肝祖細胞的條件培養基的制作方法

肝祖細胞的條件培養基的制作方法
【專利摘要】本發明屬于再生醫學領域。已經發現，非卵圓的多能肝祖細胞的條件培養基發揮組織再生作用。因此，不含細胞的條件培養基制品可用于治療損傷和器官衰竭、優選肝和/或損傷或衰竭。
【專利說明】肝祖細胞的條件培養基
[0001]本申請是國際申請日為2009年6月11日、國際申請號為PCT/EP2009/057232、進入國家階段的申請號為200980131229.6、發明名稱為“肝祖細胞的條件培養基”的PCT申請的分案申請。
[0002]本發明屬于生物藥用制品和再生醫學的領域。
[0003]經證實，干細胞制品對人或動物組織發揮再生作用。測試生物人工肝支持物在治療暴發性肝功能衰竭(FHF)中的效能的臨床試驗，已經提供了一些有希望的結果，然而現有的裝置尚未表現出對于常規用途而言足夠的效能和可靠性，主要是由于缺乏在功能上穩定的人肝細胞來源(Kobayashi N，Okitsu T, Tanaka N.Cell choice for bioartificiallivers.Keio J Med.2003; 52 (3): 151-7)。肝干細胞或甚至源自其它組織的干細胞，可以潛在地提供人肝細胞的替代來源。除了骨髓以外，干細胞存在于成體組織(諸如肝和中樞神經系統)中，且具有比以前已知的大很多的可塑性。
[0004]經證實，在國際專利申請W02006/126236中所述的人肝多能祖/干細胞經歷向多種組織細胞類型的分化，并發揮器官再生作用。這些細胞源自表達肝細胞標記物的非卵圓的人肝多能祖細胞系。
[0005]國際專利申請W02006/126236還公開了分離上述能經歷向多種細胞類型的分化的人肝多能祖/干細胞的方法，所述方法包括下述步驟:
(i)在細胞培養基中培養成體肝-衍生的人成熟肝細胞，直至成熟肝細胞死亡，并選擇具有上皮樣形態的存活細胞群； (ii)通過在含血清、含葡萄糖、補加hEGF(人上皮生長因子)和bFGF (堿性成纖維細胞生長因子)并包含哺乳動物細胞生長必需的常見無機鹽、氨基酸和維生素的培養基中培養，擴增具有上皮樣形態的存活細胞群，
且特別地，其中在有冷凍保護劑存在下，在含血清的培養基中冷凍成熟肝細胞，然后在根據步驟(i)培養之前解凍。
[0006]W02006/126236的人多能祖細胞(在專利說明書中指定為HLSC)及其制備方法通過引用完整地并入本文。
[0007]經證實，間質干細胞(MSC)制品對組織發揮再生作用。例如，已知骨髓-衍生的間質干細胞通過分泌許多營養分子(包括可溶的胞外基質糖蛋白、細胞因子和生長因子)天然地支持血細胞生成。
[0008]但是,干細胞制品的主要缺點是,在施用時造成免疫反應。某些干細胞制品甚至具有造成癌癥的可能性。
[0009]Parekkadan 等人(Parekkadan B，van Poll D, Suganuma K，Carter EA,Berthiaume F， Tilles AWj Yarmush ML Mesenchymal stem cell-derived moleculesreverse fulminant hepatic failure.PLoS ONE.2007 Sep 26; 2 (9): e941)首次評估了不同的MSC-治療，諸如遞送條件培養基(CM)，以測試它們在誘發嚴重肝損傷的大鼠模型中的效能。在該文章中，給大鼠腹膜內地施用共2次D-半乳糖胺(Gal-N)注射。在第二個研究(Van Poll D, Parekkadan B，Cho CHj Berthiaume F，Nahmias Y，TillesAWj Yarmush ML Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulatehepatocellular death and regeneration in vitro and in viv0.Hepatology.2008Jan 24;47(5):1634-1643)中，Parekkadan的研究組研究了 MSC-CM的全身輸注是否會在急性損傷的肝中產生肝保護應答，具體地通過抑制細胞死亡和刺激修復程序。該研究組使用D-半乳糖胺誘導的亞致死方案，證實了在MSC-CM治療后顯著的存活益處和肝酶釋放的阻止。
[0010]考慮到干細胞治療的上述缺點，再生醫學領域中現有的非常有效的制品通常含有細胞的事實，是應當克服的一個技術問題。
[0011]因而，本發明的目的是，提供這樣的制品，其可有效地用作再生醫學領域中的藥物組合物，但是其不含有細胞，從而避免含有細胞、尤其是干細胞的現有制品所造成的缺陷。
[0012]本發明的另一個目的是，提供制備藥物組合物的方法，所述藥物組合物在再生醫學領域中是有效的，但是其不含有細胞，從而避免含有細胞、尤其是干細胞的現有制品所造成的缺陷。
[0013]通過獨立權利要求中定義的制品和方法，實現這些和其它目的。
[0014]從屬權利要求涉及本發明的優選實施方案。從屬權利要求和獨立權利要求的主題構成說明書的一個完整部分。
[0015]使用暴發性肝功能衰竭(FHF)的小鼠模型，發明人證實了通過培養肝祖細胞系(例如在W02006/126236中公開的非卵圓的人肝多能祖細胞系)生成的無細胞的條件培養基(無細胞的CM)會對肝發揮再生作用。經證實，通過培養肝祖細胞系生成的無細胞的條件培養基(無細胞的CM)在器官衰竭的治療(尤其是肝和腎衰竭的治療)中是有效的。令人驚奇地，還發現，肝祖細胞系-CM比在相同條件下制備的間質干細胞-CM明顯更有效。
`[0016]具體地，在本說明書的實施例1所述的研究中，給6至7周齡的雄性SCID小鼠腹膜內注射500 ML含有0.125吒LPS和18 mg D-半乳糖胺(GalN)的鹽水，以誘導FHF。在施用LPS和GalN后30分鐘、I和3小時后，給小鼠腹膜內注射3 ml條件培養基，其源自在旋轉生物反應器中培養的HLSC。條件培養基的初步分析揭示大量細胞因子、趨化因子和生長因子。丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶的血清水平在損傷誘導后顯著增加，且在注射條件培養基治療6天后顯著降低。另一方面，通過BrdU、PCNA和Tunel測定法評價的肝組織的組織病理學分析揭示了降低的細胞凋亡和壞死指數和組織形態的恢復。
[0017]這些研究提供了 HLSC-衍生的條件培養基在炎癥治療和器官再生中的潛在治療應用的第一份實驗證據。
[0018]因而，本發明的第一個方面是由無細胞的條件培養基組成的制品，所述無細胞的條件培養基可通過培養肝祖細胞系、優選非卵圓的人肝多能祖細胞系、更優選在國際專利申請W02006/126236 (其通過引用并入本文)中公開的非卵圓的人肝多能細胞系得到。
[0019]包含有效量的上面定義的制品的藥物組合物也落入本發明范圍內。
[0020]在下面，構成本發明主題的源自肝祖細胞系的無細胞的條件培養基將被稱作“無細胞的HLSC-CM”。
[0021]術語“HLSC”表示肝多能祖/干細胞系。優選地，術語“HLSC”表示非卵圓的肝多能細胞系，更優選地表示在W02006/126236中公開的肝多能祖/干細胞系。更優選地，HLSC細胞系具有在W02006/126236的權利要求1_10的任一項中定義的特征，和/或在W02006/126236的第7頁表1中總結的特征。這些特征通過引用并入本文。
[0022]構成本發明主題的無細胞的HLSC-CM適合原樣或以濃縮形式用作藥物組合物。濃縮形式被濃縮了例如至少約5倍、優選至少約10倍、更優選至少約20倍、甚至更優選約25倍。
[0023]優選地，從在技術人員已知的GMP條件下培養的肝多能祖/干細胞、優選在W02006/126236中公開的HLSC細胞系，得到本發明的無細胞的HLSC-CM。或者，從在技術人員也已知的BAL (生物人工肝)系統中培養的肝多能祖/干細胞、優選在W02006/126236中公開的HLSC細胞系，可以得到它。
[0024]用于培養肝多能祖/干細胞和收集其無細胞的條件培養基(CM)的GMP條件的一個實例如下。
[0025]通過在W02006/126236中公開的方法，分離肝多能祖/干細胞，其中通過在有胎牛血清(FCS)(優選在約10%的濃度)、hEGF (人上皮生長因子)和bFGF (堿性成纖維細胞生長因子)存在下培養祖干細胞，進行所述擴增步驟。FCS、bFGF和hEGF優選地是GMP級，例如由Invitrogen生產的那些。
[0026]為了在GMP條件下收集條件培養基，從培養物去除FCS，因為這是不適合注射進人的異源蛋白。為此，洗滌細胞，并在收集培養基(例如，由添加了 GMP級人白蛋白的a-MEM組成)中培養24小時。白蛋白優選地在約0.05 %的濃度。然后通過離心或過濾，收集無細胞的條件培養基。
[0027]在上述體內 實驗中，證實了本發明的無細胞的HLSC-CM向暴發性肝功能衰竭(FHF)的動物模型(SCID小鼠)的施用，會提供顯著勝過用MSC-CM處理過的SCID小鼠的存活益處。
[0028]因而，本發明的另一個方面是用作藥物的無細胞的條件細胞培養基，其可通過培養肝祖細胞系、優選非卵圓的人肝多能祖細胞系、甚至更優選在國際專利申請W02006/126236中公開的非卵圓的人肝多能細胞系得到。
[0029]根據一個優選的實施方案，所述藥物用于治療器官衰竭和/或損傷、優選肝和/或腎衰竭和/或損傷。
[0030]另外，發明人分析了本發明的無細胞的HLSC-CM的組成，以便鑒別更可能為上述CM的有益效果提供重要貢獻的那些蛋白(例如細胞因子、趨化因子、生長因子和/或其它蛋白)，從而提供由蛋白混合物組成的簡化的藥物組合物，所述蛋白混合物能至少部分地模仿通過如上所述培養HLSC生產的CM的器官再生能力。
[0031]因而，本發明的另一個方面是簡化的藥物組合物，其包含藥學有效量的至少肝細胞生長因子(HGF)、白介素6 (IL-6)和白介素8 (IL-8)的混合物。
[0032]在一個優選的實施方案中，所述簡化的藥物組合物包含藥學有效量的至少肝細胞生長因子(HGF)、白介素6 (IL-6)、白介素8 (IL-8)和血管內皮生長因子(VEGF)的混合物。
[0033]在另一個優選的實施方案中，所述簡化的藥物組合物包含藥學有效量的至少肝細胞生長因子(HGF)、白介素6 (IL-6)、白介素8 (IL-8)和巨噬細胞刺激蛋白(MSP)和任選的血管內皮生長因子(VEGF)的混合物。
[0034]在另一個優選的實施方案中，所述簡化的藥物組合物包含藥學有效量的根據上面定義的實施方案中的任一個的蛋白和至少一種選自下述的其它蛋白的混合物:激活素C、激活的白細胞粘附分子(ALCAM)、趨化因子(C-C基序)受體4 (CCR4)、富含半胱氨酸的跨膜 BMP 調節劑 I (chordin-樣)(CRIM)、核心蛋白多糖、Ectodysplasin A2 (EDA-A2)、內皮縮血管肽、成纖維細胞生長因子受體-樣I (FGF R5)、磷脂酰肌醇聚糖3、生長-相關的癌蛋白(GRO)、胰島素-樣生長因子結合蛋白6 (IGFBP-6)、胰島素-樣生長因子I (IGF-1)、白介素20受體、a (IL-20 R a )、含有三環域(kringle)的跨膜蛋白2(Kremen-2)、潛在轉化生長因子P結合蛋白I (潛在TGF-0 bpl)、晶狀體纖維的主要內在蛋白(MIP-2)、MSP (6-鏈、骨保護素/ TNFRSF11B (腫瘤壞死因子受體超家族、成員Ilb)、可溶的gpl30 (sgpl30)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(骨結合素)(SPARC)。
[0035]本發明的簡化的藥物組合物中的優選細胞因子濃度范圍如下:
-HGF: 1-100 ng/ml,優選 5_80 ng/ml,更優選 10-65 ng/ml ；
-1L-6: 10-200 ng/ml，優選 20-100 ng/ml，更優選 30-50 ng/ml ；
-1L-8: ≥ 35 ng/ml,優選 50-600 ng/ml,更優選 100-300 ng/ml ；
-VEGF (如果存在的話):10-400 ng/ml，優選 20-250 ng/ml，更優選 35-175 ng/ml ；
和
-MSP (如果存在的話):1-100 pg/ml,優選 5-80 pg/ml,更優選 5-65 pg/ml。
[0036]但是，本發明的范圍還包括簡化的藥物組合物的任意稀釋或濃縮形式。濃縮形式是濃縮了例如至少約5倍、優選至少約10倍、更優選至少約20倍、甚至更優選約25倍。稀釋形式是稀釋了例如至少約5倍、優選至少約10倍、更優選至少約20倍、甚至更優選至少約25倍。
[0037]本發明的簡化的藥物組合物適合用作藥物，具體地用于治療器官衰竭和/或損傷、優選肝和/或腎衰竭和/或損傷。根據一個優選的實施方案，配制藥物組合物，以便施用下面的細胞因子劑量:
-HGF: 0.01-1 mg/kg,優選 0.03-0.8 mg/kg,更優選 0.1-0.5 mg/kg ；
-白介素 6 (IL-6): 0.01-1 mg/kg,優選 0.03-0.8 mg/kg,更優選 0.05-0.5 mg/kg;
-白介素 8 (IL-8): 0.01-1 mg/kg,優選 0.02-0.8 mg/kg,更優選 0.03-0.5 mg/kg;
-VEGF (如果存在的話):0.01-1 mg/kg,優選0.02-0.8 mg/kg,更優選0.04-0.5 mg/
kg ；
-MSP (如果存在的話):0.01-1 mg/kg,優選 0.02-0.8 mg/kg,更優選 0.08-0.5 mg/
kg o
[0038]在一個特別優選的實施方案中，這些細胞因子劑量每天施用I次。
[0039]應當理解，上面定義的簡化的藥物組合物，純粹作為能至少部分地模仿可通過如上所述培養HLSC得到的CM的器官再生能力的簡化的藥物組合物的非限制性實例予以提供。
[0040]從純粹作為作為例證予以提供的下述實施例，將更清楚地看出本發明的其它目的和優點。
[0041]還應當理解，基于下文提供的實施例，可以預見到要求保護的藥物組合物和方法的其它實施方案，而不脫離本發明的范圍。
[0042]實施例1 -初步體內試齡HLSC和MSC細朐培養物的制備
如TO2006/126236所述，分離人肝祖細胞(HLSC)。將細胞培養至60%_70%匯合(約2X IO6 HLSC/75-cm2燒瓶)，徹底洗滌，并在10 mL添加了 0.05%人血清白蛋白(GMP生產)的無血清的a-MEM培養基中培養。如以前報道的，從骨髓抽吸物分離人間質干細胞(MSC)，培養，并表征。在MesenPRO RS ?培養基中培養MSC，所述MesenPRO RS?培養基是為了支持MSC生長而專門配制的減少血清(2% FCS)的培養基。
[0043]條件培養基的制備
通過離心收集培養MSC和HLSC 24小時后的培養基，制備無細胞的條件培養基。使用2X IO6細胞的細胞群，進行該實驗。然后，使用具有3 kDa分子量截止的超濾單元(AmiconUltra-PL 3，Millipore)，將培養基濃縮約25倍。得到共250 W條件培養基。在3 mla-MEM (不含FCS)中稀釋該濃縮的培養基，至終體積3 ml。在誘導肝損傷后30分鐘、I和3小時，腹膜內地施用I ml條件培養基。
[0044]FHF體內樽型
為了誘導暴發性肝功能衰竭(FHF),如前所述(Lehmann V，Freudenberg MA, GalanosC.Lethal toxicity of ipopoIysaccharide and tumor necrosis factor in normaland D-galactosamine-treated mice.J Exp Med.1987; 165 (3): 657-63),開發了脂多糖(LPS)對用D-半乳糖胺(2-氨基-2-脫氧-D-半乳糖)處理的動物的致死毒性。簡而言之，一組10只SCID小鼠接受D-半乳糖胺(GalN) (600 mg/kg)和每只動物0.125 Ug LPS的腹膜內注射。發明人以前測得，在8小時內在GalN (600 mg/kg)和LPS (每只動物0.125U g)處理的小鼠中誘發100%致死率。作為在500 u I無熱原的NaCl溶液中的混合物，施用GalN和LPS。記錄死亡，直到注射后24小時。在LPS和GalN注射后30分鐘、I和3小時，給小鼠腹膜內地注射`3次Iml HLSC和MSC濃縮的條件培養基。如圖1所示，5只注射HLSC-衍生的CM的小鼠中的4只存活，而用MSC-衍生的CM處理的小鼠都沒有存活。
[0045]HLSC和MSC條件培養基的細胞因子組成
為了研究如上所述通過培養HLSC和MSC得到的條件培養基的組成，通過多重ELISA(Bioclarma)，測量了 31種不同細胞因子的集合。在含有10% FCS的培養基中培養兩種細胞類型。在培養24小時后，收集條件培養基。還測量了單獨的培養基的細胞因子組成。結果提供在下面的表1中。
[0046]表1.HLSC相對于MSC:細胞因子生產*
【權利要求】
1.一種藥物組合物，其包含藥學有效量的至少肝細胞生長因子(HGF)、白介素6(IL-6)、白介素8 (IL-8)和10- 400 ng/ml的濃度的血管內皮生長因子(VEGF)的混合物。
2.根據權利要求1的藥物組合物，其中所述混合物另外包含藥學活性量的巨噬細胞刺激蛋白(MSP)。
3.根據權利要求1或2的藥物組合物，其中所述肝細胞生長因子(HGF)是在1-100ng/ml的濃度，白介素6 (IL-6)是在10- 200 ng/ml的濃度，白介素8 (IL-8)是在等于或高于35 ng/ml的濃度。
4.根據權利要求2或3的藥物組合物，其中所述巨噬細胞刺激蛋白(MSP)是在1-100pg/ml的濃度。
5.根據權利要求1至4中任一項的藥物組合物，其從根據權利要求1至4中任一項的藥物組合物濃縮了至少5倍。
6.根據權利要求1至4中任一項的藥物組合物，其從根據權利要求1至4中任一項的藥物組合物稀釋了至少5倍。
7.根據權利要求1至6中任一項的藥物組合物用于制備治療器官損傷或衰竭的藥物的用途。
8.根據權利要求7的用途，其中所述器官是肝或腎。
9.根據權利要求7或8的用途，其中所述藥物適合施用0.01-1mg/kg的肝細胞生長因子(HGF)劑量、0.01-1 mg /kg 的白介素 6 (IL-6)劑量、0.01-1 mg/kg 的白介素 8 (IL-8)劑量、和任選的0.01-1 mg/kg的血管內皮生長因子(VEGF)劑量。
【文檔編號】A61K38/20GK103800895SQ201310348088
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2009年6月11日 優先權日:2008年6月11日
【發明者】M.B.赫雷拉桑切斯, V.方薩托, C.特塔, G.卡姆西 申請人:弗雷森紐斯醫療護理德國有限責任公司