一種mg53突變體及其突變方法和應用的制作方法

一種mg53突變體及其突變方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種MG53突變體，其為MG53的N端的RING結構域7個半胱氨酸中的任一個或兩個以上的半胱氨酸突變為非極性氨基酸的突變體；該MG53突變體在保護心臟、治療細胞死亡導致的心臟疾病方面具有預防/治療的效果和應用，尤其地，MG53突變體在保護心臟的同時，避免了MG53所帶來的同時伴有的胰島素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用。
【專利說明】一種MG53突變體及其突變方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種MG53突變體(也可稱為MG53蛋白突變體)，以及該MG53突變體在保護心臟、治療細胞死亡導致的心臟疾病方面的應用，尤其是MG53突變體在保護心臟的同時，避免了同樣具有心臟保護功效的MG53所帶來的同時伴有的胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等副作用。
【背景技術】
[0002]MG53 是骨骼肌特異性蛋白 mitsugumin53，簡稱 MG53;或 TRM72。mitsugumin53(MG53),是一種肌肉特異性tripartite motif family (TRIM)家族蛋白(該家族蛋白常含三個特定模序結構，分別稱為RING，Β-Β0Χ，和卷曲結構域。它們共同作用結合在細胞不再需要的蛋白質上，將這些蛋白帶上泛素標記以便降解)，也是一種細胞膜修復機制的重要組成部分。
[0003]在醫學應用方面，MG53治療由細胞凋亡引起的心臟疾病的功效已被接受并成為業內前沿領域的公知。MG53能夠對心臟產生保護作用，也就是說可以通過增加MG53的含量保護心臟損傷。但是，MG53同時存在著不可忽視并被視為一大危害的負面效果，MG53含量的增加在保護心臟的同時，會引起胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征。也就是說MG53在保護心臟的同時，伴有胰島素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用。這是業內所關心的且不希望其正負面作用共存的一個問題，至今沒有解決渠道。

【發明內容】

[0004]本發明提供一種MG53的突變體，為MG53蛋白在其N端的RING結構域7個半胱氨酸中的任一個或兩個或兩個以上的半胱氨酸突變為非極性氨基酸(例如丙氨酸)的MG53蛋白突變體。該MG53蛋白突變體在保護心臟的同時，避免了同樣具有心臟保護功效的MG53所帶來的同時伴有的胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等副作用。
[0005]MG53能夠對心臟產生保護作用，也就是說可以通過增加MG53的含量保護心臟損傷。但之后發現，MG53含量的增加在保護心臟的同時，會引起胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征。也就是說MG53在保護心臟的同時，伴有胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等副作用。為促進MG53蛋白在保護心臟方面能進一步去劣存優，本申請進行大量的科研工作，最主要目的是對MG53蛋白進一步突變，希望能在不引起胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等副作用等前提下，使突變體保留行使心臟保護功能，但不伴隨相應的副作用。
[0006]本發明提供了一種MG53突變體，該MG53突變體為MG53的N端的RING結構域7個半胱氨酸中的任一個或兩個或兩個以上的半胱氨酸突變為非極性氨基酸的突變體；該7個半胱氨酸分別是在RING結構域的第14位點、第17位點、第29位點、第34位點、第37位點、第53位點、第56位點。
[0007]上述這7個半胱氨酸都是MG53的RING手指區的重要結構，而RING手指區是其行使E3連接酶活性、降解其底物、以及引起胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等副作用所必需的，因此發明人選擇了這7個半胱氨酸作為研究對象。
[0008]實驗和事實證明，該7個半胱氨酸的任意一個或者兩個或兩個以上的組合突變為非極性氨基酸都能達到本發明的預期目的和有益效果。
[0009]本發明提供的上述MG53蛋白突變體在保護心臟的同時，能夠避免MG53所帶來的同時伴有的胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等副作用，且心臟保護作用卻不受任何影響。
[0010]上述的MG53突變體中，所述的非極性氨基酸為丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或蛋氨酸。優選地，非極性氨基酸為丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸和異亮氨酸。最優選地，該非極性氨基酸為丙氨酸。
[0011]當上述MG53突變體中非極性氨基酸為丙氨酸時，所述的MG53突變體選自MG53C14A, MG5 3C17A, MG53C29A、MG53C34A、MG53C37A、MG53C53A、MG53C56A 中的任一。
[0012]本發明所述的MG53突變體，其序列的屬種包括靈長類動物、大鼠和小鼠。
[0013]在優選實施例中，本發明提供的MG53突變體，其為MG53蛋白突變體，該突變體的N端的RING手指區域的第14位是丙氨酸，即，MG53蛋白的N端的RING手指區域的第一個半胱氨酸被丙氨酸替代后突變成為本發明的MG53突變體，由于MG53蛋白中該半胱氨酸位于第14位，取而代之的丙氨酸也在14位，也就是說，本發明的MG53突變體為MG53C14A。
[0014]通過大量實驗研究，發明人驚喜地發現，MG53蛋白第14位點的C (半胱氨酸)，是MG53引起胰島素抵抗、肥胖和糖尿病所必需的，即，第14位C突變的MG53(MG53C14A)不能引起胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征。而MG53C14A卻仍然能夠保護心肌細胞的損傷(科研實驗過程中有可靠的實驗數據能夠支持這一發明點)，也就是說MG53C14A能夠在不引起胰島素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用等前提下，行使心臟保護功能。這正是發明人希望得到的出乎意料的有益效果。若有需要，這些證明效果的藥理實驗將在本發明隨后部分予以奉上，以提供本論點也是本發明的創造性的實驗數據的具體支持。
[0015]以下部分，本發明以丙氨酸為例，來闡述MG53突變體，需要說明的是:本發明中半胱氨酸突變可選的不僅僅是A (丙氨酸)，還可以是8種非極性氨基酸中的任意一種，例如甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸或異亮氨酸，同樣可起到MG53突變后不引起胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等副作用等前提下，行使心臟保護功能的效果。由于篇幅所限，僅以A做最優選實施例，其他非極性氨基酸的突變方法與丙氨酸相同，在此不再贅述。
[0016]MG53 是 TRIM 家族(The superfamily of tripartite motif-containingproteins)中新發現的一個蛋白質，與其他家族成員不同，它只在骨骼肌和心肌表達。初期的研究表明，在骨骼肌和心肌中MG53能夠作為一種結構蛋白促進細胞膜損傷的修復，同時也能夠調節細胞內小泡的轉運和骨骼肌細胞再生；另外在心肌中，MG53還通過介導Caveolin-3與PI3K的結合，激活再灌注損傷救援通路(reperfusion injurysalvagekinase pathway, RISK pathway),進而在心臟缺血預處理中發揮重要保護功能。本發明人通過實驗證明，蛋白質免疫印跡實驗可以得出這樣的結論，骨骼肌MG53在多種胰島素抵抗的動物模型中表達量顯著上調，提示MG53很可能參與骨骼肌胰島素抵抗的發生發展過程。
[0017]進一步地，通過氨基酸序列分析，發明人發現MG53蛋白是由公認具有E3連接酶活性的RING結構域(也可叫做RING手指區域)、B-box結構域、Coiled-coil結構域和SPRY結構域組成。從MG53氨基酸序列分析的結果來看，只有RING結構域是公認的含有E3泛素連接酶活性的結構域，因此，發明人認定MG53的E3泛素連接酶活性就在RING中。RING結構域內部鋅指結構中第一個結合鋅原子的半胱氨酸，即野生型小鼠MG53氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，是維持RING結構域E3泛素連接酶活性的關鍵所在。于是發明人構建了兩個可能導致MG53的E3泛素連接酶失活的突變體，一個是缺失RING結構域的MG53(ARING-MG53)，另一個是氨基酸序列第十四位突變為丙氨酸的MG53 (C14A-MG53)。當比較這兩個突變體與正常的MG53對IRSl泛素化的影響時，發現只有正常的MG53能夠有效地泛素化胰島素受體(IR)和胰島素受體底物I (IRS1)，ARING或C14A都不具備這一功能。這也完全證明MG53的RING結構域，特別是氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，對于MG53催化IR和IRSl泛素化是必需的。
[0018]上述這個重要發現引導著發明人對MG53在骨骼肌胰島素抵抗中的潛在作用進行了深入研究。這樣的科研思路和大量實驗數據決定了本發明不是科學猜想或是科研臆斷，而是一種真正可以產業化的科研成果，一種真正的發明創新。
[0019]為進一步探討MG53致IR和IRSl降解在MG53負調控肌肉胰島素信號通路中的作用及弄清被MG53泛素化的IR和IRSl的具體降解途徑，發明人進行了研究。在C2C12肌管中分別過表達正常的MG53及它的兩個突變體，比較它們對胰島素信號的影響。結果發現，只有能降解IR和IRSl的正常MG53才能夠抑制胰島素信號通路，而失去E3泛素連接酶活性的兩個突變體，尤其是C14A，即使只有一個氨基酸突變，也不能行使其抑制胰島素信號的功能。
[0020]也就是說，本發明的前期科研實驗得到的結論是:第一，肌肉特異性蛋白MG53異常高表達是胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征發生發展的重要原因；第二，第一次在整體水平和細胞水平證明了 MG53是IR和IRSl的E3泛素連接酶，它通過泛素-蛋白酶體途徑降解骨骼肌IR和IRS1，是造成機體胰島素抵抗狀態所必需的，同時通過引起機體的胰島素抵抗，進一步造成肥胖、糖尿病和代謝綜合征的發生。第三，還可以再進一步做以關聯構想。
[0021]E3是參與蛋白質泛素化反應的唯一可控成分。按介導泛素與靶蛋白的結合方式不同，E3可分為兩大類:含RING (really interesting new gene)結構域的E3和含HECT(homologous to E6_associated protein C terminus)結構域的 E3。前者同時與裝載泛素的E2和靶蛋白結合，將泛素直接轉移到靶蛋白上；后者先將泛素從E2轉移到HECT結構域的一個半胱氨酸活性位點上，再將硫脂化的泛素轉移到靶蛋白上。泛素由76個氨基酸組成，其中散布著7個賴氨酸殘基，即，本發明涉及的7個半胱氨酸，這些殘基可以作為其他泛素共價結合的位點。經過幾輪結合后，泛素鏈將會變得很長，這樣有助于對“標記”的識別。一般認為，由48位賴氨酸介導結合的泛素鏈聚合體是介導靶標蛋白質經蛋白酶體降解的經典引導信號，由63位賴氨酸介導結合的泛素鏈聚合體將介導靶標蛋白質進行其他的非降解功能。然而，這一觀點近來有被打破的趨勢。泛素化的靶標蛋白質在泛素結合域(Ubiquitin-binding domains, UBDs)的作用下定位于26S蛋白酶體,經去泛素化和解折疊等程序，最終被水解。隨著科學研究的不斷深入，在大多數胰島素靶器官中，人們已經基本認清胰島素信號網絡的大致骨架結構，即IR/IRSs-PI3K_Akt通路；然而，對于影響此信號途徑的具體分子機制，人們的研究目前卻剛剛起步。正如本發明人在科研實驗中發現的，在胰島素信號的調控中，除去廣泛的磷酸化修飾調控以外，蛋白質降解對于胰島素信號傳遞的影響也是巨大的。早在胰島素抵抗研究的初期，人們就在胰島素抵抗的病人或動物模型中觀察到，IR和IRSl在酪氨酸磷酸化普遍受抑制的同時，存在其蛋白含量的下降。直到近些年，人們才對IRSs的蛋白質降解得到了一些認識，比如，S0CS1/3作為culling-RING類泛素連接酶的底物識別分子，通過與IRSl和IRS2結合，介導了它們的泛素化降解。后來人們又發現SOCSs能在多種炎癥因子的刺激下顯著上調，結合大量臨床和動物模型的證據，人們意識到肥胖和II型糖尿病實質上是一種炎癥狀態，而各種炎癥因子在胰島素抵抗的發生中起了重要作用。除此之外，也有證據表明在某些組織細胞中Akt及其下游分子也可能成為UPS的靶標，發生降解從而影響葡萄糖轉運和糖異生。然而對于胰島素抵抗中IR的降解機制，至今仍然有待進一步研究。
[0022]簡而言之，本發明在諸多試驗數據的支持下，得到了 MG53蛋白突變體，其為MG53蛋白在其N端的RING結構域的7個半胱氨酸中的任一個或兩個或兩個以上的半胱氨酸被丙氨酸替代的突變體。該MG53蛋白突變體是MG53C14A、MG53C17A、MG53C29A、MG53C34A、MG53C37A、MG53C53A、MG53C56A 中任一，本發明最優選的 MG53 突變體是 MG53C14A。
[0023]本發明提供了一種MG53蛋白突變體的突變方法，該方法在于，利用定點突變試劑盒對野生型MG53質粒的全長序列進行定點突變，得到所述的MG53突變體。該試劑盒是北京全式金公司的 Easy Mutagenesis System。
[0024]即，上述改造方法或突變方法是利用定點突變試劑盒(北京全式金公司的EasyMutagenesis System)對野生型MG53質粒的全長序列進行突變,得到第14位的半胱氨酸突變為非極性氨基酸的MG53突變體；當該非極性氨基酸為丙氨酸時，即可得到第14位的半胱氨酸突變為丙氨酸的MG53蛋白突變體，該MG53蛋白突變體為MG53C14A。
[0025]同樣地，發明人 也做了半胱氨酸突變為甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸和異亮氨酸等其他非極性氨基酸的實驗，突變方法同上，同樣得到了 MG53C14G、MG53C14L、MG53C14P、MG53C14V、MG53C14I。
[0026]在本發明的具體實施例中，所述的改造方法即定點突變的過程為:
[0027](I)先設計突變引物，使上下游引物都帶有突變位點，重疊區域為18_27bp ；
[0028](2)以突變質粒作為模板，使用DNA聚合酶，用特異性突變引物進行PCR反應擴增，反應產物用瓊脂糖凝膠鑒定；
[0029](3)利用DpnI進行酶切反應處理PCR產物；
[0030](4)轉化大腸桿菌感受態細胞T0P10，融解感受態T0P10，加入處理后的PCR產物，冰上孵育，加入LB,孵育，涂氨芐抗性LB平板，培養，挑取平板上的單菌落，DNA測序檢測得突變結果為陽性，即是。
[0031]上述步驟(1)所述的重疊區域優選20bp。
[0032]在另一優選實施例中，為了得到Flag-C14A MG53質粒，在Flag_MG53質粒的基礎上，利用QuikChange II點突變試劑盒，將MG53氨基酸序列的第十四位半胱氨酸突變成丙氨酸。
[0033]在本發明又一優選實施例中，上述突變過程是:
[0034]1、首先設計突變引物，使上下游引物都帶有突變位點，并且重疊區域為18~27bp。
[0035]2、以突變質粒200ng作為模板，使用高保真DNA聚合酶，用特異性突變引物進行PCR反應擴增。反應產物用瓊脂糖凝膠鑒定。
[0036]PCR反應條件如下:
[0037]95 0C IOmin (分鐘)
[0038]950C 30sec (秒)
[0039]550C 30sec (秒) 20 Cycles (SP，20 個循環)
[0040]72°C 3.5sec (秒)
[0041]72 °C 5min (分鐘)
[0042]4°C Hold (維持)
[0043]3、利用DpnI進行酶切反應處理PCR產物，反應條件如下:10uL PCR產物加入IuLDpnI，37°C處理過夜。
[0044]4、轉化大腸桿 菌感受態細胞T0P10:融解感受態T0P10，加入處理后的PCR產物，放在冰上孵育30分鐘，42oC熱刺激60秒，加入LB, 37oC孵育45分鐘。涂氨芐抗性LB平板。37oC過夜培養16小時。
[0045]5、挑取平板上的單菌落，DNA測序檢測突變結果。
[0046]參考:Stratagene的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit
[0047]北京全式金公司Easy Mutagenesis System,說明書可參見如下公開內容:http://www.transgen.com.cn/uploadfiIe/201111/20111109161357731.pdf.[0048]本發明的MG53蛋白突變體的改造方法也可參見市售可得到的北京全式金公司的Easy Mutagenesis System (試劑盒)的說明書,其對突變改造方法和步驟均有詳細的說明記載。
[0049]本發明還提供了上述的MG53突變體(即MG53蛋白突變體)在制備治療心肌細胞損傷相關疾病的藥物中的用途。
[0050]上述的MG53突變體的用途，其中所述的治療心肌細胞損傷的藥物還包括治療/預防心臟缺血、再灌注損傷所致疾病的藥物；上述疾病進一步還包括心肌細胞缺損、心肌缺血、心臟缺血/再灌損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂等的藥物。
[0051]本發明尤其提供了 MG53突變體為MG53C14A時，即，MG53C14A在制備治療心臟損傷或心肌損傷的藥物中的用途。
[0052]關于MG53在治療心臟損傷/心肌損傷中的應用，以及其在治療/預防心臟缺血、再灌注損傷所致疾病中的用途，可參見200910241451.3公開的藥學實驗部分的實驗方法和實驗數據。
[0053]在心肌細胞中過表達MG53或者MG53C14A，都能夠對缺氧引起的心肌細胞的損傷
產生保護作用。
[0054]眾所周知，胰島素抵抗是肥胖、2型糖尿病等多種代謝障礙疾病的根本致病因素之一。雖然骨骼肌在胰島素刺激引起的糖利用中占70-90%，但是人們對肌肉胰島素抵抗的具體機制至今仍所知甚少。本發明以下實驗部分先證實，在小鼠中，骨骼肌特異性蛋白mitsugumin53 (即本發明所述的MG53)介導了胰島素受體(IR)和胰島素受體底物I (IRSl)的降解。當上調MG53時，引起以胰島素抵抗、肥胖、高血壓、脂代謝紊亂為表征的代謝綜合征。在胰島素抵抗動物模型中，MG53表達水平顯著升高；MG53過表達可以導致肌肉胰島素抵抗，繼而引發代謝綜合征。相反，通過保護IR和IRS1，保持胰島素信號通路完整性，MG53的敲除成功阻止了飲食誘發的代謝綜合征的發生。在機制上，MG53作為E3連接酶，泛素化胰島素受體(IR)和胰島素受體底物I (IRS1)，導致二者通過泛素依賴的途徑降解，構成骨骼肌中控制胰島素信號強度的主要機制。這些發現確切地證實MG53是一個治療代謝紊亂和相關心血管并發癥的新靶點。
[0055]代謝綜合征包含胰島素抵抗、中心型肥胖，脂代謝紊亂和高血壓等一系列的病征，其流行病比率正在增加，已經成為人類健康的重大威脅之一。代謝綜合征使心血管疾病發生幾率上調2倍，2型糖尿病發生幾率上調5倍。胰島素抵抗是包括代謝綜合征、肥胖、2型糖尿病在內的眾多代謝紊亂疾病的根本病因。因為骨骼肌在胰島素刺激引起的糖利用中占70-90%的比例，骨骼肌中胰島素抵抗可能是代謝綜合征和2型糖尿病的主要致病機理。確實，縱向研究提供證據表明骨骼肌胰島素抵抗是代謝綜合征和2型糖尿病病理過程的最早期步驟。然而，人們對骨骼肌胰島素抵抗背后的機制所知甚少。
[0056]在MG53保護小鼠抵抗飲食誘導的代謝綜合征的實驗中，用western blots檢測骨骼肌中MG53含量平均值(胰島素紊亂和代謝疾病大鼠、非人靈長類模型，與年齡性別對應的對照相比)，數據與GAPDH相比后標準化，結果表明，在高脂喂養誘導的肥胖小鼠、db/db糖尿病模型小鼠、自發性高血壓大鼠和非人靈長類代謝綜合征模型中，MG53豐度均上調。在肥胖人類個體中，MG53水平上調也被實驗證實(圖暫欠奉)。這些結果為未曾預料到的MG53和代謝疾病之間的聯系提供了重要線索。
[0057]為了確定MG53在代謝綜合征致病過程中的必要性，從小鼠出生3周起，發明人開始跟蹤監測MG53敲除(MG53-/-)小鼠和對應的野生型同窩出生仔在高脂飲食(60%熱量來自脂肪)和普通飲食情況下的體重和代謝指標變化。在3-38周內，正常飲食情況下，與野生型小鼠相比，MG53敲除小鼠體重、血壓、血清膽固醇、甘油三酯，都沒有明顯變化。然而，在不改變血清胰島素水平的情況下，MG53敲除小鼠血糖含量明顯減少(在38w檢測)。
[0058]在高脂喂養情況下，MG53敲除小鼠和野生型小鼠有顯著不同。經過35周的高脂喂養，野生型小鼠MG53水平上調，發生了以肥胖和高血壓、高血糖、高胰島素、脂代謝紊亂、肝脂肪化為特征的代謝綜合征。值得注意的是MG53敲除小鼠不會發生高脂喂養引發的代謝紊亂。與正常飲食喂養的野生型和MG53敲除小鼠相比，經過35周高脂喂養MG53敲除小鼠的血壓、血糖、血清胰島素、血脂(膽固醇和甘油三酯)水平相當。MG53缺失也顯著減弱了高脂喂養誘導的肥胖，脂肪肝骨骼肌脂肪積聚，脂肪細胞肥大，白色和棕色脂肪含量上調。
[0059]為探究全身性胰島素敏感性與代謝綜合征發生之間的關系，在飲食干預后的不同時間點進行了葡萄糖耐量試驗(GTTs)和胰島素耐量試驗(ITTs)。給予高脂飲食的野生型小鼠在7周時表現出葡萄糖不耐受和胰島素抵抗，即，該現象早于11周時肥胖的發生。隨著高脂飲食的繼續喂養，野生型小鼠的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗逐漸加劇。35周后，高脂飲食導致了胰島的代償性肥大、血清胰島素水平較本底升高7倍，致使葡萄糖刺激胰島素分泌障礙。
[0060]但是，MG53敲除小鼠在高脂飲食下沒有表現出上述任一表型，而是維持著正常的血糖和胰島素水平，即便在經過高脂飲食30周后，MG53敲除的小鼠，未出現野生型小鼠中的胰島素抵抗(糖耐量和胰島素耐量)<^653敲除小鼠的胰腺形態變化和胰島素分泌反應也明顯改善。因此，MG53的敲除可保護小鼠免于高脂飲食誘導的胰島素抵抗和代謝紊亂，以上表明，MG53為高脂飲食誘導的胰島素抵抗和代謝綜合征發生所必需。[0061]為進一步確定MG53的上調是否足以引發代謝紊亂，發明人構建了過表達MG53的轉基因小鼠(MG53Tg)。在38周齡時，其MG53蛋白水平于骨骼肌中升高2.6+0.3倍，于心臟中升高2.6+0.7倍。然而，在MG53轉基因小鼠的非肌肉組織(肺、腦、下丘腦、肝、腸、腎、內臟脂肪和睪丸)，并沒有檢測到MG53，這說明MG53的表達受到一種肌肉特異性方式的嚴格調控。即使在沒有飲食干預的情況下，38周齡的MG53轉基因小鼠出現肥胖和高血壓，并伴隨著血脂異常、高胰島素血癥肥胖和禁食后血糖水平升高。與同窩出生的野生型小鼠相t匕，MG53轉基因小鼠的晝夜能量消耗明顯降低，但日攝食量不變。值得一提的是，葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗顯示，MG53轉基因小鼠的糖代謝和胰島素敏感性存在嚴重的損傷，并伴隨著胰島肥大和葡萄糖刺激胰島素分泌的障礙。解剖學和組織學數據進一步顯示，MG53轉基因小鼠出現了中心性肥胖、脂肪肝、脂肪細胞肥大和骨骼肌內脂質沉積。這些數據表明，MG53的上調對于引發胰島素抵抗和進一步發展為代謝綜合征既是必要的也是充分的。注:MG53的敲除阻斷了飲食誘導的全身胰島素抵抗相關實驗中，野生型和MG53敲除小鼠，給予正常飲食或高脂飲食后在指定時間點進行葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗。胰腺用蘇木精和伊紅染色。葡萄糖(按2克每千克體重腹腔注射)刺激下血清胰島素的濃度變化。野生型和MG53敲除小鼠均給予正常飲食或高脂飲食35周。所有數據均顯示為平均值+/-標準誤。
[0062]胰島素刺激時，胰島素受體的內在酪氨酸激酶活性可引起受體自身的酪氨酸15位自磷酸化。隨后招募并磷 酸化胰島素受體底物如胰島素受體底物I (IRS1)、胰島素受體底物2 (IRS2)，并激活下游的磷酸肌醇-3-激酶，以調節骨骼肌的葡萄糖穩態。為探究MG53介導的胰島素抵抗的分子機制，發明人檢測了 MG53可能調控的位于胰島素受體-1RSl-PI3K-Akt-GSK3-13途徑的信號分子。在胰島素抵抗和代謝紊亂的MG53轉基因小鼠模型中，骨骼肌內由胰島素刺激引起的胰島素受體(β亞基)和IRSl的酪氨酸磷酸化，以及Akt473位絲氨酸的磷酸化均被阻斷。同時，這些小鼠骨骼肌中，胰島素受體和胰島素受體底物I的蛋白表達水平顯著減少，但其mRNA水平保持不變。為區別MG53過表達的直接效應和代償性反應，同時采用腺病毒轉染系統，過表達MG53基因于培養的C2C12肌管細胞。MG53升高表達了 3.5±0.2倍，并顯著降低了胰島素受體和IRSl的蛋白水平，但其mRNA水平不變。MG53的過表達也阻斷了胰島素誘導的胰島素受體、IRSl，Akt和GSK3-0的活化，這表明在細胞水平上調MG53成功模擬了 MG53轉基因小鼠的典型特征。因此，發明人的體內和體外實驗數據均證實MG53的上調表達足以同時降低胰島素受體和胰島素受體底物從而抑制胰島素信號轉導的這兩個關鍵步驟。注:在過表達MG53引發全身胰島素抵抗和代謝綜合征的試驗中，通過野生型和MG53轉基因小鼠的體重、及38周齡的野生型和MG53轉基因小鼠的收縮壓和舒張壓、血清膽固醇、甘油三酯、血清胰島素及在禁食和進食狀態的血糖水平，及30周高脂飲食喂養的野生型和MG53敲除小鼠的葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗、38周齡的野生型和MG53轉基因小鼠胰腺、38周齡的野生型和MG53轉基因小鼠葡萄糖(按2克每千克體重腹腔注射)刺激下的血清胰島素的濃度變化，或其相對于基線的變化百分比來做實驗指標和數據進行統計。
[0063]高脂飲食喂養的野生型小鼠MG53表達量增高，和MG53過表達一樣，骨骼肌胰島素信號被嚴重抑制了，同時IR和IRSl蛋白水平降低，mRNA水平不變。此外，伴隨著MG53上調，IR和IRSl后下調在各種用于研究的胰島素抵抗嚙齒類模型中是一個普遍的現象，就像肥胖或2型糖尿病動物模型和人一樣。在其他實驗中，還證明了即使在高脂飲食導致的代謝壓力下，MG53缺失可以使小鼠維持IR和IRSl的完整性以及全身的胰島素敏感性。特別地，在MG53敲除小鼠中高脂飲食無法降低IR和IRSl的豐度。實際上，MG53基因水平的缺失會使骨骼肌中IR和IRSl的顯著積累，可能導致MG53敲除小鼠相對于其同窩野生型對照血糖水平降低。相對于野生型正常飲食小鼠，MG53敲除小鼠因胰島素引起的IR、IRSUAkt和GSK3-0磷酸化會顯著增加。因此，MG53上調對于高脂飲食和代謝疾病引起的骨骼肌IR和IRSl下調看起來必不可少。
[0064]之后，尋找決定MG53介導的骨骼肌特異的胰島素抵抗發展成為全身的代謝紊亂的原因。為了該目的，發明人跟蹤了 MG53TG小鼠和高脂飲食喂養的野生型小鼠多種器官代謝紊亂發生的不同時期。結果顯示通過過表達MG53和高脂飲食誘導骨骼肌胰島素抵抗遠早于全身代謝紊亂的發展(包括肥胖和多器官胰島素抵抗)。6周齡的MG53TG體重和野生型對照類似，但是肌肉的胰島素信號明顯被損傷了，而肝臟和腹部脂肪的胰島素信號卻沒有變化。同樣的，高脂飲食喂養I周的野生型小鼠會導致MG53顯著上調和骨骼肌胰島素信號損害，這在高脂7周之后才出現的系統性葡萄糖胰島素不耐受和11周出現明顯的肥胖之前。這之后，正常飲食的MG53TG小鼠(38周)和高脂飲食的野生型小鼠(高脂喂養35周)的肝臟和脂肪組織才發展為完全的胰島素抵抗。這些數據和MG53缺失對于代謝紊亂重要的保護作用一起，強烈說明MG53介導的骨骼肌胰島素抵抗在病理發生過程是一個重要的因素。與之前的發現一致的是，在人和動物模型上的研究也揭示了肌肉胰島素信號降低在肥胖和葡萄糖不耐受病理過程中是一個重要的環節。注:MG53調節的胰島素信號的相關實驗，用代表性的和平均western blots數據顯示38周野生型和MG53轉基因小鼠或正常飲食或高脂飲食喂養的MG53敲除小鼠和他們的野生型同窩小鼠胰島素誘導的IR-β和IRSl的酪氨酸磷酸化，Akt絲氨酸磷酸化和他們的總蛋白水平。磷酸化蛋白和總蛋白相對于GAPDH標準化，呈現為其相對于野生型本底的倍數。代表性的western印記和統計數據顯示胰島素引起6周、38周野生型和MG53轉基因小鼠骨骼肌、肝臟、腹脂Akt的磷酸化。
[0065]因為IRSl是IR和胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)信號通路共同的節點，發明人還研究了 MG53對于肌肉除胰島素信號之外IGF-1信號的影響。通過比較不同劑量胰島素或IGF-1誘導的野生型和MG53缺陷小鼠骨骼肌IRSl酪氨酸磷酸化，發明人發現MG53優先把在胰島素信號中的IRSl作為目標。特別地，盡管MG53缺失增加了胰島素刺激的IRSl酪氨酸磷酸化的劑量效應，這加強了 IGF-1在高濃度的效果，而不是低濃度的IGF-1。如果MG53選擇性的把胰島素受體介導的IRSl信號作為目標，那么MG53調節IGF-1受體信號應該歸功于胰島素受體和IGF-1受體的異二聚化或高劑量IGF-1引起的胰島素受體交叉激活。
[0066]由于MG53在氨基端包含一個經典的E3泛素化連接酶RING finger結構域(或稱RING手指區域，或RING結構域)，發明人提出MG53可能作為一個肌肉特異的E3泛素化連接酶作用胰島素受體和IRSl進行泛素依賴的降解。多種證據支持這個假設。首先，免疫共沉淀揭示了內源性MG53和胰島素受體、IRSl之間有物理相互作用，在HEK293細胞外源性表達MG53和IR、IRSl也是如此。其二，在MG53TG小鼠骨骼肌中，過表達MG53可以提高IR和IRSl的泛素化。另外 ，高脂飲食增加了野生型小鼠骨骼肌胰島素受體和IRSl的泛素化，而不是MG53敲除。現有的結果證明了 MG53 E3泛素化連接酶促進了泛素依賴的骨骼肌IR和IRSl降解，盡管在(FBX040是肌肉特異性的)某些特定的細胞培養系統和組織其他一些E3連接酶和IRSl降解有關。相反的，無論是MG53過表達還是敲除，與血糖穩態有關骨骼肌IRS2、GLUT1或GLUT4的蛋白豐度卻沒有改變，說明他們不是MG53的底物。
[0067]根據以前對其他RING類型E3連接酶的了解，序列分析預測到MG53 N端的RING手指區域中的半胱氨酸豐富區，尤其是7個半胱氨酸，特別是第一個半胱氨酸(半胱氨酸14，能與鋅離子結合)可能是MG53作為E3連接酶功能的關鍵位點。的確，RING手指區的刪除或者半胱氨酸位點的丙胺酸突變替換能夠徹底的去除或者明顯地緩解MG53對IR和IRSl的泛素化程度。需要注意的是，與野生型MG53不同，這些MG53突變體既沒有影響IR和IRSl的總蛋白量，也沒有影響胰島素促使的IR-1RSl-AKT-GSK3i3信號途徑的激活。因此，在分子水平，RING finger區是MG53實現E3連接酶功能所必需的。而且，利用clasto-lactacystin- β -lactone ( β -lac)對蛋白酶體抑制能夠徹底的去除MG53引起的IR和IRSl蛋白的下調，并恢復IR和IRSl酪氨酸的磷酸化，以及AKT的絲氨酸473的磷酸化，還有胰島素引起的葡萄糖攝取，這證明了 MG53介導的胰島素信號通路的抑制是通過蛋白酶體系統。在利用MG132，另一種蛋白酶體抑制劑的實驗中也得到了類似結果。總之，我們的體內實驗和體外實驗的實驗結果證明，MG53是一個新的E3連接酶，它能夠通過泛素依賴的降解，直接調節IR和IRSl的蛋白穩定性。這個發現證實了 MG53能夠同時下調IR和IRSl，是一個解釋全身胰島素抵抗和代謝疾病的潛在機制，而RING手指區域中的半胱氨酸是MG53介導IR和IRSl降解，產生胰島素抵抗，發生全身肥胖和代謝性疾病所必需的。
[0068]歸納起來，盡管MG53作為膜修復和心肌保護已經眾所周知，發明人在這里展示了 MG53是一個在胰島素抵抗和代謝紊亂的動物模型中普遍高表達的，并且這種骨骼肌特異性的MG53高表達做為啟動全身胰島素抵抗和代謝綜合癥是必需的。MG53作為一個新的肌肉特異性E3連接酶能夠導致IR和IRSl的泛素依賴性降解，成為了一個決定性的骨骼肌胰島素信號的負向調節者，從而引起全身的胰島素信號及代謝的缺陷。而RING手指區域中的半胱氨酸是MG53發揮 上述代謝相關作用必需的，突變RING手指區域中的半胱氨酸能夠使MG53喪失引起胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征的作用。
[0069]這些發現不僅定義了 MG53是一個骨骼肌胰島素敏感性的負向調節者，還建立了MG53介導的肌肉胰島素信號抑制是一個導致全身胰島素抵抗和代謝綜合征的重要的機制。這也標志著MG53 E3連接酶能夠被作為一個治療各種代謝疾病，包括肥胖、2型糖尿病和相關的心血管并發癥的重要潛在靶點。
[0070]實驗方法總結:
[0071]試劑和材料:PY100，p-Akt，p-GSK3-0以及 IRSl 的抗體均來自 Cell SignalingTechnology公司；MG53和GLUTl的抗體來自Abcam公司；p-1R_i3和IRSl的抗體來自Upstate 公司；IR_i3, GAPDH, GSK3- β 和 GLUT4 的抗體來自 Santa Cruze Biotechnology公司；MG132, clasto-lactacystin β-lactone (β -lac), ant1-b-actin，Flag, Myc andinsulin 抗體來自 Sigma-Aldrich 公司。2-(N_(7-nitrobenz-2-oxa_l，3-diazol -4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG)來自Invitrogen公司。人的膜島素樣生長因子-1(IGF-1)來自PeproTech公司。如無特別說明，其他化學試劑均來自Sigma-Aldrich公司。
[0072]胰島素抵抗的動物模型:糖尿病(db/db)小鼠(年齡為25周的雄性糖尿病小鼠)和對照組瘦小鼠來自Jackson Laboratory公司。自發性高血壓大鼠(年齡為12個月的雄性自發性高血壓大鼠)和同源同齡雄性正常血壓大鼠來自北京市維通利華公司。自發性胰島素抵抗和代謝綜合征的非人靈長類動物模型的開展和鑒定在之前的文獻中已有報道。
[0073]MG53基因敲除小鼠和飲食干預:所有動物程序和安樂死術都是按照中國北京大學動物研究委員會批準的協議來執行的，并且符合實驗動物護理和使用指南(1985年由美國國家衛生研究所修訂發行，發行號為86-23)。所有動物都維持在中國北京大學實驗動物中心的一個光照/黑暗循環的溫控屏障設施里，他們可自由獲取食物和水。本研究僅使用雄性動物為研究材料。MG53基因敲除小鼠的構建之前已有說明。MG53基因敲除小鼠和野生型同窩出生小鼠從出生三周開始進行高脂飲食(60%卡路里來自脂肪，飲食研究有限公司，貨號為D12492)和正常飲食(11.4%的卡路里來自脂肪，中國軍事醫學科學學院)的干預。
[0074]MG53轉基因小鼠:鼠科MG53基因全長cDNA編碼序列被克隆到pUC_CAGGS質粒的XhoI位點，受雞beta肌動蛋白啟動子調控。經SalI酶切線性化并通過凝膠純化以后，這個片段被顯微注射到小鼠的受精卵內。PCR用來進行基因型鑒定。
[0075]質粒和腺病毒載體:通過PCR從小鼠cDNA文庫擴增了 MG53全長序列和缺失了RING結構域的MG53序列 (Λ RING)，并從BglII和XbaI兩個酶切位點插入p3XFLAG_CMV_10的表達載體(來自Sigma-Aldrich公司)。全長的MG53序列也經KpnI和XhoI兩個酶切位點嵌入pcDNA4/T0/Myc_His B的表達載體(來自Invitrogen公司)。C14A (第14位的半胱氨酸被丙氨酸替代)的MG53突變體是利用快速點突變試劑盒的策略對野生型(全長)MG53質粒改造而成。胰島素受體序列是從pBABE-bleo人胰島素受體B (來自Addgene公司)亞克隆而來，并經HindIII和XbaI兩個酶切位點嵌入pcDNA4/T0/Myc-His B的表達載體(來自Invitrogen公司)。胰島素受體底物I (IRSl)是從pBS-m IRSl (來自Invitrogen公司)亞克隆而來，并經HindIII和NotI兩個酶切位點嵌入pcDNA4/T0/Myc-His B的表達載體(來自Invitrogen公司)。N端帶HA標簽的泛素表達質粒和C端帶FLAG標簽的胰島素受體表達質粒分別有陳博士和1.Leibiger提供。表達GFP和融合表達GFP-MG53的腺病毒已在之前做出說明。
[0076]細胞培養，腺病毒感染和質粒轉染:C2C12成肌細胞(來自細胞資源中心，IBMS，中國醫學科學院/中國協和醫科大學)置于37攝氏度含5% 二氧化碳的細胞培養箱中，經Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)培養，該培養基中補充有10%牛胎兒血清(Sigma-Aldrich公司)，0.llg/L丙酮酸鈉和I %的青霉素-鏈霉素。當C2C12成肌細胞90%密度時，我們通過腺病毒感染或質粒轉染進行基因導入。之后，細胞在含有2%的馬血清的DMEM培養基里培養四天分化成肌管。
[0077]免疫共沉淀，免疫印跡:組織或細胞在冰上經裂解緩沖液(pH7.6的30mM的HEPES，100mM的氯化鈉，0.5% NP-40，和蛋白酶抑制劑混合物)裂解10分鐘，裂解物以13,000 rpm離心10分鐘。免疫共沉淀和免疫印跡檢測在之前已作說明10.胰島素受體底物I (IRSl)的酪氨酸磷酸化的分析，是先利用IRSl抗體從總裂解物中免疫沉淀IRSl，然后用PYlOO抗體進行免疫印跡分析。其他蛋白均用特異抗體進行分析。
[0078]泛素化分析:轉染了特定質粒的C2C12肌管細胞用IOmM的MG132處理12小時，然后用冰冷的磷酸緩沖溶液PBS漂洗細胞，用RIPA裂解液(200mM的NaCl，pH值8.0的20mM的 Tris-Cl，在 ImM 的 EDTA，ImM 的 EGTA，I % NP-40，0.5 % 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS, 2.5 mM焦磷酸鈉，I mM的甘油磷酸鹽，I mM四氧嘧啶，蛋白酶抑制劑混合物及IOmM的MG132)于冰上裂解10分鐘，然后13000 rpm離心10分鐘。上清經蛋白A瓊脂糖4快速流動(GEHealthcare公司)處理I小時，然后和抗Myc抗體，蛋白A瓊脂糖珠在4攝氏度孵育4小時，最后用RIPA緩沖液洗滌該樹脂三次，洗脫下來用于免疫印跡分析。
[0079]為了檢測在體水平泛素化情況，骨骼肌肉在液氮中磨成粉末，用上述提到的RIPA緩沖液于4攝氏度裂解I小時，然后13000 rpm離心10分鐘。蛋白A瓊脂糖珠于特定抗體于4攝氏度孵育8小時，然后和700ug裂解物4攝氏度孵育3小時.最后用RIPA緩沖液洗滌免疫沉淀物，用2XSDS樣品緩沖液洗脫下來用于免疫印跡分析。
[0080]組織學分析:用于組織學分析的組織(肝臟，胰腺，棕色脂肪，內臟脂肪和骨骼肌)被固定在4%多聚甲醛(pH7.4)中過夜，包埋在石蠟中，并在5 um連續切片。并對他們進行標準的蘇木精和曙紅染色以及免疫熒光染色。
[0081]血壓測量:收縮壓和舒張壓的測量是以一種非侵入性的方法在有意識的小鼠上，用尾套系統加熱至37攝氏度(Visitech BP-2000血壓分析系統)完成的。小鼠對該設備的適應期為7-10天，之后經歷了兩個周期的測量，每天測量10個動物，為期三天至血壓穩定。
[0082]2-NBDG攝取測定:導入特定基因的C2C12肌管細胞在不含血清的DMEM培養基中培養12小時，然后維持在的Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液(128mM的NaCl，1.4mM氯化鈣，
1.4mM干燥的硫酸鎂，5.2mM氯化鉀，IOmM的磷酸氫二鈉和2mM丙酮酸鈉，pH7.4)中于37攝氏度下孵育30分鐘，隨后用0.1uM的胰島素和100uM2 -NBDG (Invitrogen)于37攝氏度處理6小時。然后，將細胞用冰冷的PBS緩沖液洗滌三次，用0.5%的胰蛋白酶將細胞消化下來，1000rpm離心5分鐘，再用PBS重新懸浮細胞，最后用FACSCalibur流式細胞儀(BD)測定FLl的熒光值31。
[0083]代謝測量:在葡萄糖耐量實驗中，小鼠禁食過夜(16小時)，然后腹腔注射D-葡萄糖(2g/kg體重)。在胰島素耐量實驗中，小鼠隨機喂養和腹腔注射牛胰島素(0.75U/kg體重，Sigma-Aldrich公司)。為了檢測葡萄糖刺激胰島素的釋放，小鼠禁食16 h后腹腔注射D-葡萄糖(2g/kg)。收集注射前和注射后不同時間點的尾靜脈血。測血糖和胰島素濃度的測量是利用一 AccuCheck的血糖儀(羅氏診斷公司制)和凌嘉研究的ELISA試劑盒(目錄的數量EZRM1-13K)分別進行的。血清甘油三酯和膽固醇濃度是利用試劑盒(目錄編號分別為290-63701 和 294-65801)測量的。
[0084]對于代謝率分析，小鼠分別獨立安置在一個12小時光照/黑暗的環境內。一個綜合性的動物代謝監控系統(CLAMS;哥倫布儀器公司)被用來評價小鼠連續超過72小時的氧耗量(V02)和二氧化碳生產(VC02)。能源支出的計算公式為:能源支出=(3.815+1.232V02/VC02) XV02。
[0085]統計:統計顯著性檢驗組間差異采用單因素方差分析(ANOVA)或重復測量的方差分析，適當時候用Bonferroni后t檢驗。所有P值小于0.05認為顯著。數據表示為mean+s.e.nio
【專利附圖】

【附圖說明】
[0086]圖1:MG53和MG53C14A都能夠保護缺氧引起的心肌細胞的損傷。
[0087]在培養的心肌細胞中，通過細胞內ATP含量(左圖)和細胞外乳酸脫氫酶(LDH)濃度(右圖)檢測缺氧引起過表達對照載體(vector)的細胞出現明顯的死亡，而在過表達MG53或者MG53C14A的細胞中，細胞的死亡均明顯減少。
[0088]圖2:MG53敲除能夠保護高脂飲食引起的代謝疾病。
[0089]a正常飲食或高脂飲食喂養不同時間的野生型和MG53敲除小鼠的體重變化。b_e正常飲食或高脂飲食喂養35周的野生型和MG53敲除小鼠的血壓(b)、血糖(C)、血胰島素(d)、血膽固醇(e)和血甘油三酯(f)數據。
[0090]圖3:MG53敲除能夠保護高脂飲食引起的胰島素抵抗。
[0091]a正常飲食或高脂飲食喂養30周的野生型和MG53敲除小鼠的糖耐量(左)和胰島素耐量(右)數據。b正常飲食或高脂飲食喂養30周的野生型和MG53敲除小鼠中葡萄糖引起的胰島素分泌數據。
[0092]圖4:MG53轉基因能夠引起的肥胖和代謝疾病。
[0093]a用western blots實驗檢測MG53轉基因小鼠的不同組織中MG53的表達量。b正常飲食喂養不同時間的野生型和MG53轉基因小鼠的體重數據。c正常飲食喂養38周的野生型和MG53轉基因小鼠的血胰島素、血糖、血壓和血膽固醇數據。
[0094]圖5:MG53敲除能夠保護高脂飲食引起的胰島素抵抗。
[0095]a正常飲食喂養38周的野生型和MG53轉基因小鼠的骨骼肌中，胰島素(Insulin)刺激引起的IR，IRSl和Akt的磷酸化和總蛋白量變化。左側是代表性的western blots圖，右側是左邊數據的統計圖。b正常飲食或高脂飲食喂養35周的野生型和MG53敲除小鼠的骨骼肌中，胰島素(Insulin)刺激引起的IR，IRSl和Akt的磷酸化和總蛋白量變化。左側是代表性的western blots圖,右側是左邊數據的統計圖。
[0096]圖6:MG53能夠與IR和IRSl相互作用，并增加其泛素化。
[0097]a通過免疫共沉淀實驗檢測野生型小鼠的骨骼肌中，MG53與IR和IRSl相互作用。b正常飲食喂養38周的野生型和MG53轉基因小鼠的骨骼肌中，IR (上)和IRSl (下)的泛素化程度數據。c正常飲食或高脂飲食喂養35周的野生型和MG53敲除小鼠的骨骼肌中，IR (上)和IRSl (下)的泛素化程度數據。
[0098]圖7 =RNG手指區刪除和C14A突變的MG53，不能引起IR和IRSl的泛素化增加，而且不能抑制胰島素信號。
[0099]a在C2C12肌管細胞中，MG53的過表達(Flag_FL_MG53)能顯著引起IR (左)和IRSl(右)的泛素化增加，但RNG手指區刪除(Flag- Δ RNG)和C14A突變(Flag_C14A)的MG53過表達，對于IR (左)和IRSl (右)的泛素化無影響。b C2C12肌管細胞中，通過westernblots實驗檢測MG53的過表達(FL-MG53)能顯著抑制胰島素(Insulin)引起的IR，IRSl和Akt的磷酸化，減少IR和IRSl的總量；RNG手指區刪除(八8如)和(:14八突變((:144)的1^53無類似的作用。左為代表性的western blots圖，右為左邊數據的統計圖。
[0100]圖8:蛋白酶體抑制劑能抑制MG53引起的胰島素信號變化。
[0101]a C2C12肌管細胞中，通過western blots實驗檢測MG53的過表達(Adv_MG53)能夠顯著抑制胰島素(Insulin)引起的IR，IRSl和Akt的磷酸化，并減少IR和IRSl的總量，而利用蛋白酶體抑制劑β -1ac能夠抑制MG53的作用。左側是代表性的western blots圖，右側是左邊數據的統計圖。b C2C12肌管細胞中，胰島素(Insulin)引起細胞對于葡萄糖衍生物(2-NBDG)的攝取增加，而MG53過表達(Flag_MG53)能夠抑制胰島素引起的2-NBDG的攝取，MG53的作用能夠被蛋白酶體抑制劑β -1ac抑制。具體實施方案
[0102]以下實施例中采用的試劑盒是市售可得到的北京全式金公司的EasyMutagenesis System。
[0103]實施例1.MG53蛋白突變體，即，MG53突變體:MG53C14A。
[0104]MG53C14A的突變過程:
[0105]1、設計突變引物，使上下游引物都帶有突變位點，并且重疊區域為18_27bp。引物序列為:
[0106]C14A primer 1:
[0107]5， -gaactgtccgccccactgtgcttgcagctg-3，
[0108]C14A primer 2:
[0109]5， - agcacagtggggcggacagttcctgacgca_3，
[0110]2、以突變質粒200ng作為模板，使用高保真DNA聚合酶，用特異性突變引物進行PCR反應擴增。反應產物用瓊脂糖凝膠鑒定。
[0111]PCR反應條件如下:
[0112]95 °C IOmin
[0113]950C 30sec
[0114]55°C 30sec 20 Cycles
[0115]72°C 3.5sec
[0116]72 °C 5min
[0117]4°CHold (維持)
[0118]3、利用DpnI進行酶切反應處理PCR產物，反應條件如下:10uL PCR產物加入IuLDpnI，37°C處理過夜。
[0119]4、轉化大腸桿菌感受態細胞T0P10:融解感受態T0P10，加入處理后的PCR產物，放在冰上孵育30分鐘，42oC熱刺激60秒，加入LB, 37oC孵育45分鐘。涂氨芐抗性LB平板。37oC過夜培養16小時。
[0120]5、挑取平板上的單菌落，DNA測序檢測突變結果。
[0121]參考:Stratagene的 QuikChange Site-directed Mutagenesis kit
[0122]北京全式金公司Easy Mutagenesis System。說明書可參見如下公開內容:http://www.transgen.com.cn/uploadfiIe/201111/20111109161357731.pdf.[0123]實施例2.MG53蛋白的突變體，BP, MG53突變體:MG53C17A。
[0124]MG53C17A的突變過程:
[0125]引物序列為:
[0126]C17A primer 1:
[0127]5， - gcccactggccttgcagctgttcgatgcgc-3，
[0128]C17A primer 2:
[0129]5， - cagctgcaaggccagtgggcaggacagttc_3，
[0130]其他步驟同C14A。
[0131]實施例3.MG53 突變體:MG53C29A。[0132]MG53C29A的突變過程:
[0133]引物序列為:
[0134]C29A primer 1:
[0135]5， - acggctgaggctggccacagtttctgccgt-3，
[0136]C29A primer 2:
[0137]5， - actgtggccagcctcagccgtcactggcgc _3，
[0138]其他步驟同C14A。或可參見實施例1或2.[0139]實施例4.MG53 突變體:MG53C34A。
[0140]MG53C34A的突變過程:
[0141]引物序列為:
[0142]C34A primer 1:
[0143]5， - cacagtttcgcccgtgcctgcctgatccgg-3，
[0144]C34A primer 2:
[0145]5， - gcaggcacgggcgaaactgtggccacactc-3，
[0146]其他步驟同C14A。
[0147]實施例5.MG53 突變體:MG53C37A。
[0148]MG53C37A的突變過程:
[0149]引物序列為:
[0150]C37A primer 1:
[0151]5， - tgccgtgccgccctgatccgggtggcaggg _3，
[0152]C37A primer 2:
[0153]5， - ccggatcagggcggcacggcagaaactgtg _3，
[0154]其他步驟同C14A。或可參見實施例f 4.[0155]實施例6.MG53 突變體:MG53C53A。
[0156]MG53C53A的突變過程:
[0157]引物序列為:
[0158]C53A primer 1:
[0159]5， - acagttgccgctccctgttgtcaggcacct-3，
[0160]C53A primer 2:
[0161]5， - acaacagggagcggcaactgtgccgtccgc _3，
[0162]其他步驟同C14A。
[0163]實施例7.MG5 3 突變體:MG53C56A。
[0164]MG53C56A的突變過程:
[0165]引物序列為:
[0166]C56A primer 1:
[0167]5， - tgtccctgtgctcaggcacctacacggccg _3，
[0168]C56A primer 2:
[0169]5， - aggtgcctgagcacagggacaggcaactgt-3，
[0170]其他步驟同C14A。[0171]實施例8.MG53 突變體:MG53C14G。
[0172]MG53C14G的突變過程:
[0173]引物序列為:
[0174]C14G primer 1:
[0175]5，-gaactgtccggcccactgtgcttgcagctg-3，
[0176]C14G primer 2:
[0177]5，- agcacagtgggccggacagttcctgacgca-3，
[0178]其他步驟同C14A。
[0179]實施例9.MG53 突變體:MG53C17G。
[0180]MG53C17G的突變過程:
[0181]引物序列為:
[0182]C17G primer 1:
[0183]5， - gcccactgggcttgcagctgttcgatgcgc-3，
[0184]C17G primer 2:
[0185]5， - cagctgcaagcccagtgggcaggacagttc-3，
[0186]其他步驟同C14A。
[0187]實施例10.MG53 突變體:MG53C29G。
[0188]MG53C29G的突變過程:
[0189]引物序列為:
[0190]C29G primer 1:
[0191]5， - acggctgagggtggccacagtttctgccgt-3，
[0192]C29G primer 2:
[0193]5， - actgtggccaccctcagccgtcactggcgc _3，
[0194]其他步驟同C14A。
[0195]實施例11.MG53 突變體:MG53C34G。
[0196]MG53C34G的突變過程:
[0197]引物序列為:
[0198]C34G primer 1:
[0199]5， - cacagtttcggccgtgcctgcctgatccgg-3，
[0200]C34G primer 2:
[0201]5， - gcaggcacggccgaaactgtggccacactc-3，
[0202]其他步驟同C14A。
[0203]實施例12.MG53 突變體:MG53C37G。
[0204]MG53C37G的突變過程:
[0205]引物序列為:
[0206]C37G primer 1:
[0207]5， - tgccgtgccggcct gatccgggtggcaggg _3，
[0208]C37G primer 2:
[0209]5， - ccggatcaggccggcacggcagaaactgtg _3，[0210]其他步驟同C14A。
[0211]實施例13.MG53 突變體:MG53C53G。
[0212]MG53C53G的突變過程:
[0213]引物序列為:
[0214]C53G primer 1:
[0215]5， - acagttgccggtccctgttgtcaggcacct-3，
[0216]C53G primer 2:
[0217]5， - acaacagggaccggcaactgtgccgtccgc _3，
[0218]其他步驟同C14A。
[0219]實施例14.MG53 突變體:MG53C56G。
[0220]MG53C56G的突變過程:
[0221]引物序列為:
[0222]C56G primer 1:
[0223]5， - tgtccctgtggtcaggcacctacacggccg _3，
[0224]C56G primer 2:
[0225]5， - aggtgcctgaccacagggacaggcaactgt_3，
[0226]其他步驟同C14A。
[0227]實施例15.MG53 突變體:MG53C14L。
[0228]MG53C14L的突變過程:
[0229]引物序列為:
[0230]C14L primer 1:
[0231]5， -gaactgtccctcccactgtgcttgcagctg-3，
[0232]C14L primer 2:
[0233]5， - agcacagtgggagggacagttcctgacgca_3，
[0234]其他步驟同C14A。
[0235]實施例16.MG53 突變體:MG53C14V。
[0236]MG53C14V的突變過程:
[0237]引物序列為:
[0238]C14V primer 1:
[0239]5， -gaactgtccgtcccactgtgcttgcagctg-3，
[0240]C14V primer 2:
[0241]5， - agcacagtgggacggacagttcctgacgca_3，
[0242]其他步驟同C14A。
[0243]實施例17.MG53 突變體:MG53C14I。
[0244]MG53C14I的突變過程:
[0245]引物序列為:
[0246]C14I primer 1:
[0247]5， -gaactgtccatcccactgtgcttgcagctg-3，
[0248]C14I primer 2:[0249]5， - agcacagtgggatggacagttcctgacgca_3，
[0250]其他步驟同C14A。
[0251]實施例18.MG53 突變體:MG53C14P。
[0252]MG53C14P的突變過程:
[0253]引物序列為:
[0254]C14P primer 1:
[0255]5， -gaactgtccccaccactgtgcttgcagctg-3，
[0256]C14P primer 2:
[0257]5， - agcacagtggtggggacagttcctgacgca_3，
[0258]其他步驟同C14A。
[0259]實施例19.MG53 突變體:MG53C17L。
[0260]MG53C17L的突變過程:
[0261]引物序列為:
[0262]C17L primer 1:
[0263]5， - gcccactgctcttgcagctgttcgatgcgc-3，
[0264]C17L primer 2:
[0265]5， - cagctgcaagagcagtgggcaggacagttc_3，
[0266]其他步驟同C14A。
[0267]實施例20.MG53 突變體:MG53C29L。
[0268]MG53C29L的突變過程:
[0269]引物序列為:
[0270]C29L primer 1:
[0271]5， -acggctgagcttggccacagtttctgccgt-3，
[0272]C29L primer 2:
[0273]5， -actgtggccaagctcagccgtcactggcgc-3，
[0274]其他步驟同C14A。
[0275]經實驗證實，包括實施例1所述的MG53C14A在內的MG53突變體，即，MG53C14A、MG53C17A、MG53C29A、MG53C34A、MG53C37A、MG53C53A、MG53C56A 均對心臟能產生保護作用，可保護心臟損傷。MG53含量的增加在保護心臟的同時，會引起胰島素抵抗、肥胖和糖尿病，MG53在保護心臟的同時，伴有胰島素抵抗、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等副作用。而MG53的第14位點、第17位點、第29位點、第34位點、第37位點、第53位點、第56位點的半胱氨酸，特別是第14位點的C，是MG53引起胰島素抵抗、肥胖和糖尿病所必需的，也就是說上述位點的半胱氨酸尤其是第14位C發生突變的MG53突變體(例如MG53C14A)不能引起胰島素抵抗、肥胖和糖尿病，卻仍然能夠保護心肌細胞的損傷，即，MG53突變體(包括MG53C14A)能夠在不引起胰島素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用等前提下，行使心臟保護功倉泛。
[0276]本發明所述的MG53突變體，包括上述實施例的MG53突變體，其序列的屬種包括了靈長類動物(例如:人)、大鼠和小鼠。
[0277]以上旨在進一步說明本發明，并不對本發明的范圍加以限制。本領域技術人員對在此公開的實施方 案可進行并不偏離本發明范疇和精神的改進和變化。
【權利要求】
1.一種MG53突變體，其特征在于，該MG53突變體為MG53的N端的RING結構域7個半胱氨酸中的任一個或兩個或兩個以上的半胱氨酸突變為非極性氨基酸的突變體；該7個半胱氨酸分別是在RING結構域的第14位點、第17位點、第29位點、第34位點、第37位點、第53位點、第56位點。
2.如權利要求1所述的MG53突變體，其特征在于，所述的非極性氨基酸為丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。
3.如權利要求2所述的MG53突變體，其特征在于，所述的非極性氨基酸為丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸或異亮氨酸。
4.如權利要求3所述的MG53突變體，其特征在于，所述的非極性氨基酸為丙氨酸，所述的 MG53 突變體選自 MG53C14A、MG53C17A、MG53C29A、MG53C34A、MG53C37A、MG53C53A、MG53C56A中的任意一種。
5.一種MG53突變體的突變方法，其特征在于，該方法是利用定點突變試劑盒對野生型MG53質粒的全長序列進行定點突變，得到所述的MG53突變體。
6.如權利要求5所述的突變方法，其特征在于，利用定點突變試劑盒對野生型MG53質粒的全長序列進行突變，得到第14位的半胱氨酸突變為非極性氨基酸的MG53突變體。
7.如權利要求6所述的改造方法，其特征在于，該定點突變的過程為: (1)先設計突變引物，使上下游引物都帶有突變位點，重疊區域為18-27bp； (2)以突變質粒作為模板，使用DNA聚合酶，用特異性突變引物進行PCR反應擴增，反應產物用瓊脂糖凝膠鑒定； (3)利用DpnI進行酶切反應處理PCR產物； (4)轉化大腸桿菌感受態細胞T0P10，融解感受態T0P10，加入處理后的PCR產物，冰上孵育，加入LB,孵育，涂氨芐抗性LB平板，培養，挑取平板上的單菌落，DNA測序檢測得突變結果為陽性，即是。
8.權利要求1所述的MG53突變體在制備治療心肌損傷的藥物中的用途。
9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述藥物包括治療與心肌細胞損傷相關的疾病的藥物，該疾病包 括心肌缺血、心臟缺血/再灌損傷、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心臟破裂的藥物。
10.如權利要求8或9所述的用途，其特征在于，該MG53突變體為MG53C14A，其為MG53C14A在制備治療心肌損傷的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P9/04GK103965342SQ201310047584
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優先權日:2013年1月25日
【發明者】肖瑞平, 曹春梅, 張巖, 呂鳳祥 申請人:北京博雅和瑞科技有限公司