一種丹參素脂質體骨靶向藥物制劑及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種丹參素脂質體的骨靶向藥物制劑及其制備方法，該制劑采用骨靶向接合物對包含有丹參素藥物分子的脂質體微粒進行接合及表面修飾制成；在聚乙二醇分子的一端通過合成反應接上具有骨靶向性的雙膦酸酸鹽分子，在另一端通過合成反應接上用作脂質體原料的膽固醇分子，制備成為具有骨靶向的接合物雙膦酸鹽-聚乙二醇-膽固醇(BP-PEG-CHOL)；然后以磷脂、膽固醇、骨靶向接合物原料，制備成表面具有骨靶向接合物的脂質體，加入丹參素，使其包含在脂質體內，制得丹參素脂質體的骨靶向制劑。本發明的制劑具有骨靶向性，能顯著提高骨組織藥物濃度，增強療效，可用于全身性代謝性骨病、骨質疏松癥、骨折的防治。
【專利說明】一種丹參素脂質體骨靶向藥物制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種可用于骨靶向治療和預防骨質疏松癥、骨折和全身性代謝性骨病的骨靶向的藥物制劑及其制備方法，屬于藥物制造的【技術領域】。
【背景技術】
[0002]骨質疏松癥是中老年人常見的機能退行性疾病。由于骨組織硬度大、滲透性差，生理生化過程特殊，治療藥物按一般給藥途徑難以有效轉運到作用部位。某些藥物常需全身給藥，才能在骨組織中達到有效治療濃度，不僅降低了藥物治療指數，而且對患者其他器官組織產生毒副作用。
[0003]1986年，Pierce首次提出骨靶向的概念:化合物具有沉積于骨并摻合于羥磷灰石(HA)晶體中的趨勢，同骨鈣具有結合能力的即具“骨靶向”親和力。此后許多學者在骨靶向藥物的研制中作出了卓有成效的工作，根據他們所用載體分子的不同，大致可以分為以下幾類:雙膦酸類、四環素類、聚丙二酸酯類以及小分子肽類。其中雙膦酸類化合物(diphosphonate)是天然焦磷酸的類似物,對骨組織和I丐化組織有特異性的親和力，能有效抑制骨質吸收，臨床上主要用于治療骨質疏松癥和Paget' s病。目前市場主要的雙磷酸鹽類抗骨質疏松藥物是阿倫磷酸鈉(商品名福善美)，市場占有率一度高達35%。但是近年來越來越多的報道發現福善美有明顯的副作用。患者服用此類藥物后出現的副作用是嚴重感染、腫脹和牙齒松動。此外有患者在口服這類藥物后出現骨骼、骨關節疼痛等癥狀，部分患者甚至臥床不起或者只能依靠輪椅、拐杖行走。可見單一的雙磷酸鹽藥物副作用顯著，限制了其應用范圍。
[0004]雙磷酸鹽類化合物由于骨靶向性明顯，國外研究傾向于雙膦酸類化合物用于與一些藥物分子相連，用于骨病的靶向治療。研究者將雙膦酸類化合物與一些非特異性的藥物如雌激素類、前列腺素E2類、順鉬、酪氨酸蛋白激酶(Src)抑制劑、雙氯芬酸和一些放射性藥物偶聯，以達到靶向治療的目的[WANG Y1-han, METCALF C A, SHAKESPEARE W C, etal.Bone-targeted2,6.9-trisubstituted purines:Novel inhibitors of srctyrosinekinase for the treatment of bone diseases[J].B10rganic Medicinal ChemistryLetters, 2003,13 (18):3067-3070.]。但這種偶聯一般是直接將雙膦酸鹽和藥物分子通過化學鍵結合在一起，在給藥后進入血液循環，藥物分子暴露在生理環境的各種酶中，很快被代謝，影響了藥效的發揮。
[0005]用脂質體包裹天然藥物小分子是一種新型制劑方法，可有效避免小分子藥物過早被代謝失活。已有報道制備了水飛薊素脂質體、紫杉醇脂質體、仙人掌SOD脂質體以及鬼臼素脂質體等[厲英超，董蕾，賈皚，等.水飛薊賓固體脂質納米粒的制備及抗肝纖維化作用[J].西安交通大學學報(醫學版)，2007，28 (5):517-20.]。根據多元磷酸類化合物乙二胺四甲叉膦酸的骨親和性制備骨靶向性柔性納米脂質體能用于骨轉移瘤的治療[郭佳，張淼，李云峰等，骨靶向性柔性納米脂質體[J]，北京大學學報(醫學版)，2009，41 (2):203-207]。
[0006]現代藥理研究發現丹參中的水溶性成分丹參素可促進骨愈合，丹參水提物能防治大鼠牙槽骨骨質疏松，體外實驗發現丹參素可增加大鼠成骨細胞的堿性磷酸酶(alkalinephosphatase, AIJP)和骨鈣素含量，提高OB體外礦化能力，使骨保護蛋白基因表達增加；在促使骨髓基質干細胞向成骨細胞分化的同時，抑制其向脂肪細胞分化；丹參酚酸B也有此作用，而脂溶性成分丹參酮沒有此作用，動物實驗表明丹參素可有效預防糖皮質激素引起的大鼠骨質疏松[劉鈺瑜，崔燎，吳鐵.藥物調控骨髓基質細胞成骨分化與骨質疏松癥治療的方向[J].中國臨床康復，2005，9 (26):184-5.張曉燕，吳鐵，崔燎，等.丹參水提物對去卵巢大鼠牙槽骨骨量的影響[J].中成藥，2007，29 (2) =268-270] 0丹參素能防止牙槽骨骨量的丟失。去卵巢大鼠給予丹參素防治后骨小梁面積百分數升高45.45%、骨小梁厚度增加了 36.21%、骨小梁分離度下降了 30.66%，且骨小梁面積百分數升高有顯著性意義，這結果提示丹參素能逆轉去卵巢大鼠牙槽骨骨量的丟失。這可能與以下幾個因素相關:一.丹參促進骨膠原的合成。骨膠原為I型膠原，是骨基質有機質的主要物質，占有機質的90% _95%，鈣鹽在骨膠原基質上沉積，形成骨小結節。有報道丹參能促進I型前膠原基因mRNA的表達，從而促進I型前膠原的合成。這提示作為丹參的有效成分一丹參素能防治牙槽骨骨質疏松可能與其促進骨膠原的合成相關。二.丹參增加成骨細胞數量、活性和降低破骨細胞數目、活性。骨的形成和吸收與成骨細胞和破骨細胞的數目及活性密切相關，破骨細胞的數目和活性相對增大時骨吸收增強，骨量減少，機體出現骨質疏松。丹參素可通過抑制破骨母細胞向成熟破骨細胞的轉化從而抑制破骨細胞的形成，可促進大鼠成骨細胞活性。
[0007]由于丹參素(或丹參酚酸B)的抗骨質疏松作用和劑量有關，也與丹參素(或丹參酚酸B)抗氧化作用有關，而丹參多酚類藥物易被氧化，在血中半衰期短暫，若要發揮防治骨質疏松的作用，需要加大丹參素(或丹參酚酸B)的用藥劑量或給藥次數。由于骨組織硬度大、滲透性差，生理生化過程特殊，治療藥物按一般給藥途徑如口服或靜脈注射均難以有效轉運到作用部位，這不僅降低了藥物治療指數，而且對患者非骨組織也產生不必要的毒副作用。為了克服這種困難，需要解決兩方面的問題，一是將藥物分子靶向運送到骨病部位，避免全身給藥造成的副作用，二是藥物分子在骨病部位濃度高，釋放時間長，增強藥物分子的治療作用。因此在研究制劑時，需要設計既能靶向到骨組織，同時又能大量載藥并控制釋放的制劑形式。以雙磷酸鹽作為骨靶向彈頭的脂質體能符合這樣的設計要求。
[0008]目前國內市場上尚未見到丹參素脂質體的骨靶向給藥制劑，也未見這種藥物制劑的研究報道，因此開發這類藥物不僅有重要的臨床意義，也具有廣闊的市場前景。
【發明內容】
[0009]我們設計了一種新型骨靶向載藥脂質體，治療用小分子藥物丹參素用脂質體裝載，脂質體表面用骨靶向接合物修飾，骨靶向接合物分子為雙磷酸鹽-聚乙二醇-膽固醇(BP-PEG-CH0L)，分子式見附圖1。這種經表面修飾的載藥脂質體即具有骨靶向功能。骨靶向接合物分子中的膽固醇基團充當脂質體雙分子層的錨固定分子，聚乙二醇用作鏈接間隔分子，雙磷酸鹽伸出脂質體雙分子層外充當骨靶向基團。這種經表面修飾的載藥脂質體具有既能靶向到骨組織，同時又能大量載藥并控制釋放的特性(圖2)。
[0010]這種具有骨靶向性的丹參素脂質體，其特征是以BP-PEG-CH0L作為骨靶向物，接合在脂質體表面，脂質體內部包含藥物分子丹參素，通過下述步驟，合成bp-peg-chol作為骨靶向物，制備骨靶向丹參素脂質體:
[0011]A.制備骨靶向物 BP-PEG-CH0L:
[0012](I)合成中間體膽固醇甲基磺酸酯
[0013]膽固醇溶解在二氯甲烷中，加三乙胺做縛酸劑，冷卻到-10度，緩慢滴加甲基磺酰氯攪拌反應，反應完畢后處理用水洗過濾得白色粉末狀固體。
[0014](2)合成中間體膽固醇-聚乙二醇(CHOL-PEG)
[0015]將PEG2000充分干燥并抽真空之后，氬氣保護下，加入干燥的DMSO和THF，隨后迅速加入氫化鈉，室溫活化后，將溶解于THF的膽固醇甲基磺酸酯滴加入上述溶液中反應，將反應液傾人到冰水中，二氯甲烷提取，旋干，經快速柱層析分離得CH0L-PEG.
[0016](3)合成聚乙二醇末端氨基化的衍生物(CH0L-PEG-NH2)
[0017]將上述產物與甲基磺酰氯反應制備甲基磺酸酯的中間體，溶于DMF中，加入的疊氮鈉于50-80°C反應還原生成伯胺。
[0018](4)合成膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸(CH0L-PEG-BP)
[0019]將雙膦酸衍生物溶于無水THF中，攪拌下加入CH0L-PEG-NH2，加入DCC，室溫反應后過濾到THF混懸液中，過濾，洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮物經硅膠快速柱層析，以二氯甲烷/甲醇梯度洗脫得。
[0020]B.骨靶向接合的丹參素脂質體的制備
[0021]精密稱取一定比例的卵磷脂、膽固醇和丹參素和適量維生素E，將丹參素和維生素E溶于無水乙醇，卵磷脂、膽固醇用適量乙醚溶于圓底蒸發瓶中，兩樣混合振搖均勻。于旋轉蒸發儀上減壓旋轉蒸至瓶壁成透明薄膜。在PBS緩沖液中加入適量BP-PEG-CH0L，充分溶解，加入到上述圓底燒瓶，旋轉0.5h使膜溶解，充氮氣除去痕量有機溶劑，放置2.5h使其充分水合，超聲若干分鐘，依次過0.45和0.22um濾膜，即得均勻的脂質體混懸液樣，經凝膠柱層析分離除去游離丹參素(圖3)，即得骨靶向丹參素脂質體。
[0022]本發明具有以下優點:
[0023]1.本發明的制劑為脂質體包裹的丹參素，防止在吸收分布過程中藥物分子被代謝消除。
[0024]2.本發明的制劑具有骨靶向性，能到達指定部位釋放，靶區藥物濃度高于其他組織，充分發揮藥物的治療作用。
【具體實施方式】
[0025]以下通過實施例對本發明的內容作進一步說明，但不應認為本發明的范圍僅限于實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0026]本發明丹參素脂質體的骨靶向給藥制劑，是將丹參素的藥物分子包合在脂質體微粒中，脂質體微粒的表面用骨靶向接合物修飾制成。
[0027]骨靶向接合物采用有機合成法制備，即在聚乙二醇分子的一端通過合成反應接上具有骨靶向性的雙膦酸酸鹽分子，在另一端通過合成反應接上用作脂質體原料的膽固醇分子，制備成為具有骨靶向的接合物雙膦酸鹽-聚乙二醇-膽固醇(BP-PEG-CH0L);然后以磷月旨、膽固醇、骨靶向接合物原料，制備成表面具有骨靶向接合物的脂質體，在制備過程中加入丹參素，使丹參素包含在脂質體內，從而制得丹參素脂質體的骨靶向制劑。
[0028]制備本發明丹參素脂質體骨靶向制劑的制備方法，包括如下步驟:第一步，以雙膦酸鹽、聚乙二醇以及膽固醇為原料合成制備骨靶向接合物；第二步，以磷脂、膽固醇以及丹參素為原料制備丹參素脂質體，用骨靶向接合物修飾脂質體；第三步，將丹參素脂質體的骨靶向制劑過濾、整粒，柱層析分離即得骨靶向制劑。
[0029]骨靶向接合物按如下方法制備:膽固醇溶解在二氯甲烷中，加三乙胺做縛酸劑，冷卻到-10°c，緩慢滴加甲基磺酰氯攪拌反應，反應完畢后處理用水洗過濾得白色粉末狀固體。將PEG2000充分干燥并抽真空之后，氬氣保護下，加入干燥的DMSO和THF，隨后迅速加入氫化鈉，室溫活化后，將溶解于THF的膽固醇甲基磺酸酯滴加入上述溶液中反應，將反應液傾人到冰水中，二氯甲烷提取，旋干，經快速柱層析分離得CH0L-PEG.將上述產物與甲基磺酰氯反應制備甲基磺酸酯的中間體，溶于DMF中，加入的疊氮鈉于50-80°C反應還原生成伯胺。將雙磷酸衍生物溶于無水THF中，攪拌下加入CH0L-PEG-NH2，加入DCC，室溫反應后過濾到THF混懸液中，過濾，洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮物經硅膠快速柱層析，以二氯甲烷/甲醇梯度洗脫得骨靶向接合物BP-PEG-CH0L。
[0030]實施例一
[0031]稱取大豆卵磷脂200mg、膽固醇50mg、骨祀向導向物80mg,置于500ml爺形瓶中，用15ml 二氯甲燒溶解，45°C,60r/min旋轉蒸發形成薄膜,加入含丹參素1mg的水溶液5ml。室溫，60r/min旋蒸脫膜形成懸液后，45°C放置膨脹2h。依次通過0.8 μ m>0.45 μ m>0.22 μ m微孔濾膜整粒，凝膠柱分離除去游離丹參素。
[0032]實施例二
[0033]稱取大豆卵磷脂200mg、膽固醇50mg、骨革巴向導向物80mg,用15ml 二氯甲燒溶解，并加入含丹參素1mg的水溶液5ml。100rpm攪拌1min, 45°C, 60r/min旋轉蒸發60min。依次通過0.8 μ m、0.45 μ m、0.22 μ m微孔濾膜整粒，凝膠柱分離除去游離丹參素。
[0034]實施例三
[0035]稱取大豆卵磷脂200mg、膽固醇50mg、骨祀向導向物80mg,用15ml乙醚溶解,另取1mg丹參素溶于5ml蒸餾水中，60°C水浴條件下攪拌，丹參素溶液到達60°C后，將乙醚溶液緩慢滴入丹參素溶液中，滴加完畢后，繼續60°C攪拌30min。依次通過0.8 μ m、0.45 μ m、0.22 μ m微孔濾膜整粒，凝膠柱分離除去游離丹參素。
[0036]實施例四
[0037]稱取大豆卵磷脂200mg、膽固醇50mg、骨祀向導向物80mg于三角瓶中，用20ml 二氯甲燒溶解，加入含丹參素1mg的水溶液10ml, 100rpm攪拌1mi η形成初乳,在100rpm攪拌下，將初乳滴加到40ml蒸餾水中，滴加完畢后繼續攪拌15min，形成W/0/W復乳，60r/min旋蒸除去二氯甲燒,依次通過0.8 μ m、0.45 μ m、0.22 μ m微孔濾膜整粒,凝膠柱分離除去游離丹參素。
【專利附圖】
【附圖說明】
:
[0038]附圖1骨靶向接合物BP-PEG-CHOL的化學結構式
[0039]附圖2丹參素脂質體骨靶向制劑的結構示意圖
[0040]附圖3丹參素脂質體和游離丹參素的色譜分離圖。
【權利要求】
1.一種含丹參素的脂質體骨靶向的藥物制劑及其制備方法。
2.如權利要求1所述的一種含丹參素的脂質體骨靶向藥物制劑的制備方法是將丹參素包裹在脂質體中，脂質體表面用骨靶向接合物雙膦酸鹽-聚乙二醇-膽固醇(BP-PEG-CHOL)修飾，骨靶向接合物的化學結構式見附圖1。
3.如權利要求1所述的骨靶向接合物是以通過下述步驟，合成BP-PEG-CH0L作為骨靶向物: (1)合成中間體膽固醇甲基磺酸酯:膽固醇溶解在二氯甲烷中，加三乙胺做縛酸劑，冷卻到-10度，緩慢滴加甲基磺酰氯攪拌反應，反應完畢后處理用水洗過濾得白色粉末狀固體； (2)合成中間體膽固醇-聚乙二醇(CHOL-PEG):將PEG2000充分干燥并抽真空之后，氬氣保護下，加入干燥的DMSO和THF，隨后迅速加入氫化鈉，室溫活化后，將溶解于THF的膽固醇甲基磺酸酯滴加入上述溶液中反應，將反應液傾人到冰水中，二氯甲烷提取，旋干，經快速柱層析分離得CHOL-PEG ； (3)合成聚乙二醇末端氨基化的衍生物(CH0L-PEG-NH2):將上述產物與甲基磺酰氯反應制備甲基磺酸酯的中間體，溶于DMF中，加入的疊氮鈉于50-80°C反應還原生成伯胺； (4)合成膽固醇-聚乙二醇-雙膦酸(CH0L-PEG-BP):將雙磷酸衍生物溶于無水THF中，攪拌下加入CH0L-PEG-NH2，加入DCC，室溫反應后過濾到THF混懸液中，過濾，洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮物經硅膠快速柱層析，以二氯甲烷/甲醇梯度洗脫得CH0L-PEG-BP。
4.如權利要求1，2，3所述的含丹參素的脂質體骨靶向的藥物制劑的制備方法，其制備骨靶向丹參素脂質體是以磷脂、膽固醇、骨靶向接合物和丹參素為原料，經混合、旋蒸、水化制備，依次過0.45和0.22um濾膜整粒，經凝膠柱層析分離除去游離丹參素即得骨靶向丹參素脂質體。
5.如權利要求1所述的含丹參素的脂質體骨靶向藥物制劑是用于骨靶向治療和預防骨質疏松癥、骨折和全身性代謝性骨病。
【文檔編號】A61P19/08GK104274407SQ201310293443
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月8日 優先權日:2013年7月8日
【發明者】崔燎, 吳鐵, 呂應年, 易自 申請人:廣東醫學院