專利名稱：一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法
一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法技術領域
本發明屬于管狀組織工程支架的制備領域，特別涉及一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法。
背景技術：
人體中含有很多管腔狀組織，如心血管、外周血管、神經導管、食道、腸道、膽管、尿道和骨等，修復這些組織的缺損經常要用到管狀的組織支架。在這些管狀組織的病變中，心血管疾病是威脅人類健康最嚴重的疾病之一，對缺損和嚴重病變的血管通常需施行移植手術。目前，臨床上常用自體血管如大隱、乳內動脈作為移植物。但自體血管來源有限，且自體移植易對人體造成二次損傷。使用異體移植的支架易引起免疫排斥反應。目前比較成熟的方法是應用人工合成的血管假體如膨化聚四氟乙烯(ePTFE)和滌綸(Dacron)作為動脈替代物重建動脈。這些人造血管用于大、中動脈的替代效果令人滿意，但是在用于小口徑 (<6mm)血管替代時，由于人工血管管壁缺少內皮細胞，小口徑血流速度緩慢導致移植早期急性血栓形成，移植后期吻合口內膜增生引起管腔狹窄直至閉塞，通暢率很難達到要求。基于組織工程技術構建的細胞_生物材料復合物,經體外構建后植入體內，與宿主血管組織融合和組織的重塑，恢復血管連續性和血液通暢，被認為是理想的血管替代物。
血管組織工程包括三維支架、種子細胞、必要的生長因子三個部分。其中，血管支架起著支撐細胞生長、引導組織再生、控制組織結構和釋放活性因子等作用，是決定組織工程成敗的關鍵因素之一。理想的血管支架應具備以下特點(1)仿生細胞外基質(ECM)的結構和功能；(2)良好的相容性和可控的降解率；(3)具有一定的孔隙結構；(4)具有與天然血管相匹配的力學性能，便于血液流動；(5)有活性生長因子的釋放。目前臨床上使用的血管支架各具優缺點，如合成的非降解材料不支持內皮細胞的粘附和生長，移植后支架在體內無法被吸收、降解，其構建的血管不是真正意義上的組織工程血管，而自體異體移植的血管由于其來源有限，無法滿足需求。
理想的組織血管支架應能在愈合過程中隨著支架的降解而重塑，從而形成一條與宿主主動脈具有相同機械性能和生物性能的新血管，除了在結構與功能的仿生外，還要有利于細胞的分化，識別，起到缺損血管的重塑過程。為了仿生天然血管的結構與功能，支架的，結構取決于制備方法。從微觀上看，細胞外基質由纖維網狀結構組成(其中膠原纖維的直徑為50-500nm)，因此以亞微米或納米纖維制備的細胞支架最大程度仿生人體內ECM的物理結構。制備納米纖維的結構方法有很多，目前最主要的有靜電紡絲和相分離法。用靜電紡絲的方法可以形成長納米纖維。如中國專利(申請號03137309. 7)公開了一種靜電紡絲制備組織工程支架材料的方法和裝置，這種方法具有材料來源廣泛和易于成型的特點，但通常難以控制其孔隙結構，利用相分離方法在制備三維多孔支架方面具有一定的優勢。相分離技術是制備聚合物多孔材料的重要方法，其過程是在一定條件下將聚合物溶解在適當的溶劑中，保持溶液溫度高于相分離點，高分子鏈在溶劑中充分舒展；當溫度下降到熱力學不穩定區或有非溶劑存在時，溶液發生相分離，形成聚合物貧相和富相；在降溫條件下，聚3合物富相區再將溶劑以凍干或置換的方式脫除，得到多孔聚合物材料。對于半晶態聚合物如PLLA，通過控制溶劑組合、聚合物濃度、熱退火、溶劑交換和冷凍溫度等條件可得到納米纖維多孔支架。
在管狀組織的重建過程中，支架必須提供較大的孔徑以利用細胞的長入，粒子浙濾是最常用的致孔手段。如Ma課題組(Biomaterials，2010，31:7971-7977)用糖球作為致孔劑制備具有大孔連通的納米纖維支架用于血管再生，但這種完全連通的大孔結構不僅犧牲了支架的力學強度，也存在血液滲漏的風險。S. Ramakrishna等 (Polymer, 2009，50:4128-4138)采用二氧六環和水為混合溶劑溶解PLLA，通過熱致相分離制備了大孔納米纖維支架，但單純的PLLA支架脆性較大，難以提供常用管狀組織修復過程中必需的韌性和彈性等力學強度。發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，該方法操作簡單、不需外加致孔劑、可大批量生產、制備成本較低，得到了管狀支架具有孔徑和孔隙率可調的多孔結構，有利于細胞的長入和新生組織的重建。
本發明的一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，包括
(I)將左旋聚乳酸PLLA與其他聚合物于50_70°C溶解于溶劑中，得到均一的聚合物溶液；
(2)將上述聚合物溶液注入到管狀模具中，迅速置于_4°C至_196°C的低溫下使其發生相分離；然后取出，并退去管狀模具外殼，將相分離后的聚合物凝膠與芯部模具一起浸泡于去離子冰水中10-30分鐘，再取出芯部模具，并把繼續將聚合物凝膠浸泡于去離子冰水中交換溶劑48-96小時,每天換2-5次去離子冰水,得到管狀支架；
(3)最后將得到的管狀支架冷凍干燥48-120小時，即得到具有多孔結構的納米纖維管狀支架。
步驟(I)中所述的其他聚合物為聚ε-己內酯(PCL)、聚羥基乙酸(PGA)、 聚-β-羥丁酸(ΡΗΒ)、聚羥基烷基酸酯(ΡΗΑ)、聚癸二酸丙三醇酯(PGS)、聚己內酯-左旋聚乳酸共聚物(PCL-b-PLLA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚氨酯(PU)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、尼龍(Nylon)、聚對苯二甲酸乙二醇酯 (PET)、膠原、明膠、絲蛋白、纖維蛋白原、纖維素、殼聚糖等中的一種。
步驟(I)中所述的左旋聚乳酸與其他聚合物的質量比為6-8:4_2。
步驟(I)中所述的溶劑為水、甲醇、乙醇、己烷、環己烷、叔丁醇、六氟異丙醇、三氟乙醇、1，4-二氧六環、四氫呋喃、N，N-甲基甲酰胺、氯仿、丙酮、二氯甲烷等中的一種或幾種。
步驟(I)中所述的聚合物溶液中聚合物的總濃度為O. 02-0. 2g/mL。
步驟(2)中所述的管狀模具由一端封閉的圓柱狀外殼和帶蓋的桿狀芯部構成，圓柱狀外殼和桿狀芯部的直徑可調，因而制備的管狀支架的厚度和內、外徑可控。
本發明所得到的多孔納米纖維管狀支架的尺寸范圍為內徑2-6cm，厚度O.5-5mm。
本發明所述管狀支架以PLLA為主體材料，得到的支架同時具有多孔結構和納米纖維結構。
本發明公開了一種多孔納米纖維支架制備技術，將一些彈性聚合物或生物相容性較好的聚合物添加到PLLA中，制備了多孔PLLA基復合納米纖維管狀支架，這些成分的加入不僅增加了支架的彈性，也可通過改變材料組成來調節支架的生物相容性和降解性能。由于兩種聚合物凝膠化溫度和時間的差異，部分低含量的聚合物因相分離而形成微球，經適當的處理即可獲得多孔納米纖維結構，這種多孔結構可為細胞長入提供足夠空間，卻不會由于孔道完全聯通導致血液、尿液等的滲漏，其力學性能和微結構可控。更適合組織工程化管腔結構的構建。
本發明所述管狀支架以生物可降解的左旋聚乳酸為主體材料，加入與其不相容的另一種聚合物，控制相分離過程使兩種不相容材料形成“海島”狀結構，支架的孔徑和孔隙率可根據兩種聚合物的比例和相分離條件來調節。
本發明的管狀組織工程支架可用于組織工程心血管、外周血管、神經導管、食道、 腸道、膽管、尿道和骨等管狀組織的構建。采用熱致相分離法制備的多孔納米纖維管狀支架，該方法具有設備要求低、制備過程簡單和不需外加致孔劑等特點。制備的管狀支架不僅具有類似于人體組織細胞外基質的納米纖維結構，還具有孔徑和孔隙率可調的多孔結構， 有利于細胞的長入和新生組織的重建。在相分離體系中加入具有較好力學強度的不相容聚合物能夠提高支架的韌性和彈性，有利于構建管狀組織工程化器官和組織。
有益效果
(I)本發明操作簡單、不需外加致孔劑、可大批量生產、制備成本較低；
(2)本發明在相分離體系中加入具有較好力學強度的不相容聚合物能夠提高支架的韌性和彈性，有利于構建管狀組織工程化器官和組織；
(2)本發明制備的管狀支架不僅具有類似于人體組織細胞外基質的納米纖維結構，還具有孔徑和孔隙率可調的多孔結構，有利于細胞的長入和新生組織的重建。
圖I是制備的多孔納米纖維管狀支架的模具照片；
圖2是制備的管狀支架的光學照片圖3是管狀支架的電鏡照片，(A)圖為管狀支架的橫截面圖，(B)圖為局部放大的 SEM 圖4是管狀支架的紅外光譜圖，其中a是純PLLA的紅外光譜圖，b是PLLA與PCL 比例為70:30的紅外光譜圖，c是純PCL的紅外光譜圖5現實不同混合比例的兩種材料制成支架的孔徑大小及孔體積變化。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例I
以質量比PLLA :PCL=70:30，聚合物總濃度為O. 05g/mL條件下制備具有多孔結構的納米纖維管狀支架。
(I)將PLLA與PCL以70:30比例于55 °C溶解于四氫呋喃中，形成均一溶液；
(2)把聚合物溶液注入到聚四氟乙烯模具中，迅速置于-80°C使其發生相分離過程，過夜；
(3)從低溫中取出，并退去模具外殼，把成凝膠狀的聚合物與芯部模具一起置于去離子冰水中浸泡30分鐘，取出芯部的模具，并把聚合物浸泡于去離子冰水中交換溶劑2天， 每天換三次去尚子冰水；
(4)從去離子水中取出管狀支架，冷凍干燥，即得到具有多孔結構的納米纖維管狀支架。
實施例2
以質量比的PLLA PU=70:30,總聚合物濃度為O. lg/mL條件下制備多孔納米纖維管狀支架。
(I)將PLLA與PU以70:30比例于60°C溶解于四氫呋喃中，形成均一溶液；
(2)把聚合物溶液注入到聚四氟乙烯模具中，迅速置于-100°C使其發生相分離過程，過夜；
(3)從低溫中取出，并退去模具外殼，把成凝膠狀的聚合物與芯部模具一起置于去離子冰水中浸泡30分鐘，取出芯部的模具，并把聚合物浸泡于去離子冰水中交換溶劑3天， 每天換三次去尚子冰水；
(4)從去離子水中取出管狀支架，冷凍干燥，即得到具有多孔結構的納米纖維管狀支架。
實施例3
以質量比的PLLA PLGA=60:40,總聚合物濃度為O. 15g/mL條件下制備多孔納米纖維管狀支架。
(I)將PLLA與PLGA以60:40的比例于70°C溶解于四氫呋喃中，形成均一溶液；
(2)把聚合物溶液注入到聚四氟乙烯模具中，迅速置于-50°C使其發生相分離過程，過夜；
(3)從低溫中取出，并退去模具外殼，把成凝膠狀的聚合物與芯部模具一起置于去離子冰水中浸泡30分鐘，取出芯部的模具，并把聚合物浸泡于去離子冰水中交換溶劑3天， 每天換三次去尚子冰水；
(4)從去離子水中取出管狀支架，冷凍干燥，即得到具有多孔結構的納米纖維管狀支架。
權利要求
1.一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，包括(1)將左旋聚乳酸PLLA與聚合物于50-70°C溶解于溶劑中，得到均一的聚合物溶液；(2)將上述聚合物溶液注入到管狀模具中，迅速置于-4°C至-196°C下使其發生相分離；然后取出，并退去管狀模具外殼，將相分離后的聚合物凝膠與芯部模具一起浸泡于去離子冰水中10-30分鐘，再取出芯部模具，并把繼續將聚合物凝膠浸泡于去離子冰水中交換溶劑48-96小時，每天換2-5次去離子冰水，得到管狀支架；(3)最后將得到的管狀支架冷凍干燥48-120小時，即得到具有多孔結構的納米纖維管狀支架。
2.根據權利要求I所述的一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，其特征在于步驟 (I)中所述的聚合物為聚ε-己內酯、聚羥基乙酸、聚-β-羥丁酸、聚羥基烷基酸酯、聚癸二酸丙三醇酯、聚己內酯-左旋聚乳酸共聚物、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚氨酯，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、聚對苯二甲酸乙二醇酯、膠原、明膠、絲蛋白、纖維蛋白原、纖維素、殼聚糖中的一種。
3.根據權利要求I所述的一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，其特征在于步驟 (O中所述的左旋聚乳酸與聚合物的質量比為6-8:4-2。
4.根據權利要求I所述的一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的溶劑為水、甲醇、乙醇、己烷、環己烷、叔丁醇、六氟異丙醇、三氟乙醇、1，4-二氧六環、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、氯仿、丙酮、二氯甲烷中的一種或幾種。
5.根據權利要求I所述的一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，其特征在于步驟 (O中所述的聚合物溶液中聚合物的總濃度為O. 02-0. 2g/mL。
6.根據權利要求I所述的一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的管狀模具由一端封閉的圓柱狀外殼和帶蓋的桿狀芯部構成，圓柱狀外殼和桿狀芯部的直徑可調。
全文摘要
本發明涉及一種多孔納米纖維管狀支架的制備方法，包括(1)將左旋聚乳酸PLLA與其他聚合物溶解于溶劑中，得到聚合物溶液；(2)將上述聚合物溶液注入到管狀模具中，迅速置于低溫下使其發生相分離；然后取出，并退去管狀模具外殼，將相分離后的聚合物凝膠與芯部模具一起浸泡于冰水中，再取出芯部模具，并把繼續將聚合物凝膠浸泡于去離子冰水中交換溶劑，得到管狀支架；(3)最后將得到的管狀支架冷凍干燥48-120小時，即得。本發明操作簡單、不需外加致孔劑、可大批量生產、制備成本較低；本發明制備的管狀支架具有類似于人體組織細胞外基質的納米纖維結構，還具有孔徑和孔隙率可調的多孔結構，有利于細胞的長入和新生組織的重建。
文檔編號A61L27/18GK102908208SQ201210384648
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者何創龍, 胡金偉, 程曉, 王偉忠 申請人:東華大學