專利名稱：負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架及其制備方法
技術領域：
本發明屬于高分子材料技術領域，特別涉及一種負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架及其制備方法。
背景技術：
絲素蛋白是蠶絲脫膠后得到的天然高分子纖維蛋白，是一種疏水性的蛋白質，具有良好的生物相容性，而且來源豐富，成本低廉，是一種優良的天然的高分子材料。絲素蛋白，由于其優異的力學性能、良好的韌性，熱穩定性、高透氧性和結構的穩定性，特別是其三維多孔支架的形態，一直以來被廣泛運用在組織工程領域上，例如軟骨修復、網狀結締組織修復、骨修復和神經修復等方面。絲素具有獨特的分子結構、良好的生物相容性以及良好的加工性能，可加工成粉體、凝膠、微球、多孔支架、納米纖維和膜，用于人工器官及其他復合材料的研制，具有廣泛的應用前景。明膠，膠原的衍生物，具有良好的生物相容性，例如能夠被人體完全吸收，沒有抗原性，已經廣泛被運用在生物醫學和藥物載體等方面上，而且經臨床研究證明，膠原具有生物安全性。膠原的結構上具有一系列的官能團，例如氨基酸，因此能夠用在骨修復，或者通過一系列的化學改性方法，對其進行改性。但是膠原的力學性能差，從而限制了其在生物醫學上的使用。萬古霉素，窄譜性抗生素，對其它抗菌藥耐藥或療效差的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌特別有效。但是由于萬古霉素一般通過靜脈給藥的方式，長時間的腸胃外投藥，將對引起嘔吐、耳毒性、腎毒性等不良反應。
近年來，利用絲素蛋白作為三維支架，在組織工程和藥物載體上的應用和研究成為了熱點；而明膠早已廣泛利用在生物醫學和藥物載體上；另一方面，如何改善萬古霉素在人體的投藥方式和達到緩釋的效果，也是研究人員所關注的問題。
發明內容
本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法。該方法將萬古霉素與明膠微球復合后負載在絲素蛋白多孔支架上，能達到緩釋藥物、延長藥效的作用，降低了萬古霉素對人體的傷害，抗菌效果明顯。本發明的另一目的在于提供由上述制備方法得到的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架。本發明的再一目的在于提供所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現:一種負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，包括如下步驟:
(1)將10 50mg/ml萬古霉素溶液加到明膠微球中，于4 25°C放置過夜后冷凍干燥，得到萬古霉素/明膠微球復合物；每克明膠微球加入萬古霉素溶液2 1Oml ；(2)將步驟(1)的萬古霉素/明膠微球復合物加入2 1(^七％絲素蛋白溶液中，攪拌均勻，冷凍干燥，得到負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架；每毫升絲素蛋白溶液加入5mg萬古霉素/明膠微球復合物；步驟(1)中:所述的10 50mg/ml萬古霉素溶液優選采用以下方法進行制備:將萬古霉素溶于去離子水中，攪拌均勻，得到10 50mg/ml萬古霉素溶液；所述的明膠微球優選為多孔明膠微球；所述的明膠微球的粒徑優選為5 30 μ m，膨脹率優選為400 500% ；所述的明膠微球優選采用以下方法進行制備:將0.1g山梨糖醇酐油酸酯(斯盤-80，Span80)加到盛有80ml植物油的燒瓶中，于60°C攪拌0.5 5h后加入10wt%明膠水溶液10ml，繼續攪拌180min后冰浴攪拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，繼續攪拌2h，加入4°C丙酮40ml，攪拌15min，靜置，過濾，得到微球；將微球泡在1Oml丙酮中，于4°C固化24h后用lmol/L氨基乙酸浸泡30min,離心,取沉淀,用丙酮和異丙酮洗漆的沉淀，將沉淀置于去離子水中浸泡過夜，冷凍干燥，得到明膠微球；所述的攪拌的速度優選為300 400r/min ；所述的離心的條件優選為于25°C、10000r/min離心1Omin ；所述的冷凍干燥的條件優選為_60°C冷凍干燥24h ；步驟(2)中:所述的2 10wt%絲素蛋白溶液優選采用以下方法進行制備:將蠶繭加入IOO0C 0.2wt%NaC03水溶液中煮2h，IOOml0.2wt%NaC03水溶液加入Ig蠶苗，脫膠后用去離子水清洗絲素至中性，于60°C烘干，得到絲素蛋白；取絲素蛋白，加入9.8mol/L溴化鋰水溶液中，40 60°C水浴加熱3 5h后用去離子水透析2 4天，離心，得到2 10wt%絲素蛋白溶液；所述的蠶繭優選為去蛹的蠶繭；所述的透析優選采用截留分子量為8000 12000的透析袋進行透析；所述的離心的條件優選為于25°C、10000r/min離心IOmin ；所述的絲素蛋白溶液優選為3 7wt%絲素蛋白溶液；所述的冷凍干燥的條件優選為_60°C冷凍干燥24h ；所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的孔隙率優選為75 95%，孔徑優選為50 200 μ m ;一種負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架，由上述制備方法得到；所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架應用于皮膚傷口愈合、傷口敷料或骨修復等技術領域。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:(1)本發明將萬古霉素與明膠微球復合后負載在絲素蛋白多孔支架上，能達到緩釋藥物、延長藥效的作用，降低了萬古霉素對人體的傷害，抗菌效果明顯。制備得到的明膠微球粒徑為5 30 μ m，膨脹率為400 500% ;制備得到的絲素蛋白支架孔隙率為75 95%,孔徑為50 200 μ m。( 2 )本發明的制備工藝簡單、材料來源廣泛，生產效率高，成本低，可應用于工業化大生產。
圖1是對比實施例1的絲素蛋白多孔支架掃描電鏡圖。圖2是實施例1的多孔明膠微球的掃描電鏡圖。圖3是實施例子I的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的掃描電鏡圖。圖4是對比實施例2的負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架和實施例1的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的萬古霉素釋放圖；其中:a為對比實施例2的負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架的萬古霉素釋放圖；b為實施例1的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的萬古霉素釋放圖。圖5是對比實施例子I的絲素蛋白多孔支架、對比實施例2的負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架和實施例1的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架對金黃色葡萄球菌的抗菌環效果圖；其中:a為對比實施例子I的絲素蛋白多孔支架的抗菌效果圖；b為實施例1的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架對金黃色葡萄球菌的抗菌效果圖；c為對比實施例2的負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架的抗菌效果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1(1)將去蛹的蠶繭 4g 在 100°C的 0.2wt%NaC0yjC溶液 400ml 中煮 2h，脫膠后用去離子水清洗絲素至中性，置于60°C的烘箱中烘干，得到絲素蛋白；取2.5g絲素蛋白加入25ml、9.8mol/L的溴化鋰水溶液中，60°C水浴加熱5h后用去離子水透析(透析袋的截留分子量為8000，透析時間為3天，每天換水一次)，然后于25°C > 10000r/min離心IOmin,得至Ij 3.5wt%絲素蛋白溶液；(2)將0.lgSpan80加入盛有80ml的植物油的燒瓶中，于60°C、400r/min攪拌
0.5h后加入10wt%明膠水溶液10ml，繼續攪拌180min后冰浴攪拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，繼續攪拌2h，加入4°C丙酮40ml，攪拌15min，靜置，過濾，得到微球；將微球泡在IOml丙酮中，于4°C固化24h后用lmol/L氨基乙酸浸泡30min,然后于25°C、10000r/min離心lOmin,取沉淀,用丙酮和異丙酮洗漆的沉淀,將沉淀置于去離子水中浸泡過夜，_60°C冷凍干燥24h，得到明膠微球；如圖2所示，明膠微球粒徑為5 30 μ m，膨脹率為 400 500% ；(3)將100μ l、25mg/ml的萬古霉素滴加于0.05g步驟(2)的明膠微球中，于4°C放置過夜，_60°C冷凍干燥24h，得到萬古霉素/明膠微球復合物；(4)將5mg步驟(3)的萬古霉素/明膠微球復合物加入Iml步驟(I)的3.5wt%絲素蛋白溶液中，攪拌均勻，_60°C冷凍干燥24h，得到負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架；負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的掃描電鏡圖如圖3所示；(5)將步驟(4)的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架置于pH=7.4的PBS溶液中，剛開始時每隔4h取樣一次，12h后每隔12h取樣一次,24后每隔24h取樣一次，每次取樣2ml，測試萬古霉素的釋放效果；結果如圖4所示，從圖4可以看出，負載萬古霉素/明膠微球復合物具有藥物緩釋作用，藥物釋放時間長達144h ；(6)將步驟(4)的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架置于涂有金黃色葡萄球菌的固體培養基上，37°C放置過夜，進行抗菌環實驗，觀察負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的抗菌效果；結果如圖5所示；抗菌環的直徑為:26.4_，從圖5可以看出，負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架具有較好的抗菌效果。實施例2(I)將去蛹的蠶繭4g在100°C的0.2wt%NaC03水溶液400ml中煮2h，脫膠后用去離子水清洗絲素至中性，置于60°C的烘箱中烘干得到絲素蛋白；取Ig絲素蛋白加入25ml、9.8mol/L的溴化鋰水溶液中，60°C水浴加熱3h后用去離子水透析(透析袋的截留分子量為10000,透析時間為3天，每天換水一次),然后于25°C、10000r/min離心lOmin,得到2wt%絲素蛋白溶液；(2)將0.lgSpan80加入盛有80ml的植物油的燒瓶中，于60°C、400r/min攪拌
2.5h后加入10wt%明膠水溶液10ml，繼續攪拌180min后冰浴攪拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，繼續攪拌2h，加入4°C丙酮40ml，攪拌15min，靜置，過濾，得到微球；將微球泡在IOml丙酮中，于4°C固化24h后用lmol/L氨基乙酸浸泡30min,然后于25°C、10000r/min離心lOmin,取沉淀,用丙酮和異丙酮洗漆的沉淀,將沉淀置于去離子水中浸泡過夜，_60°C冷凍干燥24h，得到明膠微球；(3)將200μ l、10mg/ml的萬古霉素滴加于0.05g步驟(2)的明膠微球中，于4°C放置過夜，_60°C冷凍干燥2 4h，得到萬古霉素/明膠微球復合物；(4)將5mg步驟(3)的萬古霉素/明膠微球復合物加入Iml步驟(I)的2wt%絲素蛋白溶液中，攪拌均勻，_60°C冷凍干燥24h，得到負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架。實施例3(I)將去蛹的蠶繭4g在100°C的0.2wt%NaC03水溶液400ml中煮2h，脫膠后用去離子水清洗絲素至中性，置于60°C的烘箱中烘干，得到絲素蛋白；取7.5g絲素蛋白加入25ml、
9.8mol/L的溴化鋰水溶液中，60°C水浴加熱4h后用去離子水透析(透析袋的截留分子量為12000,透析時間為3天,每天換水一次),然后于25°C、10000r/min離心lOmin,得到10wt%絲素蛋白溶液；(2)將0.1g Span80加入盛有80ml的植物油的燒瓶中，于60°C、400r/min攪拌5h后加入10wt%明膠水溶液10ml，繼續攪拌180min后冰浴攪拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，繼續攪拌2h，加入4°C丙酮40ml，攪拌15min，靜置，過濾，得到微球；將微球泡在IOml丙酮中，于4°C固化24h后用lmol/L氨基乙酸浸泡30min,然后于25°C、10000r/min離心lOmin,取沉淀,用丙酮和異丙酮洗漆的沉淀,將沉淀置于去離子水中浸泡過夜，_60°C冷凍干燥24h，得到明膠微球；(3Wf 500yl、50mg/ml的萬古霉素滴加于0.05g步驟(2)的明膠微球中，于4°C放置過夜，_60°C冷凍干燥24h，得到萬古霉素/明膠微球復合物；(4)將5mg步驟(3)的萬古霉素/明膠微球復合物加入Iml步驟(I)的10wt%絲素蛋白溶液中，攪拌均勻，_60°C冷凍干燥24h，得到負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架。對比實施例1(I)將去蛹的蠶繭4g在100°C的0.2wt%NaC03水溶液400ml中煮2h，脫膠后用去離子水清洗絲素至中性，置于60°C的烘箱中烘干，得到絲素蛋白；取2.5g絲素蛋白加入25ml、
9.8mol/L的溴化鋰水溶液中，60°C水浴加熱5h后用去離子水透析(透析袋的截留分子量為10000,透析時間為3天,每天換水一次),然后于25°C、10000r/min離心lOmin,得到3.5wt%絲素蛋白溶液；(2)取步驟(I)的3.5界七％絲素蛋白溶液，_60°C冷凍干燥24h，得到絲素蛋白多孔支架；絲素蛋白多孔支架的孔隙率為75 95%，孔徑為50 200 μ m ;絲素蛋白多孔支架的掃描電鏡圖如圖1所示；(3)將步驟(2)的絲素蛋白多孔支架放置于涂有金黃色葡萄球菌的固體培養基上，37°C放置過夜，進行抗菌環實驗，觀察絲素蛋白支架的抗菌效果；從抗菌環實驗可以看到，絲素蛋白多孔支架沒有抗菌效果，結果如圖5所示。對比實施例2(I)將去蛹的蠶繭4g在100°C的0.2wt%NaC03水溶液400ml中煮2h，脫膠后用去離子水清洗絲素至中性，置于60°C的烘箱中烘干，得到絲素蛋白；取2.5g絲素蛋白加入25ml、
9.8mol/L的溴化鋰水溶液中，60°C水浴加熱5h后用去離子水透析(透析袋的截留分子量為8000,透析時間為3天，每天換水一次),然后于25°C、10000r/min離心lOmin,得到3.5wt%絲素蛋白溶液；(2)取步驟(I)的3.5界七％絲素蛋白溶液，-60°C冷凍干燥24h，得到絲素蛋白多孔支架；絲素蛋白多孔支架的孔隙率為75 95%，孔徑為50 200μπι ;(3)將50μ l、25mg/ml萬古霉素滴加于0.025g步驟(2)的絲素蛋白多孔支架上，37°C放置過夜，_60°C冷凍干燥24h，得到負載有萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架；(4)將步驟(3)的負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架放置于pH=7.4的PBS溶液中，每隔一段時間，取樣2ml測試萬古霉素的釋放效果；結果如圖4所示，由圖4可以看至IJ，負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架的萬古霉素的釋放時間為48h ;由于萬古霉素是通過直接滴加到絲素蛋白支架上的，所以負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架沒有緩釋功能或者說緩釋效果很弱，所以在4h內，釋放率接近80%，并在48h后釋放完全。(5)將步驟(3)的負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架放置于涂有金黃色葡萄球菌的固體培養基上，37°C放置過夜，進行抗菌環實驗，觀察負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架的抗菌效果；抗菌環的直徑為28.5mm,結果如圖5所示；從圖5可以看到，負載萬古霉素的絲素蛋白多孔復合支架的抗菌效果具有一定的抗菌效果。由于萬古霉素是通過直接滴加到絲素蛋白支架上的，萬古霉素的釋放量大，所以其抗菌效果比負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架好，但是兩者都達到抗菌的要求，而且負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架具有緩釋藥物的功能，所以其長期抗菌效果會更加優越。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包 含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將10 50mg/ml萬古霉素溶液加到明膠微球中，于4 25°C放置過夜后冷凍干燥，得到萬古霉素/明膠微球復合物；每克明膠微球加入萬古霉素溶液2 IOml ； (2)將步驟(I)的萬古霉素/明膠微球復合物加入2 1(^七％絲素蛋白溶液中，攪拌均勻，冷凍干燥，得到負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架；每毫升絲素蛋白溶液加入5mg萬古霉素/明膠微球復合物。
2.根據權利要求1所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的10 50mg/ml萬古霉素溶液采用以下方法進行制備:將萬古霉素溶于去離子水中，攪拌均勻，得到10 50mg/ml萬古霉素溶液。
3.根據權利要求1所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的明膠微球的粒徑為5 30 μ m，膨脹率為400 500%。
4.根據權利要求1所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，其特征在于:步驟(I)中所述的明膠微球采用以下方法進行制備:將0.1g山梨糖醇酐油酸酯加到盛有80ml植物油的燒瓶中，于60°C攪拌0.5 5h后加入10wt%明膠水溶液10ml，繼續攪拌180min后冰浴攪拌15min，然后加入25wt%戊二醛水溶液0.1ml，繼續攪拌2h，力口入4°C丙酮40ml，攪拌15min，靜置，過濾，得到微球；將微球泡在IOml丙酮中，于4°C固化24h后用lmol/L氨基乙酸浸泡30min,離心,取沉淀,用丙酮和異丙酮洗漆的沉淀,將沉淀置于去離子水中浸泡過夜，冷凍干燥，得到明膠微球。
5.根據權利要求4所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，其特征在于:所述的攪拌的速度為300 400r/min ;所述的離心的條件為于25°C、IOOOOr/min 離心 lOmin。
6.根據權利要求1或4任一項所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，其特征在于:所述的冷凍干燥的條件為_60°C冷凍干燥24h。
7.根據權利要求1所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的2 1(^七％絲素蛋白溶液采用以下方法進行制備:將蠶繭加入IOO0C 0.2wt%NaC03水溶液中煮2h，IOOml0.2wt%NaC03水溶液加入Ig蠶苗，脫膠后用去離子水清洗絲素至中性，于60°C烘干，得到絲素蛋白；取絲素蛋白，加入9.8mol/L溴化鋰水溶液中，40 60°C水浴加熱3 5h后用去離子水透析2 4天，離心，得到2 10wt%絲素蛋白溶液。
8.根據權利要求7所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架的制備方法，其特征在于:所述的蠶繭為去蛹的蠶繭；所述的負載萬古霉素/明膠微球復合物的絲素蛋白支架孔隙率為75 95%，孔徑為50 200 μ m。
9.一種負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架，由權利要求1 8任一項所述的制備方法得到。
10.權利要求9所述的負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架在皮膚傷口愈合、傷口敷料或骨修復技術領域中進行應用。
全文摘要
本發明公開了一種負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架及其制備方法。本發明將10～50mg/ml萬古霉素溶液加到明膠微球中，于4～25℃放置過夜后冷凍干燥，得到萬古霉素/明膠微球復合物；然后將萬古霉素/明膠微球復合物加入2～10wt%絲素蛋白溶液中，攪拌均勻，冷凍干燥，得到負載萬古霉素/明膠微球的絲素蛋白復合支架；將萬古霉素與明膠微球復合后負載在絲素蛋白多孔支架上，能達到緩釋藥物、延長藥效的作用，降低了萬古霉素對人體的傷害，抗菌效果明顯。制備得到的絲素蛋白支架孔隙率為75～95%，孔徑為50～200μm。本發明的制備工藝簡單、材料來源廣泛，生產效率高，成本低，可應用于工業化大生產。
文檔編號A61L31/16GK103100109SQ20131003190
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者郭瑞, 張淵明, 藍詠 申請人:暨南大學