一種斑馬魚高脂血癥模型的建立方法及其應用的制作方法

專利名稱：一種斑馬魚高脂血癥模型的建立方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物模型構建領域，具體涉及一種斑馬魚高脂血癥模型的建立方法及其應用。
背景技術：
脂肪代謝或運轉異常使血漿一種或多種脂質高于正常的疾病稱為高脂血癥。高脂血癥是一種全身性疾病，指血中膽固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)過高或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)過低，現代醫學稱之為血脂異常[1]。大量的流行病學調查和研究表明，高脂血癥是動脈粥樣硬化、冠心病和腦血管病發病的最重要危險因素。高脂血癥也是高血壓、糖耐量異常、糖尿病的一個重要危險因素。 高脂血癥還可導致脂肪肝、肝硬化、膽石癥、胰腺炎、眼底出血、失明、周圍血管疾病、跛行、高尿酸血癥[1]。根據近年衛生部在全國范圍內進行的中國居民營養與健康狀況調查顯示，18歲以上居民總患病率為18.6%，全國患者總人數達1.6億。降脂藥可降低這些疾病的發生率和死亡率，對心腦血管疾病的防治產生積極、深遠的影響。目前臨床應用和處在研發階段的降脂藥物按其降脂機理和化學結構可分為他汀類，煙酸類，貝特類，膽酸鰲合劑類，多烯類，中藥類等；但現有的降脂藥物存在著或療效不佳，或毒副作用較大或費用高等問題，因此開發新的降脂藥物顯得非常必要[2]。研發新的降脂藥物是目前國際國內新藥研發的熱點和難點，選擇理想的高脂血癥動物模型是降脂藥物研發成功的關鍵。目前用于高脂血癥的體外模型主要是利用參與高脂血癥形成的細胞，例如巨噬細胞，在高脂血癥并發癥動脈粥樣硬化發生前，巨噬細胞會聚集在動脈，這個過程是在內皮粘附因子ICVM和ECVM促進下進行的。在低密度脂蛋白(LDL)作用下，巨噬細胞會變為泡沫細胞。可以利用這一過程進行降脂藥物的篩選。目前研究表明他汀類藥物可以抑制這一過程的發生。除了巨噬細胞外，T淋巴細胞，NK細胞，脂肪細胞，肝細胞，肥大細胞等都可以用來篩選降血脂藥物[3]。但細胞培養體系的建立耗時較長，方法不穩定，重復性差，并且體外細胞缺少藥物在生物整體的代謝轉化和體內的循環分布，不能反映藥物在體內的真實情況。目前用于高脂血癥模型的動物有大鼠、小鼠、兔、金黃地鼠、豚鼠、懸猴、非洲綠猴以及恒河猴等，其他還有用鵪鶉、雞、鴿子建立高脂血癥模型。這些動物高脂血癥模型的建立方法主要是利用高脂飼料如膽固醇、豬油、膽酸鈉、蛋黃粉等喂養動物。雖然上述造模方法效果較好，但耗時較長，花費大，不適于高通量快速篩選[3]。建立一種能很好的模擬藥物在體內的過程，又能快速方便的評價與篩選高脂血癥治療藥物的動物模型具有重要的應用價值。斑馬魚是一種新穎的模式生物。與傳統的體內和體外篩選模型相比較，活體斑馬魚篩選模型具有諸多優勢，克服了原有體外模型在吸收、分布、代謝和排泄環節驗證的欠缺及傳統體內篩選模型實驗周期長、操作復雜、成本高的弊端。斑馬魚是一種脊椎動物，與人類基因的相似度高達85%左右，實驗結果可比性強。與鼠類等哺乳動物相比，斑馬魚胚胎透明，可同時觀察分析多個器官，實驗周期短，樣本容量大，結果可信度高，所需費用低[4]。更重要的是，斑馬魚模型具有與生俱來的優點M:①飼養成本低，性成熟周期短；②繁殖能力強，一尾雌魚每次可產200 300枚卵；③生長發育速度快，在受精后24小時，斑馬魚主要的組織器官基本已形成，可為研究提供大量的樣本和較短的實驗周期；④胚胎及幼魚透明，體外受精，體外發育，可直接觀察，并可同時分析多個器官系統；⑤胚胎有可以提供營養的卵黃囊，第一周內不需喂食，可避免化合物處理時化合物與食物成份的相互作用胚胎體積小，幼魚體長只有I 4mm，能夠在一個標準的6、12、24、48或96孔板內進行分析；⑦給藥方式簡單溶于水的小分子物質可直接經皮膚、鰓及消化系統進入斑馬魚體內；不溶于水的物質、大分子物質及蛋白質可進行顯微注射。因此斑馬魚可作為很好的評價與篩選藥物的高通量體內脊椎動物模型。國內外學者已經應用斑馬魚研究營養物質如脂類、糖類的代謝吸收。HOlttS-Vuori等[5’6]利用斑馬魚研究脂類的代謝。Konstantin等m利用斑馬魚研究脂類物質在血管內的聚集和氧化。Baek等M利用高膽固醇飼料喂食斑馬魚，建立高膽固醇模型，但是該文章中高膽固醇模型的建立耗時長，膽固醇分析使用裂解后的斑馬魚，檢測過程繁瑣，易出現假陽性或假陰性，不適于降脂藥物篩選。Clifton等[9]利用斑馬魚熒光染料篩 選新的脂肪吸收抑制劑，在文章中作者提到用蛋黃粉和藥物共同處理斑馬魚，之后進行脂肪染色，觀察藥物的抑制脂肪吸收效果；在該文中，作者并沒有建立斑馬魚高脂血癥模型，對實驗結果也只是定性地觀察，并沒有建立藥效學定量評價方法。雞蛋黃粉是采用新鮮雞蛋為原料，經過抽檢驗照，洗蛋、消毒、噴淋、吹干、打蛋、分離、過濾、均質、巴氏殺菌、噴霧、干燥等10多道工序制成，是新鮮雞蛋的最為理想的替代品。在蛋黃粉中脂肪的含量> 60%，并且蛋黃粉具有較好的乳化性，是建立斑馬魚高脂血癥模型的理性飼料(圖I)。油紅0(0il Red O)和尼羅紅(nile red)都已經被證明是脂肪特異性染料，可以特異性地與脂肪結合，將脂肪染成紅色(圖2)。用油紅O或和尼羅紅對斑馬魚進行染色，斑馬魚血液中的脂肪含量越高，則染色后的血液就越紅；斑馬魚血液中的脂肪含量越低，則染色后血液顏色就越淺[9a°]。

發明內容
為了克服上述現有技術的缺陷和不足，發明人經研究，旨在提供一種簡單、快速、經濟、高通量的斑馬魚模型體內快速篩選和評價降血脂藥物的方法。本發明是通過以下技術方案實現的I. 一種斑馬魚高脂血癥模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟(I)斑馬魚選取挑取發育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)用雞蛋黃粉喂養斑馬魚移除微孔板中的培養液，設置多個實驗組若干個不同濃度的雞蛋黃粉喂食組和I個空白對照組，每個實驗組根據微孔板的規格分別加入相同體積的相應溶液，然后恒溫培養。優選的，還包括以下幾個步驟(3)斑馬魚組織化學染色或熒光染色；
(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統計學分析。優選的，步驟(I)中挑選的斑馬魚為受精后6-7天的斑馬魚；優選的，步驟⑵中斑馬魚培養時間為72小時；優選的，空白對照組使用的溶液為斑馬魚養殖用水，此養殖用水溶解氧濃度為
6-8mg/L、水溫為 28°C、pH 為 7. 2-7. 6、總硬度為 200_250mg/L ；優選的，斑馬魚恒溫培養的溫度為28°C ；優選的，斑馬魚組織化學染色或熒光染色包括以下步驟1)固定，2)脫水，3)染色，4)脫色，5) PBST洗脫； 優選的，圖像分析具體步驟為斑馬魚組織化學染色或活體斑馬魚熒光染色結束后，在顯微鏡下拍照并保存圖片；一方面通過觀察斑馬魚血液中脂肪染色強度來進行定性評價；另一方面利用軟件對斑馬魚尾部血管進行圖像分析，通過計算斑馬魚尾部血管的脂肪染色強度來進行定量評價；優選的，微孔板分析具體步驟為斑馬魚熒光染色后，將斑馬魚轉入96孔板中，每孔I尾，然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度；優選的，統計學分析步驟為統計學處理結果以X士SE表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗進行統計學處理，p < O. 05為差異性顯著。優選的，斑馬魚組織化學染色或熒光染色具體步驟如下I)固定移除微孔板中的雞蛋黃粉培養液，加入4%多聚甲醛(PFA)對斑馬魚進行固定，需室溫固定4小時(h)以上或者4°C固定過夜；2)脫水①室溫下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脫水10分鐘；②室溫下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脫水10分鐘；③室溫下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脫水10分鐘；④室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫水10分鐘；3)染色A:組織化學染色用1%油紅O染色液進行染色，28°C過夜；B :熒光染色用10ng/mL尼羅紅染色液進行染色，28°C過夜；4)脫色①室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫色10分鐘；②室溫下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脫色10分鐘；③室溫下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脫色10分鐘；④室溫下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脫色10分鐘⑤室溫下，在IOml的100% PBS，脫色10分鐘；5) PBST 洗脫室溫下用PBST洗脫15min，重復4次。2.前述的建立方法得到的斑馬魚高脂血癥模型用于高血脂疾病研究的用途。
3.前述的建立方法得到的斑馬魚高脂血癥模型用于評價或篩選降血脂藥物的用途。優選的，還包括以下步驟(3)化合物處理移除微孔板中的雞蛋黃粉培養液，設置多個實驗組若干個化合物處理組、I個模型組、I個陽性對照組、I個溶劑對照組和I個空白對照組，每個實驗組根據微孔板的規格分別加入相同體積的相應溶液，然后恒溫培養；(4)斑馬魚組織化學染色或突光染色；(5)圖像分析和/或微孔板分析；(6)統計學分析。優選的，步驟(3)中化合物處理組加入的溶液為待測化合物溶液，陽性對照組加入的溶液為降血脂藥物溶液，溶劑對照組中加入的溶液為O. 1%的DMSO ；優選的，斑馬魚組織化學染色或熒光染色包括以下步驟1)固定，2)脫水，3)染色，4)脫色，5) PBST洗脫；優選的，圖像分析具體步驟為斑馬魚組織化學染色或活體斑馬魚熒光染色結束后，在顯微鏡下拍照并保存圖片；一方面通過觀察斑馬魚血液中脂肪染色強度來進行定性評價；另一方面利用軟件對斑馬魚尾部血管進行圖像分析，通過計算斑馬魚尾部血管的脂肪染色強度來進行定量評價；優選的，微孔板分析具體步驟為斑馬魚熒光染色后，將斑馬魚轉入96孔板中，每孔I尾，然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度；優選的，統計學分析步驟為統計學處理結果以X士SE表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗進行統計學處理，p < O. 05為差異性顯·著。優選的，化合物處理后的斑馬魚培養時間為72小時。優選的，斑馬魚組織化學染色或熒光染色具體步驟如下I)固定移除微孔板中的雞蛋黃粉培養液，加入4%多聚甲醛(PFA)對斑馬魚進行固定，需室溫固定4小時(h)以上或者4°C固定過夜；2)脫水⑤室溫下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脫水10分鐘；⑥室溫下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脫水10分鐘；⑦室溫下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脫水10分鐘；⑧室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫水10分鐘；3)染色A :組織化學染色用I %油紅O染色液進行染色，28°C過夜；B :熒光染色用10ng/mL尼羅紅染色液進行染色，28°C過夜；4)脫色⑥室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫色10分鐘；⑦室溫下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脫色10分鐘；
⑧室溫下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脫色10分鐘；⑨室溫下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脫色10分鐘⑩室溫下，在IOml的100% PBS，脫色10分鐘；5) PBST 洗脫室溫下用PBST洗脫15min，重復4次。本發明提供的斑馬魚高脂血癥模型與以往的動物高脂血癥模型相比，本發明具有如下優點I)活體內一實驗材料為活體斑馬魚，作為一種脊椎動物，其篩選模型屬體內模型，能夠真實反映藥物在體內的吸收、分布、代謝與排泄，真正反映藥物的整體生物活性。
2)高通量-斑馬魚幼魚很小，只有1-4毫米，能夠在一個標準的6，12，24，48孔板內進行分析和實驗周期短使斑馬魚成為一種能進行高通量藥物篩選的理想模型。3)經濟-所需費用低，以猴子為實驗載體的篩選實驗每只每天耗費大于10美元，以老鼠為實驗載體的篩選實驗每只每天耗費大于I美元，而以斑馬魚為實驗載體的篩選實驗每只每天耗費小于0.01美元。4)化合物用量少-檢測化合物用量少，通常只需幾毫克，而傳統的篩選實驗則需幾毫克以上的化合物。5)簡便-實驗過程操作簡單，斑馬魚經藥物處理、染色后便可進行定量與定性分析，而傳統實驗操作過程復雜，容易產生假陽性結果。6)快速-實驗周期短，可在一周內完成；而老鼠常需要數周到數月的時間，猴子常需要數月至數年的時間。斑馬魚在第一個72小時以內完成胚胎發育。多數的內部器官，包括心血管系統、腸、肝臟和腎，在24-48小時內快速成型，傳統的實驗載體老鼠和猴子則分別需要21天和9個月方可完成胚胎發育。7)高效-斑馬魚胚胎及幼魚透明，可同時觀察多個器官系統，實驗分析方法簡單、快速。8)可靠的預測性-斑馬魚的基因與人類基因的相似度高達85%左右，其生物學功能與哺乳動物及人類高度相似，實驗結果可比性強，預測性好。9)直觀性強-胚胎及幼魚透明，可直接置于立體顯微鏡下觀察對比各實驗組斑馬魚染色強度。10)穩定性高、重復性好-本發明重復實驗十幾次，所獲實驗結果基本相同。本發明應用價值斑馬魚高脂血癥模型具有可靠、快速、高效、低廉、高性價比等優點，本模型可用于高血脂疾病研究以及篩選降血脂藥物。本發明對加快降血脂藥物的研發及改善高脂血癥患者的治療具有意義重大。發明詳述本發明的目的在于提供一種斑馬魚高脂血癥模型的構建方法及其應用。本發明提供的方法具有簡便、快速、經濟、高效、高通量等優點。一、本發明提供一種斑馬魚高脂血癥模型的建立方法，具體步驟為I.斑馬魚選取取4 5對斑馬魚親本交配,按照Westerfieldtici]的方法孵化胚胎。將處于最佳處理階段的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發育正常的斑馬魚移入6、12、24、48、96孔微孔板中，根據微孔板規格放入不同數量的斑馬魚。2雞蛋黃粉喂養斑馬魚設置5個實驗組4個雞蛋黃粉喂食組、I個不喂食組。移除微孔板中的養殖用水，雞蛋黃粉濃度分別為O. 01%,O. 05%,O. 1%和O. 5% ;空白對照組中加入等體積的養殖用水。于28 °C恒溫培養箱中培養。3斑馬魚組織化學染色或熒光染色I)固定移除微孔板中的雞蛋黃粉培養液，加入4%多聚甲醛(PFA)對斑馬魚進行固定，需 室溫固定4小時(h)以上或者4°C固定過夜。2)脫水①室溫下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脫水10分鐘；②室溫下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脫水10分鐘；③室溫下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脫水10分鐘；④室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫水10分鐘。3)染色A :組織化學染色用1%油紅O染色液進行染色，28°C過夜；B :熒光染色用10ng/mL尼羅紅染色液進行染色，28°C過夜。4)脫色(Q)室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫色10分鐘；室溫下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脫色10分鐘；室溫下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脫色10分鐘；@室溫下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脫色10分鐘 室溫下，在IOml的100% PBS，脫色10分鐘。5) PBST 洗脫室溫下用PBST洗脫15min，重復4次。4圖像分析A :斑馬魚組織化學染色結束后，利用解剖顯微鏡觀察、拍照并保存。一方面通過觀察對比各實驗組斑馬魚的血脂染色強度來定性判斷斑馬魚高脂血癥模型是否建立成功；另一方面用圖像處理軟件進行圖像分析，計算斑馬魚尾部血脂染色強度，定量判斷斑馬魚高脂血癥模型是否建立成功。B:斑馬魚熒光染色結束后，利用熒光顯微鏡觀察、拍照并保存。一方面通過觀察對比各實驗組斑馬魚的血脂熒光強度來定性判斷斑馬魚高脂血癥模型是否建立成功；另一方面用圖像處理軟件進行圖像定量分析，計算斑馬魚尾部血脂染色強度，定量判斷斑馬魚高脂血癥模型是否建立成功。5微孔板分析斑馬魚熒光染色后，將斑馬魚轉入96孔板中，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度。將激發光設置為485nm，在525nm處采集發射光的熒光強度，試驗重復3次取其平均值，定量判斷斑馬魚高脂血癥模型是否建立成功。6統計學分析利用JMP8. O軟件對上述圖像分析和微孔板分析所得的血脂相對增加倍數進行統計分析。統計學處理結果以Z士SE表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用Dunnetf s T-檢驗進行統計學處理，P < O. 05為差異性顯著。根據統計學處理結果來評價斑馬魚高脂血癥模型是否建立成功。二、本發明提供一種評價與篩選降血脂藥物的方法，設計方案為I斑馬魚選取
將處于最佳處理階段的斑馬魚置于解剖顯微鏡下觀察，挑取發育正常的斑馬魚移入6、12、24、48、96或384孔板中，根據微孔板規格放入不同數量的斑馬魚。2雞蛋黃粉喂養斑馬魚設置7個實驗組,移除微孔板中的養殖用水，加入O. 5 %的雞蛋黃粉培養液，于28 V恒溫培養箱中培養。3化合物處理設置7個實驗組4個化合物處理組、I個陽性對照組、I個溶劑對照組、I個空白對照組。微孔板每個孔中放入高脂血癥模型斑馬魚，移除微孔板中的養殖用水，4個化合物處理組的化合物溶液濃度分別為O. 01 μ g/ml、0. I μ g/ml、l μ g/ml和10 μ g/ml ;陽性對照組中加入高脂血癥治療藥物；溶劑對照組中加入等體積濃度為O. 1%的DMSO ;空白對照組中加入等體積的養殖用水。按照最佳處理時間長度于28°C恒溫培養箱中培養。4斑馬魚組織化學染色或突光染色實驗方法同發明內容一中的斑馬魚組織化學染色或熒光染色步驟。5圖像分析A :斑馬魚組織化學染色結束后，利用解剖顯微鏡觀察、拍照并保存。一方面通過觀察對比各實驗組斑馬魚的血脂染色強度來定性評價與篩選降血脂藥物；另一方面用圖像處理軟件進行圖像分析，計算斑馬魚尾部血脂染色強度。B:斑馬魚熒光染色結束后，利用熒光顯微鏡觀察、拍照并保存。一方面通過觀察對比各實驗組斑馬魚的血脂熒光強度來定性評價與篩選降血脂藥物；另一方面用圖像處理軟件進行圖像定量分析，計算斑馬魚尾部血脂染色強度。根據待測化合物處理組斑馬魚的血脂降低率來評價待測化合物的降血脂效果，血脂降低率計算公式見(a)。
化合物處理組血脂染色雖度、,,
月曰削氏率()_( 溶劑組血脂染色強度)Xl00% U)6微孔板分析斑馬魚熒光染色后，將斑馬魚轉入96孔板中，每孔I尾。然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度。將激發光設置為485nm，在525nm處采集發射光的熒光強度，試驗重復3次取其平均值，血脂降低率計算公式見(b)。
權利要求
1.一種斑馬魚高脂血癥模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)斑馬魚選取 挑取發育正常的斑馬魚放入微孔板中； (2)用雞蛋黃粉喂養斑馬魚 移除微孔板中的培養液，設置多個實驗組若干個不同濃度的雞蛋黃粉喂食組和I個空白對照組，每個實驗組根據微孔板的規格分別加入相同體積的相應溶液，然后恒溫培養。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，還包括以下幾個步驟 (3)斑馬魚組織化學染色或熒光染色； (4)圖像分析和/或微孔板分析； (5)統計學分析。
3.如權利要求I或2所述的建立方法，其特征在于優選的，步驟(I)中挑選的斑馬魚為受精后4-7天的斑馬魚； 優選的，步驟(2)中斑馬魚培養時間為72小時； 優選的，空白對照組使用的溶液為斑馬魚養殖用水，此養殖用水溶解氧濃度為6-8mg/L、水溫為 28°C、pH 為 7. 2-7. 6、總硬度為 200_250mg/L ； 優選的，斑馬魚恒溫培養的溫度為28°C。
4.如權利要求2或3所述的建立方法，其特征在于 優選的，斑馬魚組織化學染色或熒光染色包括以下步驟1)固定，2)脫水，3)染色，4)脫色，5) PBST洗脫； 優選的，圖像分析具體步驟為斑馬魚組織化學染色或活體斑馬魚熒光染色結束后，在顯微鏡下拍照并保存圖片；一方面通過觀察斑馬魚血液中脂肪染色強度來進行定性評價；另一方面利用軟件對斑馬魚尾部血管進行圖像分析，通過計算斑馬魚尾部血管的脂肪染色強度來進行定量評價； 優選的，微孔板分析具體步驟為活體斑馬魚熒光染色后，將斑馬魚轉入96孔板中，每孔I尾，然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度； 優選的，統計學分析步驟為統計學處理結果以J 表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗進行統計學處理，p < O. 05為差異性顯著。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于斑馬魚組織化學染色或熒光染色具體步驟如下 1)固定 移除微孔板中的雞蛋黃粉培養液，加入4%多聚甲醛(PFA)對斑馬魚進行固定，需室溫固定4小時(h)以上或者4°C固定過夜； 2)脫水 ①室溫下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脫水10分鐘； ②室溫下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脫水10分鐘； ③室溫下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脫水10分鐘； ④室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫水10分鐘；3)染色 A :組織化學染色用1%油紅O染色液進行染色,28°C過夜； B :熒光染色用10ng/mL尼羅紅染色液進行染色，28°C過夜； 4)脫色 ①室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫色10分鐘； ②室溫下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脫色10分鐘； ③室溫下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脫色10分鐘； ④室溫下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脫色10分鐘 ⑤室溫下，在IOml的100%PBS，脫色10分鐘； 5)PBST洗脫 室溫下用PBST洗脫15min，重復4次。
6.權利要求1-5所述建立方法得到的斑馬魚高脂血癥模型用于高血脂疾病研究的用途。
7.權利要求I或3所述建立方法得到的斑馬魚高脂血癥模型用于評價或篩選降血脂藥物的用途。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于還包括以下步驟 (3)化合物處理 移除微孔板中的雞蛋黃粉培養液，設置多個實驗組若干個化合物處理組、I個模型組、I個陽性對照組、I個溶劑對照組和I個空白對照組，每個實驗組根據微孔板的規格分別加入相同體積的相應溶液，然后恒溫培養； (4)斑馬魚組織化學染色或熒光染色； (5)圖像分析和/或微孔板分析； (6)統計學分析。
9.如權利要求8所述的建立方法，其特征在于 優選的，步驟(3)中化合物處理組加入的溶液為待測化合物溶液，陽性對照組加入的溶液為降血脂藥物溶液，溶劑對照組中加入的溶液為O. 1%的DMSO ； 優選的，斑馬魚組織化學染色或熒光染色包括以下步驟1)固定，2)脫水，3)染色，4)脫色，5) PBST洗脫； 優選的，圖像分析具體步驟為斑馬魚組織化學染色或活體斑馬魚熒光染色結束后，在顯微鏡下拍照并保存圖片；一方面通過觀察斑馬魚血液中脂肪染色強度來進行定性評價；另一方面利用軟件對斑馬魚尾部血管進行圖像分析，通過計算斑馬魚尾部血管的脂肪染色強度來進行定量評價； 優選的，微孔板分析具體步驟為活體斑馬魚熒光染色后，將斑馬魚轉入96孔板中，每孔I尾，然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測熒光強度； 優選的，統計學分析步驟為統計學處理結果以I土SE表示，多組間比較采用單因子方差分析，兩組間比較采用Dunnett’ s T-檢驗進行統計學處理，p < O. 05為差異性顯著。
優選的，化合物處理后的斑馬魚培養時間為72小時。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于斑馬魚組織化學染色或熒光染色具體步驟如下 1)固定 移除微孔板中的雞蛋黃粉培養液，加入4%多聚甲醛(PFA)對斑馬魚進行固定，需室溫固定4小時(h)以上或者4°C固定過夜； 2)脫水 ⑤室溫下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脫水10分鐘； ⑥室溫下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脫水10分鐘； ⑦室溫下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脫水10分鐘； ⑧室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫水10分鐘； 3)染色 A :組織化學染色用1%油紅O染色液進行染色,28°C過夜； B :熒光染色用10ng/mL尼羅紅染色液進行染色，28°C過夜； 4)脫色 ⑥室溫下，在IOml的100%丙二醇，脫色10分鐘； ⑦室溫下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脫色10分鐘； ⑧室溫下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脫色10分鐘； ⑨室溫下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脫色10分鐘 ⑩室溫下，在IOml的100%PBS，脫色10 分鐘； 5)PBST洗脫 室溫下用PBST洗脫15min，重復4次。
全文摘要
本發明涉及一種斑馬魚高脂血癥模型的構建方法，并利用該動物模型進行高血脂疾病研究以及篩選降血脂藥物。模型的構建方法主要包括斑馬魚選取，用蛋黃粉喂養斑馬魚，斑馬魚組織化學染色或熒光染色，圖像分析和/或微孔板分析，統計學分析幾個步驟。本發明的方法具有簡便、快速、經濟、高效、高通量等優點，本模型可用于高血脂疾病研究以及篩選降血脂藥物。本發明對加快降血脂藥物的研發及改善高脂血癥患者的治療具有意義重大。
文檔編號A61K49/00GK102907357SQ20121037760
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者李春啟, 陳汝家, 郭勝亞, 張勇 申請人:杭州環特生物科技有限公司