專利名稱：一種組織引導再生用膠原基復合生物膜的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種組織引導再生用膠原基復合生物膜的制備方法。
背景技術：
牙周引導組織再生技術(guided tissue regeneration, GTR)是目前國際上治療牙周病最先進的技術。GTR的概念是1982年由Nymans等(Nyman S.Lindhe J.KarringT，et al.Clin Periodontol.1982; 9 (4):290-296)首先提出，基本原理是以屏障膜作為空間隔離，在防止牙齦結締組織細胞和結合上皮細胞向根方遷移的同時，選擇性地使牙周膜細胞和牙槽骨細胞粘附于根面分化形成牙周新附著。這種方法被證明在治療骨內和根尖疾病時較開放皮瓣清創術更能有效的獲得臨床附著和降低探診深度(Kim YK, Yun PY, KimSG, et al, Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.2009;107: 5-11)。引導膜是GTR技術的核心，隨著GTR技術在臨床越來越廣泛的運用，引導膜的類型和性能已經成為制約其發展的關鍵因素。根據臨床需要，一種有效的引導膜應該具有適當的機械強度，以阻擋生長快速的修復組織(上皮和牙齦結締組織)遠離牙根表面，在根面維持一個受保護的空間；同時該材料應能夠較好地引導牙槽骨細胞生長、分泌，形成新生骨，以增加新生牙槽骨的骨量。另外，良好的生物相容性、臨床可操作性好，能夠穩定固著并能保持一段足夠引導組織起效的時間都是影響其應用的重要因素(Kuo SM, Chang SJ, Niu GC, et al, Applied PolymerScience.2009;112:3127-3134)。膠原是結締組織的主要成分，普遍存在于哺乳動物的皮膚、肌腱、骨骼、韌帶中，具有柔韌性，因其螺旋結構及保持良好的主要序列，僅引起輕微的炎性反應。膠原膜作為可吸收性膜它具有低抗原性、生物相容性好、可參與組織愈合過程以及降解速率可根據需要調節等諸多優點。Cirel li 等(Wong HL, Cooke J.Dent Clin N Am.2005(49):637-659.)研究表明膠原膜具有良好的生物相容性和引導組織再生功能，而且引導種植體周圍組織再生效果最佳；膠原膜經紫外線消毒后，可在一 20°C下儲存，在生物體內降解期為6-8周，其降解由唾液酶溶解、機械性破損及上皮細胞分泌的膠原酶破壞完成。Minabe M等(KimM, Kim J, Lee J, et al.1n Vivo, 2008, 22(3): 231 - 236.)用紫外線等多種方法使膠原分子間產生交聯，使膠原膜在體內降解的時間可以控制，增長其降解時間更利于較大的骨缺損。李成章等采用雙抗膠原膜的制作方法可應用于成品膠原膜的加工，加工改良后的雙抗膠原膜具有較高的交聯程度，較強的抗酶降解能力，其形態結構特點及理化性能符合引導骨再生技術要求。但膠原膜作為GTR的研究還存在一些問題:首先是體內降解速度過快，其次相對于GTR膜的要求，目前大部分膠原膜產品的強度較小，在應用過程中容易發生塌陷而失去空間維持能力。
發明內容
本發明的目的在于本發明所采取的技術方案是:
一種組織引導再生用膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原溶于酸性溶液中；
(2)調節步驟(I)所得溶液的pH值至堿性；
(3)往步驟(2)所得溶液中加入無機粉體材料，攪拌均勻；
(4)調節步驟(3)所得溶液的pH值至中性，離心，除去上清液，收集膠原復合膜；
(5)將步驟(4)所得的膠原復合膜模具成型，冷凍干燥，采用物理或/和化學方法交聯，即可。步驟(I)所述酸性 溶液為醋酸、鹽酸或檸檬酸溶液，濃度為0.1 0.5M。步驟(I)所得溶液中，膠原的濃度為0.5mg/ml-20mg/mlo步驟(I)是在4 30°C下進行。步驟(2)的具體操作為:用堿液將步驟(I)所得溶液的pH值調節至8-11后，靜置5min_36h0所述堿液為氫氧化鈉溶液或氨水。步驟(3)所述無機粉體材料包括羥基磷灰石、生物活性玻璃、磷酸三鈣、焦磷酸鈣中的至少一種，無機粉體材料占膠原重量的1%_50%。步驟(4)所述離心的轉速為1000 7000r/min,時間為3 lOmin。所述物理交聯法為紫外交聯或者真空熱交聯，交聯溫度為100°C _180°C。所述化學交聯法所用交聯劑為戊二醛溶液、甲醛溶液、或1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液。本發明的有益效果是:
(1)本發明方法制備得到的膠原基復合生物膜具有良好的力學性能和降解可控性能；
(2)本發明得到的膠原膜具有梯度的孔隙結構，適合于營養物質的傳輸和細胞的吸附增殖，能夠較好地引導缺損組織的修復；
(3 )本發明方法工藝簡單，成本較低，有利于規模化生產。
圖1為實施例2組織引導再生用膠原基復合生物膜緊密面電鏡照片；
圖2為實施例2組織引導再生用膠原基復合生物膜疏松面電鏡照片；
圖3為實施例2組織引導再生用膠原基復合生物膜剖面電鏡照片；
圖4為實施例2組織引導再生用膠原基復合生物膜與人牙周韌帶細復合培養第6天的電鏡照片(X 200)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所用膠原為sigma公司的膠原蛋白，所用生物活性玻璃為參照文獻(陳曉峰，郭常亮，趙娜如，謝林，溶膠-凝膠生物活性玻璃超細粉體的制備與生物礦化性能研究，無機材料學報，2008，23 (5):1027)制備得到。實施例1一種膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在25°C下溶于0.1M的鹽酸溶液中，得到濃度為3mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1N的氫氧化鈉緩慢調節步驟(I)所得溶液的pH值至10，保持30分鐘；
(3)將生物活性玻璃(BAG)加入至步驟(2)的膠原溶液中，其中BAG的重量為膠原干重的10%，用攪拌器攪拌獲得均一的溶液；
(4)用鹽酸或氫氧化鈉溶液將步驟(3)所得溶液的pH值調至7，以3000r/min的速度離心，時間為5分鐘，此時膠原包裹BAG沉淀于離心杯底部成膜，去除上清液，收集膠原復合膜；
(5)將步驟(4)收集得到的膠原復合膜成型，一20°C冷凍干燥，在120°C條件下真空熱交聯；
(6)包裝，輻照滅菌。所得膠原基復合生物膜的彈性模量為156.47+7.67g/mm2。實施例2
一種膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在4°C下溶于0.1M的鹽酸溶液中，得到濃度為10mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1N的氫氧化鈉緩慢調節步驟(I)所得膠原溶液的pH值至9，保持60分鐘；
(3)加入羥基磷灰石(HA)至步驟(2)所得溶液中，其中HA的重量為膠原干重的5%，用攪拌器攪拌獲得均一的溶液；
(4)用鹽酸或氫氧化鈉溶液將步驟(3)所得溶液的pH值調節至7，以4000r/min的速度離心,離心3分鐘，此時膠原包裹HA沉淀于離心杯底部成膜，去除上清液，收集收集膠原復合膜；
(5)將步驟(4)收集得到的膠原復合膜成型，一20°C冷凍干燥，在100°C條件下真空熱交聯；
(6)將步驟(5)所得的膠原復合膜放入1%的EDC/NHS溶液(按EDC/NHS=1:4的質量比例稱取一定量，置于水中配成質量濃度為1%的溶液)中浸泡10小時,取出，用去離子水浸泡沖洗3次，一 20°C冷凍干燥；
(7)包裝，輻照滅菌。所得膠原基復合生物膜的彈性模量為186.47+7.97g/mm2。實施例3
一種膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在4°C下溶于0.5M的醋酸溶液中，得到濃度為8mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1N的氨水緩慢調節步驟(I)所得膠原溶液的pH值至8，保持5分鐘；
(3)加入β-磷酸三鈣(β-TCP)至步驟(2)的膠原溶液中，其中β-TCP的重量為膠原干重的1%，用攪拌器攪拌得到均一的溶液；
(4)用醋酸或氨水將步驟(3)所得溶液的pH值調節至7，以6000r/min的速度離心，離心3分鐘，此時膠原包裹β -TCP沉淀于離心杯底部成膜，去除上清液，收集膠原復合膜；
(5)將步驟(4)收集得到 的復合膠原膜成型，-20°C冷凍干燥，在140°C條件下真空熱交聯；
(6)將步驟(5)所得的復合膠原膜放入1%的戊二醛溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水浸泡沖洗3次，—20°C冷凍干燥；
(7)包裝，輻照滅菌。所得膠原基復合生物膜的彈性模量為195.47+9.62g/mm2。實施例4
一種膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在5°C下溶于0.1M的檸檬酸溶液中，得到濃度為0.5mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1N的氨水緩慢調節步驟(I)所得膠原溶液的pH值至10，保持24小時；
(3)加入β-磷酸三鈣(β-TCP)至步驟(2)所得的膠原溶液中，其中β-TCP的重量為膠原干重的50%，用攪拌器攪拌得到均一的溶液；
(4)用檸檬酸或氨水將步驟(3)所得溶液的pH值調節至7，以lOOOr/min的速度離心，離心10分鐘，此時膠原包裹β-TCP沉淀·于離心杯底部成膜，去除上清液，收集復合膠原膜；
(5)將步驟(4)收集得到的復合膠原膜成型，一20°C冷凍干燥，在180°C條件下真空熱交聯；
(6)將步驟(5)所得的復合膠原膜放入1%的甲醛溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水浸泡沖洗3次，一 20°C冷凍干燥；
(7)包裝，輻照滅菌。所得膠原基復合生物膜的彈性模量為185.47+8.7g/mm2。實施例5
一種膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在30°C下溶于0.5M的醋酸溶液中，得到濃度為20mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1N的氫氧化鈉緩慢調節步驟(I)所得膠原溶液的pH值至8，保持20分鐘；
(3)加入生物活性玻璃(BAG)至步驟(2)所得的膠原溶液中，其中BAG的重量為膠原干重的30%，用攪拌器攪拌得到均一的溶液；
(4)用醋酸溶液或氫氧化鈉溶液將步驟(3)所得溶液的pH值調節至7，以5000r/min的速度離心，離心5分鐘，此時膠原包裹BAG沉淀于離心杯底部成膜，去除上清，收集復合膠原膜；
(5)將步驟(4)收集得到的復合膠原膜成型，-20°C冷凍干燥，在120°C條件下真空熱交聯；
(6)將步驟(5)所得的復合膠原膜放入1%的戊二醛溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水浸泡沖洗3次，—20°C冷凍干燥；
(7)包裝，輻照滅菌。所得膠原基復合生物膜的彈性模量為197.4+9.67g/mm2。實施例6
一種膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在10°c下溶于0.2M的檸檬酸溶液中，得到濃度為8mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1N的氨水緩慢調節步驟(I)所得膠原溶液的pH值至10，保持10分鐘；
(3)加入β-磷酸三鈣(β-TCP)至步驟(2)所得的膠原溶液中，其中β-TCP的重量為膠原干重的8%，用攪拌器攪拌得到均一的溶液；(4)用檸檬酸溶液或氨水將步驟(3)所得溶液的pH值調節至7，以5000r/min的速度離心，離心4分鐘，此時膠原包裹β -TCP沉淀于離心杯底部成膜，去除上清液，收集復合膠原膜；
(5)將步驟(4)收集得到的復合膠原膜成型，一20°C冷凍干燥，取出后在25度下，254nm紫外照射30秒進行交聯；
(6)將步驟(5)所得的膠原膜放入1%的EDC-NHS溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水浸泡沖洗3次，一 20°C冷凍干燥；
(7)包裝，輻照滅菌。所得膠原基復合生物膜的彈性模量為155.5+6.1gfxm2 實施例7
一種膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟:
(1)將膠原在20°C下溶于0.1M的醋酸溶液中，得到濃度為4mg/ml的膠原溶液；
(2)用0.1N的氫氧化鈉緩慢調節步驟(I)所得膠原溶液的pH值至11，保持20分鐘；
(3)加入焦磷酸鈣至步驟(2)的膠原溶液中，其中焦磷酸鈣的重量為膠原干重的3%，用攪拌器攪拌得到均一的溶液；
(4)用醋酸溶液或氫氧化鈉溶液將步驟(3)所得溶液的pH值調節至7，以7000r/min的速度離心，離心3分鐘，此時膠原包裹焦磷酸鈣沉淀于離心杯底部成膜，去除上清液，收集復合膠原膜；
(5)將步驟(4)收集到的復合膠原膜成型，-20°C冷凍干燥，在140°C條件下真空熱交
聯；
(6)將步驟(5)所得的復合膠原膜放入1%的戊二醛溶液中浸泡10小時，取出，用去離子水浸泡沖洗3次，—20°C冷凍干燥；
(7)包裝，輻照滅菌。所得膠原基復合生物膜的彈性模量為198.7+7.8g/mm2。效果實驗
一、體外膠原酶降解實驗
取膠原膜各Img分別置于含有100U膠原酶的2mlStock緩沖液中(lOmMTris，25mMCaCl2, IOOml蒸餾水，PH7.5)，37°C恒溫，記錄膜完全降解時間。空白對照組為2mlStock緩沖液。實驗結果見表I。
權利要求
1.一種組織引導再生用膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟: (1)將膠原溶于酸性溶液中； (2)調節步驟(1)所得溶液的pH值至堿性； (3)往步驟(2)所得溶液中加入無機粉體材料，攪拌均勻； (4)調節步驟(3)所得溶液的pH值至中性，離心，除去上清液，收集膠原復合膜； (5)將步驟(4)所得的膠原復合膜模具成型，冷凍干燥，采用物理或/和化學方法交聯，即可。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述酸性溶液為醋酸、鹽酸或檸檬酸溶液，濃度為0.1 0.5M。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所得溶液中，膠原的濃度為0.5mg/ml-20mg/ml .
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)是在4 30°C下進行。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)的具體操作為:用堿液將步驟(1)所得溶液的PH值調節至8-11后，靜置5min-36h。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述堿液為氫氧化鈉溶液或氨水。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述無機粉體材料包括羥基磷灰石、生物活性玻璃、磷酸三鈣、焦磷酸鈣中的至少一種，無機粉體材料占膠原重量的1%_50%。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述離心的轉速為1000 7000r/min,時間為 3 10min.
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述物理交聯法為紫外交聯或者真空熱交聯，交聯溫度為100°C -180°C。
10.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述化學交聯法所用交聯劑為戊二醛溶液、甲醛溶液、或1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液。
全文摘要
本發明公開了一種組織引導再生用膠原基復合生物膜的制備方法，包括如下步驟將膠原溶于酸性溶液中；調節所得溶液的pH值至堿性；繼續加入無機粉體材料，攪拌均勻；調節所得溶液的pH值至中性，離心，除去上清液，收集膠原復合膜；將所得的膠原復合膜模具成型，冷凍干燥，采用物理或/和化學方法交聯，即可。
文檔編號A61L31/12GK103071190SQ20131003079
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者任力, 季培紅, 秦曉杰, 王迎軍, 劉卅 申請人:廣州華美康聯生物科技有限公司