一組雞Cathelicidins抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：一組雞Cathelicidins抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域,具體地說涉及一組雞Cathelicidins抗菌肽及其制備方法和應用。
背景技術：
近年來，多種傳染性疾病困擾著我國的養殖業，抗生素自發現以來在預防細菌感染、防治畜禽疾病方面發揮了重要作用，對促進畜牧業生產的快速發展起到了巨大的推動作用，但長期大量使用抗生素類藥物使得病原菌逐步產生耐藥性，為疾病防治工作增加了難度。同時，抗生素引發的藥物殘留使得動物性食品的安全性問題日益突出，耐藥質粒容易交叉散播傳給人類，給人類健康和疾病的預防與治療帶來威脅，為此，國際社會提出減少抗生素生長促進劑(AGP)使用量或取消某些抗生素的使用。從2006年I月開始，歐盟全面禁止食品動物使用抗生素類促生長飼料添加劑，并于3月成立預防抗生素抗藥性擴大研究網，隨后日本和韓國等發達國家也建立了相應的條例，國際奧委會也要求北京為2008年奧運會提供符合歐盟要求的抗生素含量極低的安全肉食品。尋求抗生素替代品，研制既能有效防控畜禽疾病、促進動物生長，又無毒副作用、無殘留、不易產生耐藥性的綠色獸藥和飼料添加劑，已成為動物營養、食品加工、新獸藥研發等領域內面臨的重大課題。抗菌肽(antimicrobial peptide)是在誘導條件下,動物免疫防御系統產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質，是宿主免疫防御系統的一個重要組成部分。抗菌肽具有高效、廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陰性菌(G_)、革蘭氏陽性菌(G+)、真菌、原生生物、有被膜的病毒和腫瘤細胞均表現出較強的活性(Jenssen H, et al. PeptideAntimicrobial Agents. Clin Microbiol Rev, 2006，19 (3) :491_511)。而絕大多數抗菌妝對哺乳動物正常細胞無害，具有不同于傳統抗生素的獨特抗菌機制，而且對機體無毒副作用、無殘留，這將為解決細菌對青霉素等傳統抗生素日益增強的耐藥性這一棘手的全球性難題提供新途徑，應用前景十分廣闊。迄今已從包括動物、植物、昆蟲、原核生物等多種生物體內分離、鑒定了千余種抗菌活性肽，有幾十種抗菌肽已進入臨床試驗或臨床前研究階段。目前在家禽體內已發現了三大類抗菌肽，即防御素類(Gallinacin)、Cathelicidin類和肝內表達抗菌肽2 (LEAP-2)。從目前相關研究結果來看，雞防御素在體外對多殺性巴氏桿菌及大腸桿菌、白色念珠菌、腸炎沙門氏菌、空腸彎曲桿菌等均有抑菌作用(Harwig S S，etal. Gallinacins: cysteine-rich antimicrobial peptides of chicken leukocytes. FEBSLett，1994，342(3):281-285;Evans E Wj et al. Antimicrobial activity of chicken andturkey heterophil peptides CHP1，CHP2，THP1，and THP3. Vet Microbiol, 1995，47(3-4):295-303)。
Cathelicidins類抗菌肽是最初被發現于哺乳動物的一類結構多變的抗菌肽，因其在信號肽與成熟肽之間含有一高度保守的Cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidins在體外具有強的廣譜抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌活性，包括抗生素抗性菌，有的在50%血清和生理鹽濃度下仍有殺菌活性。同防御素一樣，Cathelicidins抗菌肽也是宿主防御系統的重要組成部分，但它們通常更耐鹽和溶媒。除了主要的殺滅細菌、真菌和病毒活性外，Cathelicidins還具有對免疫細胞的趨化作用、抑制組織損傷、促進創傷修復、結合內毒素、誘導血管生成等多種生物學功能(Zaiou M, et al. Cathelicidins, essentialgene-encoded mammalian antibiotics. J Mol Med, 2002, 80(9):549-61;RamanathanB, et al. Cathelicidins:microbicidal activity, mechanisms of action, and roles ininnate immunity. Microbes Infect, 2002, 4(3):361-372 ；Carretero M, et al, In vitroand in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37.J Invest Dermatol, 2008，128(1) :223-236.)。由于具有如此廣泛的生物學活性和功能，Cathelicidinds抗菌肽已成為免疫學、分子生物學和生物醫藥領域內的研究熱點，其藥用開發前景十分廣闊。 然而，家禽體內天然抗菌肽的含量極低，分子量小，分離純化困難，無法滿足需要。化學合成與基因工程方法就成為獲得抗菌肽的主要手段，但化學合成抗菌肽成本太高，也難以應用于臨床；因此，通過基因工程的方法在特定宿主內大量表達抗菌肽就成為一條有效的途徑。但由于抗菌肽本身對原核宿主菌有一定的殺傷作用，不適宜在原核系統中直接表達，通常采用融合表達或真核表達等方式。大腸桿菌因其遺傳背景清晰、易于培養、周期短、成本低廉而備受青睞，成為目前應用最為廣泛的外源基因表達宿主之一，多種抗菌多肽通過融合形式在大腸桿菌表達系統中成功表達，產物經處理后可產生抗菌活性。

發明內容
本發明的目的在于提供一組具有很強抗微生物活性的雞抗菌肽Cathelicidinl，2，本發明利用基因工程技術從白來航雞的骨髓組織中克隆出Cathelicidins抗菌肽基因(CathL-1, -2)cDNA片段，并將其成熟肽編碼序列克隆至pET_30a(+)等融合表達載體中，在E. coli Rosetta(DE3)表達菌株中重組表達融合蛋白并對其進行初步鑒定,表達產物以可溶形式存在，不需蛋白酶切割，經親和層析方法即可制備一組具有很強抗微生物活性的雞重組抗菌肽 Cathelicidinl, 2。本發明還公開了該組雞Cathelicidins抗菌肽的氨基酸序列及編碼所述雞Cathelicidins抗菌肽的DNA序列。本發明同時提供了該組雞Cathelicidins抗菌肽的基因工程制備方法和固相化學合成法。本發明還進一步公開了該組雞Cathelicidins重組抗菌肽在制備治療雞細菌感染藥物中的用途。為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案本發明提供的一組Cathelicidins抗菌肽,是白來航雞基因編碼的抗菌肽,屬于家禽Cathelicidins抗菌肽家族，它們的這一系列序列被命名為Cathelicidin I，2，其前體蛋白的氨基酸序列(從氨基端至羧基端)如下
Cathelicidinl (SEQ ID NO. 5)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Cys Ala LeuPro Ala Pro Leu Gly Tyr Ser Gln Ala Leu Ala Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln ArgPro Glu Val Gln Asn Ala Phe Arg Leu Leu Ser Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Asn ValGln Leu Ser Ser Leu His Asn Leu Asn Phe Thr He Met Glu Thr Arg Cys Gln Ala ArgSer Gly Ala Gln Leu Asp Ser Cys Glu Phe Lys Glu Asp Gly Leu Val Lys Asp Cys AlaAla Pro Val Val Leu Gln Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Val Thr Cys Val Asp Ser MetAla Asp Pro Val Arg Val Lys Arg Val Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala GlyTyr Asn Leu Tyr Arg Ala He Lys Lys LysCathelicidin 2 (SEQ ID NO. 10)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Val Cys Ala LeuPro Ala Pro Leu Ser Tyr Pro Gln Ala Leu He Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln Arg Pro Glu Val Gln Asn Ala Phe Arg Leu Leu Ser Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gly ValAsp Leu Ser Thr Leu Arg Ala Leu Asn Phe Thr He Met Glu Thr Glu Cys Thr Pro SerAla Arg Leu Pro Val Asp Asp Cys Asp Phe Lys Glu Asn Gly Val He Arg Asp Cys SerGly Pro Val Ser Val Leu Gln Asp Thr Pro Glu He Asn Leu Arg Cys Arg Asp Ala SerSer Asp Pro Val Leu Val Gln Arg Gly Arg Phe Gly Arg Phe Leu Arg Lys He Arg ArgPhe Arg Pro Lys Val Thr He Thr He Gln Gly SerAlaArg Phe Gly雞抗菌肽Cathelicidinl和Cathelicidin2，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 6 所述。本發明的一組雞Cathelicidins抗菌肽，其編碼基因cathelicidin 1,2,來自于自成年白來航雞骨髓組織中提取總RNA，經反轉錄合成cDNA第一鏈后，再以cDNA為模板，分別用2對基因特異性引物CathLl P1/P2和CathL2 P1/P2進行PCR，擴增產物即為cathelicidinl, 2 cDNA全序列。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段(見圖1)，將目的片段與克隆載體PMD18-T連接并轉化E. coli DH5 α感受態細胞，陽性菌株用Μ13F/R引物測序，得到含cathelicidinl，2開放閱讀框(ORF)的完整核苷酸序列，其ORF序列全長分別為447bp、465bp，其自5’端至3’端的序列詳見序列表(SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 6)。本發明提供的一組雞Cathelicidins抗菌肽，其制備方法可以是固相化學合成法，也可以將抗菌肽的編碼基因克隆到表達載體上，然后導入特定的宿主細胞中表達后獲得。其中表達載體可以是質粒或病毒中的一種，宿主細胞可以是原核細胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，宿主細胞也可以是真核細胞、包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。制備的抗菌肽可通過質譜法鑒定。本發明提供一種雞抗菌肽Cathelicidinl，2高效的基因工程制備方法，主要通過以下步驟實現(I)將雞抗菌肽Cathelicidinl和雞抗菌肽Cathelicidin2成熟肽的編碼基因分別克隆到大腸桿菌融合表達載體pET30a ( + )中，得到融合表達載體pET30-CathLlS、pET30-CathL2S ；(2)將 pET30_CathLlS、pET30_CathL2S 質粒分別轉化大腸桿菌 Rosetta(DE3)菌株，得到重組大腸桿菌基因工程菌株；(3)37°C下，在LB培養基中，誘導物IPTG濃度為I. Ommol/L的條件下，對上述重組大腸桿菌基因工程菌進行誘導表達3小時；(4)離心收集上述表達菌體，超聲波破碎，分離細胞可溶組分與包涵體；(5) Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析柱純化融合蛋白。其具體步驟為(I)采用RT-PCR方法從白來航雞骨髓組織中擴增編碼雞抗菌肽Cathelicidinl，
2前體蛋白的核苷酸序列(cDNA序列)，將所述基因分別克隆至pMD-18T載體中，轉化大腸桿菌DH5 α菌株，并進行序列測定；
(2) PCR方法擴增編碼雞抗菌肽Cathelicidinl，2成熟肽的核苷酸序列，PCR產物經EcoRI和Xho I雙酶切后與同樣酶切的pET-30a(+)(或pET_32a(+))融合表達載體連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，小量提取質粒，應用PCR和質粒酶切的方法篩選陽性克隆,通過DNA測序驗證插入片段閱讀框的正確性,從而構建出原核表達載體。將構建的融合表達載體分別命名為pET30-CathLlS、pET30-CathL2S ；(3)將測序正確的重組表達質粒pET30_CathLlS、pET30_CathL2S分別轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，挑取陽性菌株接種至LB培養基中37°C培養8 12h。次日離心取菌體重懸至新鮮LB培養基中，待培養液OD6tltol值達到O. 5^0. 6時加入IPTG使其終濃度為I. Ommol/L,開始進行誘導；37°C繼續培養4h，每隔I小時取樣lmL。離心收集誘導培養后的菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體2次，再加入裂解緩沖液(50mmol/L Tris-HCl, pH
8.O, 50mmol/L NaCI, lmmol/LEDTA, 5%甘油，臨用前加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為lmmol/L)，冰浴中超聲破碎菌體，每次破碎5s，間隔2s，功率600W，破碎lOmin。超聲后12000r/min, 4°C下離心lOmin,分離可溶組分與和包涵體,進行SDS-PAGE電泳和WesternBlot檢測。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%。將pET-30a(+)質粒按同樣方法進行轉化、誘導表達，取3h誘導表達產物(上清)作為對照。Western Blot操作參照《分子克隆實驗指南》中的方法進行。電泳后將SDS-PAGE凝膠中的條帶電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB為顯色底物進行Western-blot分析，鑒定表達產物。(4)融合蛋白表達條件優化與表達產物的親和層析純化通過采用高滲培養基(即LB/SB培養基)、低溫(25°C或15 20°C )長時間誘導、調節誘導物IPTG的濃度等方法，抑制包涵體形成，提高表達產物中可溶性蛋白所占比例。試驗證明，在25°C、IPTG濃度為I. Ommol/L的條件下誘導培養8小時，可溶性目的蛋白所占的比例較37°C條件下明顯提高，利于下游純化操作。按上述優化后的條件進行擴大培養和目的蛋白的誘導表達，取誘導后的菌體，力口入適量結合緩沖液，冰浴中超聲波破碎菌體，分離包涵體和可溶組分，將裂解上清液上樣于固定化金屬配體親和柱層析柱(Ni2+-NTA Sepharose 4B柱),樣品經含O. I "O. 5mol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫，收集融合蛋白洗脫峰進行SDS-PAGE檢測。結果顯示，洗脫液中目的蛋白在目標位置呈現單一條帶，表明經親和層析可獲得純度較高的融合蛋白，為成熟產物的獲得創造條件。(5)采用標準瓊脂孔穴擴散法(AWDA)檢測重組雞抗菌肽Cathelicidin 1,2的對指示菌株的體外抑菌活性。本發明的一組新的雞抗菌肽Cathelicidinl, 2,還可方便地采用固相化學合成方法進行制備。從雞Cathelicidinl抗菌肽核苷酸序列推導出其前體蛋白的氨基酸序列(Seq-Ι)，根據目前對雞Cathelicidins類抗菌肽成熟肽酶切加工位點(彈性蛋白酶切割位點)的認識，即雞體內彈性蛋白酶一般是從該基因第四 個外顯子編碼氨基酸序列中的第一個纈氨酸(Val)位點進行切割加工，釋放出有生物學活性的成熟肽的N-端；結合對信號肽與成熟肽間高度保守的Cathelin結構域肽段的分析，可以推斷在其前體蛋白中，Arg123-Lys 148為雞Cathelicidinl抗菌肽的成熟肽序列(Seq_4)。根據編碼雞Cathelicidinl抗菌肽的核酸序列推導出成熟抗菌肽的氨基酸序列，按照標準固相肽合成程序用全自動多肽合成儀合成其成熟肽序列(其N端至C端的氨基酸序列為Arg Val LysArg Val Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala Gly Tyr AsnLeu Tyr Arg Ala He Lys Lys Lys,見序列表中Seq_4)。合成肽經反相-高壓液相柱層析(RP-HPLC, Column X Bridge 4. 6X 250mm)脫鹽、純化，采用乙腈/水/三氟乙酸系統洗脫，合成肽的樣品純度>95% (95. 4%)。采用電噴霧質譜(ESI-MS)測定其分子量為3142. 80，與理論分子量(3141. 86)基本一致。本發明通過抑菌活性檢測發現，利用Rosetta(DE3)/pET30a表達體系表達的重組Cathelicidins抗菌肽不需酶切等處理，對革蘭氏陽性、陰性菌均有很好的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌C79-13、巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、綠膿桿菌等標準菌株和臨床分離菌株均有較強的抑制作用。與常規藥敏試驗結果比對發現，藤黃微球菌、大腸桿菌等標準菌株對試驗中所使用的大多數抗生素類藥物均耐藥,而重組Cathelicidins抗菌肽對這些菌株卻有明顯的抑制效果。表明重組Cathelicidins抗菌肽對某些細菌菌株的抑制作用在一定程度上可能超過傳統抗生素。本發明通過抗菌肽Cathelicidinl對金黃色葡萄球菌急性感染抑菌活性的雛雞試驗顯示，抗菌肽給予5. Omg/kg劑量，就能達到100%殺菌抑制率，而作為抑殺金黃色葡萄球菌的氨芐青霉素給予5. Omg/kg劑量未能達到明顯的殺菌抑制率，表明本發明抗菌肽對金黃色葡萄球菌急性感染有很顯著的殺菌效果，因此本發明抗菌肽可應用于制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物，尤其是應用于制備治療金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等的藥物。本發明抗菌肽同時還可以用于制備動物飼料添加劑和防腐劑。本發明的有益效果在于(I)本發明選擇大腸桿菌/融合表達載體作為外源基因的原核表達體系，選擇pET30a等融合表達載體，使雞Cathelicidins抗菌肽獲得高效表達，并避免表達產物對宿主細胞造成直接的殺傷性。(2)本發明提供的方法表達效率高，表達產物分離純化簡單，生產成本低，易放大，穩定性好，適用于大規模工業化生產，具有廣闊的應用推廣前景。(3)本發明應用基因工程技術在原核宿主細胞中高效表達雞Cathelicidins抗菌肽，經實驗證實該組抗菌肽對多種革蘭氏陽性菌、陰性菌均有明顯的抑制作用。該組抗菌肽可應用于制備抗菌藥物，或用于制備動物飼料添加劑和防腐劑。(4)與其它來源的堿性抗菌肽相比，該組抗菌肽還具有結構簡單、人工合成方便、抗菌譜系廣等有益特點。


圖I為PCR擴增白來航雞Cathelicidinl，2抗菌肽基因產物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖I中，I為DL15000DNAmarker，其中各核酸片段的堿基數目(數目單位為bp)分別為 15000，10000，7500，5000，2500，1000，250 ;2，3 分別為 Cathelicidin-1，_2cDNA序列的PCR擴增產物；圖中5為DL2000DNA Marker，其中各核酸片段的堿基數目(數目單位為bp)分別為 2000，1000，750，500，250，100。圖2為含雞Cathelicidin-1, -2基因cDNA序列的陽性質粒pMD-CathL酶切后2%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2中I為λ-EcoTHI digest DNA marker，其中各核酸片段的堿基數目(數目單位為 bp)分別為 19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ；2 為質粒pMD-CathLl/EcoR I+Hind III 雙酶切后條帶，3 為質粒 pMD-CathLl/EcoR I+Not I 雙酶切后條帶，4為質粒pMD-CathL2/EcoR Ι+HindIII雙酶切后條帶，5為質粒pMD_CathL2/EcoRI+Sma I雙酶切后條帶，8為DL2000DNAmarker，其中各核酸片段的堿基數目(數目單位為·bp)分別為 2000，1000，750，500，250，100。圖3為重組表達質粒pET30_CathLS酶切后I. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3中I為λ-EcoT14Idigest DNAmarker,其中各核酸片段的堿基數目(數目單位為bp)分別為19329,7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ;2 為質粒 pET-30a Sma I+Xba I 雙酶切后條帶;3 為質粒 pET30-CathLlS Sma I+Xba I 雙酶切后條帶；4 為質粒 pET30_CathL2S SmaI+Xba I雙酶切后條帶。圖4為雞抗菌肽Cathelicidinl，2成熟肽片段融合表達載體pET30_CathLS的構建示意圖。在圖4中，5. 5Kb代表構建的融合表達載體pET30-CathLS大小為5. 5Kb ；P1, P2分別代表Cathe I i c i din I，2cDNA序列克隆所用的上、下游引物；MCS代表多克隆位點；LacZ代表β-半乳糖苷酶的編碼基因；LacI代表Iac阻抑物的編碼基因；CathL代表連接插入克隆載體的Cathelicidinl, 2cDNA序列；CathLS代表連接插入表達載體的Cathelicidinl, 2成熟肽編碼序列；Amp代表氨芐青霉素抗性基因位點；Kan代表卡那霉素抗性基因位點；pUCorigin, florigin, pBR322 origin 均代表復制起始位點。圖5為SDS-PAGE及Western-Blot分析雞Cathelicidinl, 2成熟肽融合蛋白的表達產物圖。其中，左側是SDS-PAGE電泳圖，右側是Western blot圖。泳道I，I’是空載體轉化菌株Rosetta(DE3)/pET30a IPTG誘導3h菌體經超聲破碎后可溶性蛋白；泳道2，2’是預染低分子量標準蛋白質Marker，其中各蛋白片段的分子量分別為117，85，48，34，26，19kDa，KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；泳道3，3’是Rosetta (DE3)/pET30-CathLlS菌株IPTG誘導3h菌體經超聲破碎后可溶性蛋白；泳道4，4’是Rosetta (DE3) /PET30_CathLlS菌株IPTG誘導3h菌體經超聲破碎后包涵體蛋白；泳道5，5’是Rosetta (DE3) /pET30_CathL2S菌株IPTG誘導3h菌體經超聲破碎后可溶性蛋白；泳道6，6’是Rosetta(DE3)/pET30-CathL2S菌株IPTG誘導3h菌體經超聲破碎后包涵體蛋白。圖6.固相化學合成雞抗菌肽Cathelicidinl的反相-高壓液相(RP-PHLC)色譜圖。圖7.固相化學合成雞抗菌肽Cathelicidinl的質譜(ESI-MS)圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規方法如Sambrook等編著的《分子克隆實驗室指南》(Molecular cloning:A laboratorymanual, 2nd ed . New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)中所述的條件進行，或按照制造廠商提供的說明書進行。具體實施例中所使用的工具酶和其他試劑RNAiso Plus總RNA提取試劑、Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase Η-)、核糖核酸酶抑制劑-RNAsin、Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶、PMD18-T Vector、T4DNA連接酶除特別指明外均為TAKARA公司產品；鼠抗His單克隆抗體均購自Tiangen公司；UNIQ_10柱式質粒小量抽提試劑盒和UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒均為上海生工產品；IPTG為BBI公司產品；HRP標記羊抗鼠IgG為SouthernBiotech公司產品；預染蛋白質分子量標準為Fermentas (MBI)公司產品；金屬螯合層析樹脂Ni2+-NTA S印harose4B購自北京鼎國公司；細菌培養用TMP、TSA等固體培養基為青島高科園海博生物技術公司產品，按說明書提供方法制備；常規藥敏試紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產品，其他試劑均為進口或國產分析純。實施例I :雞Cathelicidinl，2抗菌肽完整編碼基因的克隆及測序測定分析，具體包括I.引物的設計根據GenBank中發表的原雞Cathelicidins類抗菌妝基因序列(DQ092350,DQ092351)和PCR引物的設計原則，并借助計算機軟件DNASTAR進行輔助分析，設計了三對PCR基因特異性引物分別用于擴增雞Cathelicidinl，2編碼基因的cDNA序列，引物分別為表中CathLl Pl/P2、CathL2 P1/P2，其中Pl為正向引物，P2為反向引物。引物均由上海博尚公司合成。本實施例和實施例2中所用的引物序列如表I所示。在CathLlS F/R，CathL2S F/R，引物對中，下劃線處的堿基分別代表在上下游引物中引入的EcoR I、Xho I限制性內切酶位點。表I雞Cathelicidins類抗菌肽基因擴增所用引物
權利要求
1.雞抗菌肽Cathelicidin2，其核苷酸序列如SEQID NO. 6所述。
2.雞抗菌肽Cathelicidin2，其特征是，其氨基酸序列如SEQID NO. 10所述。
3.如權利要求I或2所述的雞抗菌肽Cathelicidin2的制備方法,其特征是,所述制備方法為固相化學合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是將雞抗菌肽Cathelicidin2的編碼基因克隆到表達載體上，然后導入宿主細胞中表達；所述表達載體為質粒或病毒中的一種，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
4.如權利要求3所述的雞抗菌肽Cathelicidin2的制備方法，其特征是，所述基因工程方法為 (O將雞抗菌肽Cathelicidin2成熟肽的編碼基因克隆到大腸桿菌融合表達載體pET30a(+)中，得到融合表達載體pET30-CathL2S ； (2)將pET30_CathL2S質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，得到重組大腸桿菌基因工程菌株； (3)37°C下，在LB培養基中，誘導物IPTG濃度為I.OmmoI/L的條件下，對上述重組大腸桿菌基因工程菌進行誘導表達3小時； (4)離心收集上述表達菌體，超聲波破碎，分離細胞可溶組分與包涵體； (5)Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析柱純化融合蛋白。
5.如權利要求4所述的雞抗菌肽Cathelicidin2的制備方法,其特征是， (1) 0 方法擴增編碼雞抗菌肽0&訪611(^也112成熟肽的核苷酸序列，PCR產物經EcoR I和Xho I雙酶切后與同樣酶切的pET-30a(+)融合表達載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，提取質粒，應用PCR和質粒酶切的方法篩選陽性克隆，通過DNA測序驗證插入片段閱讀框的正確性，從而構建出原核表達載體；將構建的融合表達載體命名為pET30-CathL2S； (2)將測序正確的質粒pET30-CathL2S轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，獲得重組表達Cathelicidins2成熟肽融合蛋白的工程菌Rosetta(DE3)/pET30_CathL2S ;挑取工程菌單菌落接種至LB培養基中37°C培養8 12h ;次日離心取菌體重懸至新鮮LB培養基中，待培養液OD6tltol值達到O. 5^0. 6時加入IPTG使其終濃度為I. OmmoI/L,開始進行誘導；37°C繼續培養4h，每隔I小時取樣ImL ;離心收集誘導培養后的菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體2次，再加入裂解緩沖液，冰浴中超聲破碎菌體，每次破碎5s，間隔2s，功率600W，破碎IOmin ；超聲后12000r/min，4°C下離心lOmin，分離可溶組分與和包涵體，進行SDS-PAGE電泳和WesternBlot檢測；電泳后將SDS-PAGE凝膠中的條帶電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗,DAB為顯色底物進行Western_blot分析,鑒定表達產物； (3)然后進行工程菌擴大培養和目的蛋白的誘導表達，條件為:25V、IPTG濃度為I. OmmoI/L的條件下誘導培養8小時；取誘導后的菌體，加入結合緩沖液，冰浴中超聲波破碎菌體，分離包涵體和可溶組分，將裂解上清液上樣于Ni2+-NTA Sepharose 4B親和層析柱，樣品經含O. Γ0. 5mol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫，收集融合蛋白洗脫峰進行SDS-PAGE檢測。
6.如權利要求5所述的雞抗菌肽Cathelicidin2的制備方法,其特征是,所述步驟(I)擴增編碼雞抗菌肽Cathelicidin2成熟肽的核苷酸序列的引物為CathL2S F/R，其中F為正向引物，R為反向引物，所述CathL2S F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17-18所述。
7.如權利要求4-6中任意一項所述的雞抗菌肽Cathelicidin2的制備方法,其特征是，雞抗菌肽雞抗菌肽Cathelicidin2的編碼基因的獲取方法為自成年白來航雞骨髓組織中提取總RNA，經反轉錄合成cDNA第一鏈后，再以cDNA為模板，用I對基因特異性引物CathL2Pl/P2進行PCR，擴增產物即為cathelicidin2cDNA全序列；PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段，將目的片段與克隆載體PMD18-T連接并轉化E. coli DH5a感受態細胞，陽性菌株用M13F/R引物測序，得到含cathelicidin2開放閱讀框的完整核苷酸序列；所述CathL2Pl/P2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所述。
8.權利要求I或2所述的雞抗菌肽Cathelicidin2在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染引起的疾病的藥物中的應用。
9.權利要求I或2所述的雞抗菌肽Cathelicidin2在制備治療金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌或綠膿桿菌感染引起的疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一組雞Cathelicidins抗菌肽及其制備方法和應用。雞抗菌肽Cathelicidin1和Cathelicidin2的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表所示。所述抗菌肽的制備方法為固相化學合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是將雞抗菌肽Cathelicidin1-2成熟肽的編碼基因分別克隆到表達載體上，然后導入宿主細胞中表達。本發明應用基因工程技術在原核宿主細胞中高效表達雞Cathelicidins抗菌肽，經實驗證實該組抗菌肽對多種革蘭氏陽性菌、陰性菌均有明顯的抑制作用。
文檔編號A61K38/17GK102911943SQ20121038442
公開日2013年2月6日 申請日期2010年12月22日 優先權日2010年12月22日
發明者吳靜, 宋敏訓, 李玉峰, 馬秀麗, 姜亦飛, 黃兵, 林樹乾, 于可響 申請人:山東省農業科學院家禽研究所