專利名稱：一種抑制原發性肝癌生長和轉移的新方法
技術領域：
本發明涉及ー種肝癌治療方法，該方法以可以抑制肝癌生長和轉移的miRNA-885-5p作為靶點來治療肝癌，通過瘤內注射合成的miRNA-885_5p模擬物(miRNA-885-5p Agomir)來實現治療作用。
背景技術：
原發性肝細胞癌是常見的消化道惡性腫瘤，在世界范圍內是排名第五的惡性腫瘤，世界毎年新發現惡性腫瘤病人約635萬例，其中肝癌大約占26萬例，26萬例中42. 5%發生在我國且其發病率仍然呈逐年遞增的趨勢。肝癌發現一般為晚期，有效的治療方法為肝切除和肝移植，常規化療對肝癌治療效果并不明顯，所以肝癌的早期診斷尤為重要，探索有·效的肝癌臨床診斷標記物和治療策略具有重要意義。隨著分子生物學技術的不斷發展，人們對腫瘤發生發展機制的了解越來越深入。依據腫瘤發生中涉及的異常分子和基因，設計和研制針對特定分子和基因靶點的藥物，選擇性殺傷腫瘤細胞，這種方法稱為腫瘤分子靶向治療。近年來，腫瘤分子靶向治療已經成為腫瘤治療新的發展方向，腫瘤分子靶向藥物的研究和臨床應用使腫瘤治療水平提升到ー個新的高度。miRNA在細胞生長、發育、分化、死亡等生物過程中起著重要的作用，同時，miRNA幾乎參與了血細胞生成、胰島素分泌、神經系統構成和人類癌細胞生長等每ー個生命活動的過程。序列分析表明，有1/3以上的人類基因直接受到miRNA的調控，而且越來越多的試驗證據表明miRNA還有很多功能未被發現。miRNA具有腫瘤抑制因子及癌基因的作用，被稱作oncogenic miRNA,即oncomiR。oncomiR的失調與基因突變或表觀遺傳變異(包括缺失突變、擴增突變、點突變及DNA異常甲基化等)有夫。其表達情況與人類多種惡性腫瘤的發生、發展、診斷、預后相關。miR-885-5p是一種已知的小分子RNA, NCBI基因庫查詢顯不該基因定位于3號染色體的p25. 3的10411173-10411246區間(負鏈)，由Berezikov E等克隆測序發現。miR-885_5p的相關基本信息為!Accession No MIMAT0004947,基本序列為5’ UCCAUUACACUACCUGC⑶⑶3’。miR-885_5p在腫瘤中的研究還處于剛剛起步階段，現有的研究表明其在神經母細胞瘤起到抑制腫瘤生長的作用。另外，新近的研究發現miR-885-5p可以抑制膠質瘤的轉移。我們的前期研究發現，miR-885-5p和肝臟病的發病過程相關。然而，其對原發性肝癌發生發展的影響還未見報道。本發明首次發現miRNA-885_5p可以作為抑制肝癌生長和轉移的靶點，激活miRNA-885-5p活性的miRNA-885_5p模擬物可用于治療肝癌。
發明內容
本發明的目的在于解決目前原發性肝癌治療困難，化療耐藥性較高的問題，提供了一種靶向治療肝癌的新方法，所述方法以可以抑制肝癌生長和轉移的miRNA-885-5p作為靶點，利用miRNA激動劑來治療腫瘤，其中miRNA激動劑包括miRNA-885_5p模擬物。通過瘤內注射合成的miRNA-885-5p模擬物，例如由廣州銳博生物科技有限公司合成的miRNA-885_5p 模擬物(miRNA-885_5p agomir)來實現肝癌的治療。miRNA agomir 是經過特殊化學修飾的miRNA激動劑，其通過模擬內源性miRNA進入miRISC復合物來調節靶mRNA的表達而發揮作用。與普通的miRNA mimics相比，agomir在動物體內具有更高的穩定性和miRNA促進效果。miRNA agomir在體內具有濃度梯度相關性,穩定性高,其作用時間可長達數周。本發明建立了 N0D/SCID小鼠皮下異種成瘤模型，通過瘤內注射PBS、對照agomir或miRNA-885-5p agomir設置對照組和試驗組，跟蹤測量試驗組和對照組的瘤體體積，并用H&E染色的方法對對照組和試驗組中的腫瘤壞死細胞的情況進行評判。實驗結果表明miRNA-885-5p agomir能夠抑制肝癌細胞的生長。
此外，本發明還通過建立具有示蹤作用的肝癌穩定細胞系和具有示蹤作用的高表達miR-885-5p肝癌穩定細胞系，進ー步構建了 N0D/SCID小鼠原位肝癌模型。在確定小鼠原位肝癌模型建立成功后，通過體內化學發光成像監測腫瘤病灶的生長情況，在NOD/SCID小鼠原位肝癌模型建成8周后，將小鼠處死，將肺臟取出用多聚甲醛固定作石蠟切片，在用H&E染色后，通過顯微鏡觀察肺部腫瘤結節，以確定肝癌細胞有無轉移。通過過表達miR-885-5p的實驗組和對照樣品進行比較后發現，高表達miR-885_5p可以抑制肝癌細胞的原位生長和肺部轉移。本發明還涉及miR-885-5p模擬物在制備治療肝癌的藥物中的用途，其中所述藥物用于抑制肝癌生長或轉移，所述藥物除包含miR-885-5p模擬物外，還可以包含藥學上常見的藥物載體，其中所述載體是注射溶媒、等滲調節劑、PH調節劑、穩定劑、保護劑等。注射溶媒選自注射用水、注射用油、こ醇、甘油、聚こニ醇等；所述等滲調節劑選自氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、碳酸氫鈉、乳酸鈉、甘油等，氯化鈉濃度范圍一般為0. 5-0. 9%，葡萄糖濃度范圍一般為4-5%，甘油濃度范圍一般為2. 25%左右；所述的pH調節劑選自乳酸、檸檬酸、磷酸氫ニ鈉、磷酸ニ氫鈉、磷酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉等，乳酸的濃度范圍一般為0. 1%左右，檸檬酸的濃度一般為0. 5%左右，磷酸氫ニ鈉和磷酸ニ氫鈉的濃度一般為I. 7%和0. 71%左右，碳酸鈉、碳酸氫鈉的濃度一般為0. 06%和0. 005%左右；所述穩定劑選自肌酐、甘氨酸，肌酐的濃度一般為0. 5-0. 8%，甘氨酸的濃度一般為I. 5-2. 25% ;所述保護劑選自乳糖、蔗糖、麥芽糖、人血白蛋白，乳糖的濃度一般為2-5%，蔗糖的濃度一般為2-5%，麥芽糖的濃度一般為2-5%，人血白蛋白的濃度一般為0. 2-2%。所述藥物可以制備成常見的劑型，例如注射齊U、顆粒劑、片劑、膠囊、氣霧劑等，所述注射劑可以是溶液型、混懸型或乳劑型，可以通過皮下注射、肌肉注射、靜脈注射或靜脈滴注的方式給藥。所述的模擬物包含雙鏈RNA，其中雙鏈RNA的正義鏈的具體序列為5’ UCCAUUACACUACCUGCCUCU3’，反義鏈的具體序列為5’ AGAGGCAGGTAGTGTAATGGA3’，所述雙鏈RNA可以是經過修飾的RNA。更具體地，本發明中所使用的miRNA-885-5p類似物購自廣州銳博生物科技有限公司，其具體名稱為miR_885_5p agomir。
圖I. N0D/SCID小鼠皮下成瘤后，瘤內注射miR-885_5p模擬物，可見抑制肝癌的生長;圖2.將瘤體取出，固定，H&E染色后，可見注射miR-885_5p模擬物組的組織壞死情況比對照組明顯；圖3攜帶熒光素酶的高表達HCCLM3細胞生物發光強度與細胞數呈正比關系；圖4攜帶熒光素酶的高表達HCCLM3細胞原位成瘤后，在N0D/SCID小鼠的體內示蹤情況；圖5原位成瘤模型建成8周后，將小鼠處死，將肺部固定，H&E染色情況；圖6肺部H&E染色后，肺部結節計數對比；
具體實施例方式下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進ー步詳細描述。實施例I miR-885-5p模擬物抑制N0D/SCID小鼠皮下瘤的生長(I)用胰酶消化生長良好的野生型人肝癌SK-H印-1細胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培養基重懸至I X IO8細胞/4毫升；(2)對5-6周N0D/SCID雄性小鼠右側背部皮下注射(I)中處理好的細胞200 μ 1，10天后可見小鼠右側背部可見瘤體形成，N0D/SCID小鼠皮下成瘤的模型建成；(3)瘤內注射miR-885-5p模擬物2ηΜ/100 μ 1，2次/周。注射6次，跟蹤量瘤體體積。其中miR-885-5p模擬物購自廣州銳博生物科技有限公司，其具體名稱為miR-885-5p agomir,其中包含雙鏈RNA，雙鏈RNA的正義鏈的具體序列為5’ UCCAUUACACUACCUGCCUCU3’，反義鏈的具體序列為5’ AGAGGCAGGTAGTGTAATGGA3’，所述雙鏈RNA是經過化學修飾的具有更高穩定性的RNA。同時設置瘤內注射PBS的空白對照組、對照agomir的陰性對照組。跟蹤結果如圖I所示。將瘤體取出，固定，H&E染色后，可見注射miR-885-5p模擬物的試驗組的組織壞死情況比對照組明顯嚴重。H&E染色結果如圖2所示。實施例2 miR-885-5p抑制肝癌的轉移(I)具有示蹤作用的肝癌穩定細胞系的建立用293T細胞鋪六孔板，密度為I. 5X IO6細胞/孔，用于轉染；用lipo-2000將含有熒光素酶基因的慢病毒表達質粒和慢病毒包裝質粒(慢病毒表達系統均購自美國biosettia生物公司)轉染入前一天鋪板的293T細胞；轉染16小時后更換新鮮DMEM培養基，換液后24小時收集病毒上清，儲于_80°C冰箱備用；用人肝癌HCCLM3細胞鋪六孔板，密度為I X IO5細胞/孔，用于病毒感染；待病毒上清常溫化凍后，混合2毫升不含抗生素的全培養基和I毫升病毒上清加入HCCLM3細胞孔內，并加入陽離子多聚物基因載體polybrene24 Hg/孔(購自Sigma公司)，1600rpm，37°C離心I小時；離心結束后換新鮮全培養基2毫升/孔，繼續置于37°C培養箱進行培養；48小時后向上述病毒感染后的HCCLM3細胞中加入Bsd進行藥篩共計3天，以得到穩定表達海腎熒光素酶的人肝癌HCCLM3細胞，簡稱HCCLM3/Iuci0(2)具有示蹤作用的高表達miR-885_5p肝癌穩定細胞系的建立用293T細胞鋪六孔板，密度為I. 5X IO6細胞/孔，用于轉染；用lipo-2000將含有miR-885-5p的慢病毒表達質粒和慢病毒包裝質粒(慢病毒表達系統均購自美國biosettia生物公司)轉染入前一天鋪板的293T細胞；轉染16小時后更換新鮮DMEM培養基，換液后24小時收集病毒上清，儲于_80°C冰箱備用；用(I)建立的高表達海腎熒光素酶的人肝癌HCCLM3細胞鋪六孔板,密度為IX IO5細胞/孔,用于病毒感染；待病毒上清常溫化凍后，混合2毫升不含抗生素的全培養基和I毫升病毒上清加入高表達熒光素酶HCCLM3細胞孔內，并加入polybrene 24 μ g/孔，1600rpm, 37°C離心I小時；離心結束后換新鮮全培養基2毫升/孔，繼續置于37°C培養箱進行培養；48小時后向上述病毒感染后的HCCLM3細胞中加入puromycin進行藥篩共計3天，以得到穩定表達海腎突光素酶和過表達miR-885_5p的人肝癌HCCLM3細胞，簡稱HCCLM3/luci-miR-885-5p細胞。通過核酸雜交技術對細胞中的miR-885-5p的含量進行檢測，檢測結果表明與未導入miR-885_5p的HCCLM3/luci細胞相比，HCCLM3/luci-miR-885-5p細胞中，miR-885_5p的表達明顯增加。(3) N0D/SCID小鼠原位肝癌模型的建立 分別用胰酶消化生長良好的人肝癌HCCLM3/luci或HCCLM3/luci-miR-885_5p細胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培養基重懸至3. 75 X IO7細胞/I. 2毫升；對5-6周NOD/SCID雄性小鼠右側背部皮下注射上述處理好的細胞200 μ 1，10天后可見小鼠右側背部可見瘤體形成，N0D/SCID小鼠皮下成瘤的模型建成；將瘤體取出剪成直徑為Imm左右大小用穿刺針植入另外4-6周的雄性N0D/SCID小鼠肝內。過表達miR-885_5p和陰性對照NOD/SCID小鼠原位肝癌模型形成。(4)體內化學發光成像監測腫瘤病灶生長情況向(3)中N0D/SCID小鼠腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分鐘后利用Xenogen IVIS Lumina II活體成像系統檢測化學發光信號，曝光時間根據情況設為5-30秒；檢測結果如圖3、4所示。從圖4顯示的結果可以看出，與陰性對照組相比，過表達miR-885-5p的實驗組中腫瘤病灶的生長明顯減弱。(5) H&E染色檢測N0D/SCID小鼠肝癌向肺轉移情況N0D/SCID小鼠原位肝癌模型建成8周后，將小鼠處死，將肺臟取出用多聚甲醛固定作石蠟切片，H&E染色后，顯微鏡觀察肺部腫瘤結節。H&E染色步驟具體如下ニ甲苯10分鐘；ニ甲苯10分鐘；無水こ醇5分鐘；無水こ醇10分鐘；95%こ醇3分鐘；80%こ醇5分鐘；自來水洗2分鐘；蒸餾水洗I分鐘；蘇木素染色4分鐘；7jC洗2分鐘；O. 5%的鹽酸酒精分化2秒鐘；水洗2分鐘O. 5%的氨水反藍10秒鐘；自來水洗2分鐘；蒸餾水洗I分鐘；伊紅染色50秒；80%こ醇蘸ー下；5%こ醇蘸ー下；無水こ醇3分鐘；無水こ醇10分鐘；ニ甲苯5分鐘；ニ甲苯10分鐘；中性樹膠封片。檢測結果如圖5、6所示。從圖5、6的結果可以看出與對照組相比，過表達miR-885-5p的實驗組中發生肺部轉移機率明顯低于對照組。*p〈0. 05。
權利要求
1.miRNA-885-5p模擬物在制備用于治療肝癌的藥物中的用途，其特征在于所述的模擬物包含雙鏈RNA，其中雙鏈RNA的正義鏈的具體序列為5’ UCCAUUACACUACCUGCCUCU3’，反義鏈的具體序列為5’ AGAGGCAGGTAGTGTAATGGA3’。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述藥物用于抑制肝癌生長。
3.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述藥物用于抑制肝癌發生轉移。
4.根據權利要求I或2所述的用途，其特征在于所述藥物還包括藥學上可接受的載體，其中所述載體是注射溶媒、等滲調節劑、PH調節劑、穩定劑、保護劑。
5.根據權利要求I或2所述的用途，其特征在于所述藥物是注射劑，所述注射劑是溶液型、混懸型或乳劑型。
6.根據權利要求4或5所述的用途，其特征在于所述藥物可以通過皮下注射、肌肉注射、靜脈注射或靜脈滴注的方式給藥。
全文摘要
本發明提供了一種新的抑制原發性肝癌生長和轉移的生物治療方法，所述方法以miRNA-885-5p作為靶點，通過瘤內注射合成的miRNA-885-5p的模擬物來抑制肝臟腫瘤的生長。
文檔編號A61P35/00GK102727909SQ20121022221
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月28日 優先權日2012年6月28日
發明者張竹紅, 田亞平 申請人:中國人民解放軍總醫院