家豬腫瘤壞死因子突變體的構建及蛋白表達純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物基因工程領域，具體涉及家豬腫瘤壞死因子突變體基因的構建、 表達、蛋白純化及活性鑒定技術。
【背景技術】
[0002] 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF-α )是1975年發現的一種具有抗 腫瘤效果的細胞因子，是迄今發現的對腫瘤細胞殺傷性最好的細胞因子，屬于腫瘤壞死因 子超家族成員。TNF-α除對腫瘤細胞具有直接的抑制增殖和細胞壞死作用外，對其他細 胞（包括心肌細胞）的生長分化也有影響，同時還有抗病毒及細菌感染；刺激T細胞、B細 胞、單核巨噬細胞等，使其功能增強；誘發炎癥反應，促進IL1、IL2、IL6等的產生及分泌； 促進EGFR及主要組織相容性抗原II類抗原（MHC II Ag)等的表達等，在宿主防御反應中起 重要作用。TNF-α主要是通過與祀細胞膜上腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor rec印tor，TNFR)結合，實現其細胞毒性、抗病毒細菌感染、免疫調節等生物學功能，具有廣 泛的生物學活性。
[0003] 人用TNF-α能被腎臟快速排泄及被各種蛋白酶分解，在體內半衰期很短 (15-30min)，而發揮作用需要12-36h。若頻繁大劑量注射，則會導致嚴重的不良反應，如 發熱、惡心嘔吐、頭痛、低血壓等，甚至能引起休克、死亡。TNF-α在人體的耐受量僅為其有 效量的1/10?1/50。因此，用TNF-α治療癌癥被局限于腫瘤組織內給藥，以獲得較高的 局部濃度。為了更好的利用TNF- α，提高其生物學活性，降低其系統毒副作用，近年來，國內 外科學家通過定點突變技術對TNF-α基因進行定點突變，從而達到增加 TNF-α活性并降 低其毒性的目的。2003年第四軍醫大學生物技術中心的張英起教授通過蛋白質工程技術對 TNF- α重組改造之后獲得高活性低毒性的新型突變體，突變后的腫瘤壞死因子與天然重組 人腫瘤壞死因子相比，毒性降低了 100到1000倍，但對腫瘤細胞的殺傷活性和抑瘤作用達 到60%以上。該研宄已經獲得國家一類新藥物制品證書，這是目前世界上第一個被批準生 產的重組改構人腫瘤壞死因子藥物，也是我國第一個上市的一類基因工程抗腫瘤藥物。
[0004] 腫瘤壞死因子（TNF-α )作為迄今為止發現的抗腫瘤效果最好的細胞因子，一直 是國內外研宄的熱點，但是幾乎所有的研宄都是圍繞著人TNF-α，很少涉及到家畜的腫瘤 壞死因子。豬是我國肉類重要來源，是我國畜類養殖業的重要組成部分，但是近年來，豬的 一些常見病（如發熱、痢疾甚至豬瘟、藍耳病、口蹄疫等）對其養殖的影響日益嚴重。本課題 從國內外研宄的現狀以及增強豬的免疫力和抗病毒細菌感染的方面考慮，提出對豬TNF- α 基因進行突變體構建、原核重組表達及功能進行研宄，針對免疫力低下和炎癥感染疾病的 豬，有望開發成相關的免疫增強劑和疫苗佐劑。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有技術的不足，提供一種家豬腫瘤壞死因子突變體基因（PmTNF- α ) 構建方法，并提供家豬腫瘤壞死因子（TNF-α)突變體蛋白的表達及純化方法和活性檢測。
[0006] 本發明所述豬腫瘤壞死因子（TNF- α )突變體基因序列如SEQ ID NO. 2所示，突變 基因翻譯蛋白氨基酸序列和野生型相比，N端缺少7個氨基酸，第8位的Ser、第9位的Asp 和第156位的Ile分別突變為Lys、Arg和Phe，其序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0007] 家豬腫瘤壞死因子（TNF-α )突變體基因構建方法如下：
[0008] (1)提取豬脾臟組織總RNA，并逆轉錄為第一鏈CDNA ;
[0009] (2)設計包含突變位點的大片段引物：
[0010] Fl :5' -AAGCGCAAGCCCGTCGCCCA-3'（SEQ ID NO. 4)
[0011] Rl :5' -TCAGAAGGCAATGATCCCAA-3'（SEQ ID NO. 5)
[0012] (3)將上述引物的PCR擴增產物，克隆入pMD-19T載體（TaKaRa)，并進行堿基序列 測定，得到了豬腫瘤壞死因子（TNF-α)突變體基因序列（PmTNF-a)。
[0013] 本發明還公開了一種重組表達載體pET28-mTNF- α的構建方法，以豬第一鏈cDNA 為模版，F2、R2為引物進行PCR，F2、R2的序列如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 6所示，得到目 的基因，即帶酶切位點家豬腫瘤壞死因子突變體基因 PmTNF-a，和pET28a載體用BamH I 和Hind III酶切，T4 DNA Ligas連接酶切后的載體和目的基因，得到pET28-PmTNF- α重組 質粒。
[0014] 一種家豬腫瘤壞死因子突變體蛋白的表達純化方法，包括以下步驟：
[0015] (1)把含有pET28-PmTNF_ α重組質粒的菌種復蘇、擴大培養及誘導表達取-80°C 凍存菌種50 μ 1接種到加有5 μ IKan的5ml LB培養基中復蘇12小時，把復蘇后的菌液加到 500ml 滅菌 LB 培養基中，并加 500 ylKan 抗生素，37°C，200rpm，搖 2h ;加 IM IPTG 100μ1， 使終濃度達到〇· 2mM，16°C，150rpm，誘導20h。收菌，-70°C，凍存過夜。
[0016] (2)超聲破碎：30ml PBS重懸凍存菌體，超生破碎，4°C，12000rpm，離心20min，收 集上清。
[0017] (3)鎳柱層析：配制洗脫緩沖液20禮、501111、1001111、2501111咪唑各2001111，先用201111 咪唑平衡柱子，上樣結束后，開始洗脫。先用20mM咪唑洗脫，之后分別用50mM、IOOmM咪唑 洗脫，最后250mM，此時洗脫峰為目的蛋白。
[0018] (4)透析并濃縮：將收集到的250mM咪唑洗脫蛋白，放到透析袋中，于4°C，IL PBS 中透析24小時，之后用PEG20000濃縮到合適濃度。
[0019] 本發明進一步公開了所述家豬腫瘤壞死因子突變體基因 PmTNF-α的重組應用， 是通過基因工程方法，生產重組His6-PmTNF- α蛋白，作為豬免疫增強劑或相關疾病的免疫 佐劑，或者生物藥物制劑。
[0020] 通過現有基因工程方法將該基因的胞外功能區克隆連接到pET28a原核質粒中并 轉到大腸桿菌BL21(DE3)中表達，本發明通過多次預表達實驗摸索出了合適的表達條件 (調節IPTG的濃度、溫度及轉速使融合蛋白盡可能多的以可溶形式表達），超聲破碎后離心 收集上清過Ni +-NTA柱純化，梯度洗脫之后我們得到了家豬腫瘤壞死因子（TNF-α)突變體 蛋白（His6-PmTNF-Ct )。并進行Western-blot鑒定。體外WST-8染料生物活性檢測及LDH 檢測結果顯示，該突變型蛋白和野生型蛋白相比不僅提高了對腫瘤細胞L929的細胞毒活 性，而且降低了對正常細胞（L02)的細胞毒性。
【附圖說明】
[0021] 圖1重組質粒圖（A、野生型TNF-α，B、突變型TNF-α )
[0022] 圖2鎳柱層析洗脫圖（A、野生型重組蛋白，B、突變型重組蛋白）
[0023] 圖3家豬腫瘤壞死因子（TNF-α )成熟區片段表達及純化、Western blot鑒定圖 (Μ、蛋白Maker，1、未誘導，2、誘導，3、純化后蛋白，4、Western blot結果。A、野生型重組蛋 白，B、突變型重組蛋白）
[0024] 圖4 CCK-8法分析不同濃度家豬腫瘤壞死因子（TNF- α )對L929細胞的細胞毒活 性。（PwTNF-α為野生型重組蛋白，PmTNF-α為突變型重組蛋白）
[0025] 圖5 10 X 10倍倒置顯微鏡下拍攝L929細胞
[0026] 圖6酶標儀法分析豬腫瘤壞死因子（TNF- a )對L02細胞的毒副作用。
【具體實施方式】
[0027] 在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常 理解的含義。
[0028] 下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發 明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
[0029] 在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。 所用到的引物，均在首次出現時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內容相同。
[0030] 實施例1
[0031] 豬腫瘤壞死因子突變體（PmTNF-a)基因的構建，豬脾臟取自南京棲霞堯化生豬 屠宰場，為長白豬：
[0032] (1)提取總RNA :應用RNA抽提試劑盒（TIANGEN)按照其操作手冊提取豬脾臟組織 總RNA，并通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質量和純度，紫外分光光度計測定其濃度。 SMART? RACE試劑盒（TaKaRa)逆轉錄為第一鏈cDNA。
[0033] (2)設計包含突變位點的大片段引物，通過PCR方法構建腫瘤壞死因子突變體基 因。引物序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5,利用逆轉錄所得cDNA模板進行PCR :
[0034] ①反應體系為 50 μ 1，10 ymol/L Fl、Rl 各 2 μ 1，2· 5mmol/L dNTP 8 μ 1，2XGC buffer II 25 μ 1，cDNA 模板 3 μ 1，DreamTaq 酶 0· 5 μ 1，ddH20 9· 5 μ 1。反應程序為： 94°C 5min，（94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin)，35 個循環，最后 72°C延伸 7min。
[0035] ②反應完成后將產物于I %瓊脂糖凝膠中電泳檢測，用割膠回收試劑盒回收得到 PCR產物，克隆入PMD19-T載體（TaKaRa)，經含Amp抗生素（50mg/ml)的瓊脂糖平板篩選轉 化子，挑出陽性克隆送往上海英駿測序公司進行堿基序列測定。多次實驗結果測序之后，通 過序列對比確定所構建的豬腫瘤壞死因子突變體基因序列。如構想的一樣，由包含突變位 點的引物（序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5)引發了特定突變，突變體基因序列如SEQ ID NO. 2 〇
[0036] 實施例2 :
[0037] 家豬腫瘤壞死因子（TNF-α )突變體重組表達載體的構建及其在大腸桿菌中的誘 導表達及純化鑒定；
[0038] 根據已經構建TNF-α突變體序列（基因序列如SEQ ID NO. 2)，設計引物F2、 R2。其中F2的5'端具有BamH I酶切位點，R2的5'端具有Hind III酶切位點，以豬第一鏈 cDNA 為模版，F2、R2 為引物（F25，-CGCGGA