芪粉末重量。
[0020]根據本發明的一個優選的實施方式，步驟(3)中，用體積為I~3倍粗皂苷重量的中極性有機試劑反復洗滌，洗滌次數> 2次，優選2~3次。所述中極性有機試劑選自丙酮、乙醚或乙酸乙酯，優選丙酮。每次洗滌試劑的體積為粗皂苷重量的3~6倍。 [0021]根據本發明的一個優選的實施方式，步驟(4)中，用體積為3~5倍總皂苷重量的堿溶液，加熱磁攪拌水解總阜苷。其中所述加熱溫度為40~60°C,磁攪拌轉速為1000~2000rpm，時間為4~6h。所述堿溶液選自0.5%~I %的NaOH，Ca (OH)2或KOH溶液。
[0022]根據本發明的一個優選的實施方式，步驟(4)中所述稀酸為稀鹽酸或醋酸或稀磷酸，稀酸濃度約為0.1~0.5mol/L。
[0023]根據一個特別優選的實施方式，本發明制備黃芪總皂苷提取物的方法具體包括如下步驟:將黃芪根粉碎，打粉，過60目篩，用乙醇回流提取多次；合并醇提液，濃縮至無醇味，加水混懸加入大孔吸附樹脂柱，去離子水洗脫3~5個柱體積，除去糖、酚酸等雜質；再用20%~40%乙醇洗脫3~6個柱體積，優選40%乙醇，洗脫4個柱體積；再用70%~90%乙醇洗脫3~6個柱體積，優選70 %的乙醇，洗脫5個柱體積，濃縮得到粗皂苷，粗皂苷用中極性有機試劑多次洗滌除雜，洗滌液棄去，得到白色的黃芪總皂苷。黃芪總皂苷中加入適量堿溶液，水解3~6小時，加稀酸中和至中性，水洗去鹽，得到黃芪總皂苷提取物。通過中極性有機試劑的洗滌除雜，本發明方法得到的黃芪總皂苷提取物色澤更白、更美觀，黃芪總皂苷的含量更高。
[0024]本發明的第三個目的是提供黃芪總皂苷提取物的質量標準控制方法。
[0025]黃芪總皂苷提取物的質量標準控制方法包括水分、熾灼殘渣、重金屬檢查，黃芪總皂苷的含量測定，黃芪甲苷的含量測定和所述提取物指紋圖譜檢測。
[0026](I)上述水分檢查辦法參照中國藥典2010版附錄IX水分測定法，具體方法如下:取黃芪總皂苷提取物2g，轉移至干燥至恒重的稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋在105°C下干燥5小時，將瓶蓋蓋好，移至干燥器中，冷卻30分鐘，再精密稱定，在上述溫度下干燥lh，冷卻，稱重，至連續兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據減失的重量，計算含水量。經測定三批提取物樣品含水量均不超過5%。
[0027](2)上述熾灼殘渣檢查方法參照中國藥典2010版附錄IX J熾灼殘渣檢查，具體方法如下:取黃芪總皂苷提取物lg，置已熾灼至恒重的坩堝中，精密稱定，緩慢熾灼至炭化，放冷至室溫；加硫酸0.5~Iml使濕潤,低溫加熱至硫酸蒸汽除盡,在500~600°C熾灼使完全灰化，移置干燥器內，放冷至室溫，精密稱定后，再在500~60(TC熾灼至恒重，放冷，稱重。經測定，3批提取物熾灼殘渣均不超過1.0%。
[0028](3)上述重金屬含量檢查方法參照《中國藥典》2010版附錄IX E重金屬檢查法，具體方法如下:規定所述提取物重金屬含量不得超過lOppm。取熾灼殘渣項所得殘渣，加硝酸0.5mL，蒸干后放冷，加鹽酸2mL，置水浴上蒸干后加水15mL，滴加氨試液至對酚酞指示液顯微粉紅色，再加醋酸鹽緩沖液(PH 3.5)2mL，微熱溶解后，置納氏比色管中，加水稀釋成25mL作為甲管。另取配制供試品溶液的試劑，置瓷皿中蒸干后，加醋酸鹽緩沖液(PH3.5) 2mL與水15mL，作為乙管，再在兩管中分別加入硫代乙酰胺試液各2mL，搖勻，放置2分鐘，同置白紙上，自下向上透視，乙管中顯出的顏色與甲管比，不得更深。經測定，3批提取物的重金屬含量均小于lOPPm。
[0029](4)上述的提取物中黃芪總皂苷含量測定方法，用比色法測定黃芪總皂苷含量，具體步驟如下:
[0030]a.對照品溶液的制備:精密稱取在105°C減壓干燥至恒重的黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解，配置每Iml成含黃芪甲苷0.604mg的標準對照品溶液。
[0031]b.線性關系的考察:精密吸取上述標準對照溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5ml分別置于具塞試管中，置水浴中加熱，揮干溶劑，再分別精密加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml和高氯酸0.8ml，密塞，置于70°C水浴恒溫加熱20分鐘，取出，立即用冰水冷卻，加冰醋酸
5.0ml搖勻，在560nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，黃芪甲苷量為橫坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程，R值不低于0.9995。
[0032]c.供試品溶液的制備:精密稱取約IOmg黃芪總皂苷樣品，加甲醇溶解，定容與20ml的容量瓶中，制得供試品溶液。
[0033]d.供試品中黃芪總皂苷的含量測定:按照c的制備方法和b中的操作方法，測定10批黃芪總皂苷提取物中黃芪總皂苷的含量均高于90%，為91.3%~96.82%，平均含量為 93.12%。
[0034](5)上述的提取物中黃芪甲苷含量測定方法特征在于為HPLC-DAD測定法，具體步驟如下:
[0035]a.色譜條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.5%磷酸為流動相，比例為0.25: 0.75，進行梯度洗脫，O至20分鐘，乙腈濃度從25%至35% ;21分鐘至50分鐘，乙腈濃度從35%至48% ;檢測器為DAD，檢測波長為201~210nm，最優檢測波長為205nm ；流速0.5~1.0ml，最優流速為0.8ml ;柱溫20~40°C，最優柱溫為35°C;進樣量5~50 μ I。
[0036]b.對照品溶液制備方法與標準曲線的繪制:取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解，制得儲備對照品溶液，用儲備對照品溶液配成5個不同濃度，按照色譜條件進樣，測定，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程，R2值不低于0.9995。
[0037]c.供試品溶液制備方法:取黃芪總皂苷提取物適量，加甲醇溶解，制得供試品溶液。
[0038]d.供試品中黃芪甲苷的含量測定:取適量供試品，按照(3)制備方法制得供試品溶液，按照⑴色譜條件進樣，依據⑵中的回歸方程`求得黃芪甲苷含量。測得，10批黃芪總皂苷提取物中黃芪甲苷的含量均高于50%。
[0039](6)上述黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜檢測，其具體步驟如下:
[0040]a.色譜條件:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.5%磷酸水溶液比例為0.25: 0.75為流動相，進行梯度洗脫；O至20分鐘，乙腈濃度從25%至35%;21分鐘至50分鐘，乙腈濃度從35%至48% ;流速為0.8ml/min ;檢測器為DAD，檢測波長為205nm ;進樣量為10μ I。
[0041]b.參照品溶液的配置:精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解制成每Iml含
0.50mg的溶液，作為參照品溶液。
[0042]c.供試品溶液的制備:精密稱取黃芪總皂苷提取物適量，加甲醇溶解配成每Iml含2.50mg的溶液，搖勻，用0.45 μ m的微孔濾膜濾過，取續濾液作為黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜檢測供試液。
[0043]d.供試液指紋圖譜檢測:按照(I)中的色譜條件，用高效液相色譜對10批黃芪總皂苷提取物的供試液進行指紋圖譜檢測，記錄50分鐘色譜圖，得黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜，黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜應與標準指紋圖譜的相似度均大于0.90 ;黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜有16個共有指紋峰，參照峰S為黃芪甲苷色譜峰，16個共有指紋峰的相對保留時間分別為:1號峰0.116±0.002，2號峰0.125±0.001，3號峰0.145±0.003，4號峰 0.177±0.002，5 號峰 0.352±0.002，6 號峰 0.385±0.004，7 號峰 0.413±0.002，8 號峰
0.444±0.003，9 號峰 0.466±0.002，10 號峰 0.505±0.001，11 號峰 0.638±0.002，12 號峰
0.890±0.003，13 號峰 0.944±0.003，14 號峰 1.000 (S 峰)，15 號峰 1.186±0.004 和 16 號峰 1.195±0.004。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1為黃芪甲苷標準曲線圖(比色法)；
[0045]圖2為以SI為參照生成的對照指紋圖譜；
[0046]圖3為實施例1-3獲得的10批樣品的疊加圖(Sl-SlO)與對照指紋圖譜(R)。【具體實施方式】
[0047]為了更好地理解本發明，通過以下實施例來說明，但這些實施例不構成對本發明的限制。
[0048]實施例1
[0049]取黃芪藥材500g(產地:甘肅省岷縣，2011年10月購自甘肅省岷縣中藥材出售公司)，粉碎，過60目篩，第一次加藥材量8倍量的60%乙醇，第二次加藥材量5倍量的60%乙醇，熱回流提取，合并藥液濃縮至無醇味，加適量水懸浮，上DlOl大孔吸附樹脂(陜西藍深樹脂特種樹脂有限公司)，用4倍樹脂床體積的去離子水沖洗，水沖洗液棄去；再用5倍樹脂床體積的40 %乙醇沖洗，沖洗液棄去；用5倍樹脂床的90%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮蒸干得粗皂苷4g，用體積為3倍粗皂苷量的丙酮進行洗滌，洗滌液棄去，一共三次，得到精制總皂苷2.5g，加入3倍量的0.5% NaOH溶液，60°C下磁攪拌3h，加入0.lmol/L的稀鹽酸中和至中性，減壓蒸干，反復水洗除去NaCl，得到淡白色黃芪總皂苷提取物2.0g，總皂苷含量為97%。
[0050]實施例2
[0051]取黃芪藥材500g(產地甘肅岷縣，2011年10月購自甘肅省岷縣中藥材出售公司)，粉碎，過60目篩，第一次加藥材量8倍量的60%乙醇，第二次加藥材量5倍量的60%乙醇，第三次加藥材量3倍量的60%乙醇，熱回流提取，合并藥液濃縮至無醇味，加適量水懸浮，上DlOl大孔吸附樹脂(陜西藍深特種樹脂有限公司)，用4倍樹脂床體積的去離子水沖洗，水沖洗液棄去；再用5倍樹脂床體積的40%乙醇沖洗，沖洗液棄去；用5倍樹脂床的90%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮蒸干得粗皂苷5g，用體積為3倍粗皂苷量的乙酸乙酯進行洗滌，洗滌液棄去，一共三次，得到精制總皂苷3g，精制總皂苷加入3倍量的1% NaOH溶液，60°C下磁攪拌6h，加入0.lmol/L稀鹽酸中和至中性，減壓蒸干，反復水洗除去NaCl，得到灰白色的黃芪總皂苷提取物2.6g，總皂苷含量為90%。
[0052]實施例3
[0053]取黃芪藥材500g(產地甘肅岷縣，2011年10月購自甘肅省岷縣中藥材出售公司)，粉碎，過60目篩，第一次加藥材量8倍量的60%乙醇，第二次加藥材量5倍量的60%乙醇，熱回流提取，合并藥液濃縮至無醇味，加適量水懸浮，上AB-8大孔吸附樹脂(陜西藍深樹脂特種樹脂有限公司)，用4倍樹脂床體積的去離子水沖洗，水沖洗液棄去；再用5倍樹脂床體積的40%乙醇沖洗，沖洗液棄去；用5倍樹脂床的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮蒸干得粗皂苷3.Sg，用體積為3倍粗皂苷量的乙醚進行洗滌，洗滌液棄去，一共三次，得到精制總皂苷部位2.3g，精制總皂苷加入3倍量的1% NaOH溶液，60°C下磁攪拌6h，加入
0.5mol/L稀鹽酸中和至中性，減壓蒸干，反復水洗除去NaCl，得到灰白色的黃芪總皂苷提取物1.9g，總皂苷含量為93%。
[0054]實施例4
[0055]取實施例1-3獲得的黃芪總皂苷提取物3批(批號分別為20111205，20111208和20111210)。
[0056]1.水分檢查
`[0057]取黃芪總皂苷提取物約2g，轉移至干燥至恒重的稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋在105°C下干燥5小時，將瓶蓋蓋好，移至干燥器中，冷卻30分鐘，再精密稱定，在上述溫度下干燥lh，冷卻，稱重，至連續兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據減失的重量，計算含水量(% )?結果見表1。
[0058]2.熾灼殘渣檢查
[0059]取黃芪總皂苷提取物lg，置已熾灼至恒重的坩堝中，精密稱定，緩慢熾灼至炭化，放冷至室溫；加硫酸0.5~Iml使濕潤,低溫加熱至硫酸蒸汽除盡,在500~600°C熾灼使完全灰化，移置干燥器內，放冷至室溫，精密稱定后，再在500~60(TC熾灼至恒重，放冷，稱重，結果見表1。
[0060]3.重金屬檢查
[0061]取熾灼殘渣項所得殘渣，加硝酸0.5mL，蒸干后放冷，加鹽酸2mL，置水浴上蒸干后加水15mL，滴加氨試液至對酚酞指示液顯微粉紅色，再加醋酸鹽緩沖液(PH 3.5)2mL，微熱溶解后，置納氏比色管中，加水稀釋成25mL作為甲管。另取配制供試品溶液的試劑，置瓷皿中蒸干后，加醋酸鹽緩沖液(PH3.5)2mL與水15mL，作為乙管，再在兩管中分別加入硫代乙酰胺試液各2mL，搖勻，放置2分鐘，同置白紙上，自下向上透視，乙管中顯出的顏色與甲管t匕，不得更深，結果見表1。
[0062]表1:水分、熾灼殘渣、重金屬檢查結果
[0063]
【權利要求】
1.黃芪總皂苷提取物，其特征在于參照中國藥典2010版附錄IX水分測定法，所述提取物的含水量不超過5%。
2.根據權利要求1所述的黃芪總皂苷提取物，其特征在于參照中國藥典2010版附錄IX J熾灼殘渣檢查法，所述提取物的熾灼殘渣不超過I %。
3.根據權利要求1或2所述的黃芪總皂苷提取物，其特征在于參照《中國藥典》2010版附錄IX E重金屬檢查法，所述提取物的重金屬含量不超過lOppm。
4.根據權利要求1至3任一項所述的黃芪總皂苷提取物，其特征在于用比色法測定所述提取物黃芪總皂苷的含量，所述提取物的黃芪總皂苷含量不低于90%。
5.根據權利要求1至4任一項所述的黃芪總皂苷提取物，其特征在于用HPLC-DAD法測定所述提取物中黃芪甲苷的含量，所述提取物的黃芪甲苷含量不得低于50%。
6.根據權利要求1至5任一項所述的黃芪總皂苷提取物，其特征在于根據所述指紋圖譜檢測法，所述提取物的指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度大于0.90。
7.制備權利要求1-6任一項所述的黃芪總皂苷提取物的方法，包括如下步驟: (1)將黃芪粉末用乙醇浸泡或回流提取，合并提取液，得到濃縮液； (2)濃縮液上大孔樹脂柱，得到粗皂苷； (3)用中極性有機試劑反復洗滌粗皂苷，得到精制總皂苷； (4)將精制總皂苷堿化，再用稀酸中和至中性，水洗除去鹽，得到黃芪總皂苷提取物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述黃芪粉末過60目篩。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述浸泡提取包括用體積百分數為60-90%的乙醇在55°C下浸泡黃芪粉末的步驟。
10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述回流提取包括用60-90%乙醇回流提取黃芪粉末至少兩次，其中第一次使用6~8倍黃芪粉末重量的60-90%乙醇回流提取至少I小時，第二次使用3~5倍黃芪粉末重量的60-90%乙醇回流至少30分鐘。
11.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(2)中，先用去離子水洗脫，再用濃度.20 %~40 %乙醇洗脫3~5個柱體積，最后用體積百分數為70 %~90 %的乙醇洗脫3~5個柱體積，收集，濃縮蒸干得到粗皂苷。
12.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述大孔樹脂柱選自非極性或弱極性大孔樹脂柱。
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述非極性大孔樹脂柱選自AB-8、DlOl或D104，所述弱極性大孔樹脂柱選自HP20或HPD300。
14.根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述大孔樹脂的用量不低于黃芪粉末重量的20倍。
15.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(3)中，用體積為I~3倍粗皂苷重量的中極性有機試劑反復洗滌，洗滌次數> 2次。
16.根據權利要求15所述的方法，所述中極性有機試劑選自丙酮、乙醚或乙酸乙酯，優選丙酮。
17.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(4)中，用體積為3~5倍精制總皂苷重量的堿溶液，加熱磁攪拌水解總皂苷。
18.根據權利要求17所述的方法，其特征在于所述加熱溫度為40~60°C，磁攪拌轉速為1000~2000rpm，時間為4~6h。
19.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述堿溶液選自0.5%~1%的 NaOH，Ca (OH) 2 或 KOH 溶液。
20.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述稀酸為稀鹽酸或醋酸或稀磷酸，稀酸濃度為0.1~0.5mol/L。
21.根據權利要求7至20任一項所述的方法得到的黃芪總皂苷提取物。
22.黃芪總皂苷提取物的質量標準控制方法，其特征在于測定所述提取物的水分、熾灼殘渣、重金屬含量、黃芪總皂苷含量、黃芪甲苷含量以及提取物指紋圖譜檢測。
23.根據權利要求22中所述的質量標準控制方法，其特征在于參照中國藥典2010版附錄IX水分測定法，規定所述提取物的含水量不得超過5%。
24.根據權利要求22中所述的質量標準控制方法，其特征在于參照中國藥典2010版附錄IX J熾灼殘渣檢查法，規定所述提取物的熾灼殘渣不得超過1%。
25.根據權利要求22中所述的質量標準控制方法，其特征在于參照《中國藥典》2010版附錄IX E重金屬檢查法，規定所述提取物的重金屬含量不得超過lOppm。
26.根據權利要求22中所述的質量標準控制方法，其特征在于用比色法測定所述提取物黃芪總皂苷的含量，規定所述提取物的黃芪總皂苷含量不得低于90%。
27.根據權利要求22中所述的質量標準控制方法，其特征在于用HPLC-DAD法測定所述提取物中黃芪甲苷的含量，規定所述提取物的黃芪甲苷含量不得低于50 %。
28.根據權利要求27中所述的質量標準控制方法，其特征在于所述HPLC-DAD法測定包括如下步驟: (1).色譜條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.5%磷酸為流動相，進行梯度洗脫；檢測器為DAD，檢測波長為201~210nm ;流速0.5~1.0ml，柱溫20~40°C，進樣量5~50 μl ; (2).對照品溶液制備方法與標準曲線的繪制:取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解，制得儲備對照品溶液，用儲備對照品溶液配成3~6個不同濃度，按照色譜條件進樣，測定，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程，R2值不低于0.9995 ； (3).供試品溶液制備方法:取黃芪總皂苷提取物適量，加甲醇溶解，制得供試品溶液； (4).供試品中黃芪甲苷的含量測定:取適量供試品，按照(3)制備方法制得供試品溶液，按照(1)色譜條件進樣，依據(2)中的回歸方程求得黃芪甲苷含量。
29.根據權利要求22中所述的質量標準控制方法，其特征在于根據所述指紋圖譜檢測法，規定黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜與標準指紋圖譜的相似度應大于0.90。
30.根據權利要求29中所述的質量標準控制方法，其特征在于所述指紋圖譜檢測法包括如下步驟: (1).色譜條件:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.5%磷酸水溶液比例為.0.25: 0.75為流動相，進行梯度洗脫；O至20分鐘，乙腈濃度從25%至35%;21分鐘至50分鐘，乙腈濃度從35%至48% ;流速為0.5~lml/min ;檢測器為DAD，檢測波長為201~210nm，最優波長為205nm ;進樣量為5~50 μ l ; (2).參照品溶液的配置:精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解制成每1ml含.0.50mg的溶液，作為參照品溶液；(3).供試品溶液的制備:精密稱取黃芪總皂苷提取物適量，加甲醇溶解配成每Iml含.2.50mg的溶液，搖勻，用0.45 μ m的微孔濾膜濾過，取續濾液作為黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜檢測供試液； (4).供試液指紋圖譜檢測:按照(I)中的色譜條件，用高效液相色譜對黃芪總皂苷提取物的供試液進行指紋圖譜檢測，記錄50分鐘色譜圖，得黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜，黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜應與標準指紋圖譜的相似度大于0.90 ;所述黃芪總皂苷提取物的指紋圖譜共有16個共有指紋峰，參照峰S為黃芪甲苷色譜峰，16個共有指紋峰的相對保留時間分別為:1號峰0.116±0.002，2號峰0.125±0.001，3號峰0.145±0.003，4號峰 0.177±0.002，5 號峰 0.352±0.002，6 號峰 0.385±0.004，7 號峰 0.413±0.002，8 號峰.0.444±0.003，9 號峰 0.466±0.002，10 號峰0.505±0.001，11 號峰 0.638±0.002，12 號峰.0.890±0.003，13 號峰 0.944±0.003，14 號峰 1.000 (S 峰)，15 號峰 1.186±0.004 和 16 號峰 1.195±0.004。
【文檔編號】A61P9/14GK103623039SQ201210296882
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月20日 優先權日:2012年8月20日
【發明者】楊義芳, 胡曉, 楊悅文, 屈曉晟 申請人:上海醫藥工業研究院, 中國醫藥工業研究總院