體外擴增γδT細胞的培養基和方法與流程

本發明涉及生物
技術領域：
，體外擴增γδT細胞的培養基和方法。
背景技術：
：腫瘤是由于機體的免疫功能不足以戰勝各種致病因素而造成的，其發生、發展與宿主的免疫狀態有著密切的關系。近幾十年來，手術、化療及放療已成為臨床上治療腫瘤的主要手段，并取得了一定的治療效果，但目前腫瘤的復發率和死亡率仍然較高，主要與腫瘤細胞對化學藥物或放射線形成耐受有關。新型的腫瘤細胞免疫治療技術通過恢復和增強腫瘤患者的免疫監視能力和免疫殺傷功能，可以清除手術和放化療后患者體內殘存的腫瘤細胞，達到預防腫瘤復發、轉移及根治腫瘤的目的，并且具有特異性強、毒副作用小等特點，被稱為第四大腫瘤治療模式。根據免疫細胞治療的特點及抗腫瘤的機制，細胞免疫治療可分為主動性免疫治療和過繼性細胞免疫治療；又可分為特異性免疫治療和非特異性免疫治療。國內外一些臨床試驗研究發現，特異性細胞治療技術、基因修飾的T細胞技術、非特異性細胞治療技術在臨床腫瘤治療中均取得了較為肯定的療效。國際上已批準一些過繼性細胞產品用于臨床腫瘤的治療，2010年美國FDA批準了首個個體化細胞治療產品—前列腺癌治療性疫苗(Provenge)應用于臨床治療，現在已有多個膀胱癌、結腸癌、黑色素瘤、腎細胞癌等的治療性腫瘤疫苗在美國、法國、俄羅斯、荷蘭等國上市銷售，日本厚生省將腫瘤細胞免疫療法(αβT細胞、NK細胞、NKT細胞、DC細胞等)列為臨床常規治療方法，韓國FDA批準了Immuncell-LC(αβT細胞)產品用于臨床治療。目前，我國特異性細胞治療仍處于技術研究階段，非特異性細胞治療技術雖在臨床應用了近30年，但至今還沒出現過一個真正意義上的腫瘤細胞免疫治療產品。如何獲得體外擴增能力強、殺瘤識別譜廣、抗癌殺傷力高、毒副作用小的免疫細胞，并用于腫瘤患者的臨床治療，已成為腫瘤細胞免疫治療領域的研究重點。γδT細胞只表達γδTCR，與αβT細胞不同，是一群非經典的T細胞，γδT細胞殺傷腫瘤細胞不需要特異性腫瘤抗原的刺激并無MHC限制性，在體內和體外均有較好的抗腫瘤效應并具有多種生物學功能。γδT細胞在抗腫瘤免疫中為連接天然免疫和適應性免疫的橋梁，是腫瘤細胞免疫治療強有力的工具。活化后的γδT細胞可以對多種腫瘤表現出細胞毒活性，作用機制包括穿孔素/顆粒酶，ADCC(CD16)、Fas配體，或腫瘤壞死因子(TNF)相關凋亡誘導配體(TRAIL)等細胞死亡誘導方式，并能產生大量的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-17F、IL-22等。已有臨床研究表明，利用γδT細胞治療淋巴系統的腫瘤、黑色素瘤及結腸癌等實體瘤取得了較好的治療效果，體外擴增的γδT細胞具有穩定的抗腫瘤活性，對于體內γδT細胞數量極少或γδT細胞功能嚴重缺陷的腫瘤患者來說，使用體外擴增的γδT細胞進行治療對控制病情具有重要意義。因此，體外擴增足夠數量的γδT細胞并用于惡性腫瘤的臨床治療具有重要的科學和應用價值。建立規范的自體γδT細胞體外擴增、臨床應用及質量控制體系等，將給腫瘤患者的根治療帶來新的希望，延長患者的生存期，提高患者的生存質量。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是如何體外擴增人γδT細胞。為解決上述技術問題，本發明首先提供了用于體外擴增γδT細胞的培養基。本發明所提供的用于體外擴增γδT細胞的培養基，為含有L-谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷、血漿、人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸的哺乳動物細胞無血清培養基。上述培養基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷、所述血漿、人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸的濃度分別可為1.45mM-2.55mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L-9.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L-9.5mg/L的脫氧核糖核苷、0.3％-0.5％(v/v)的所述血漿、1.0×105IU/L-3.0×105IU/L的人白細胞介素2、5.0μg/L-15.0μg/L的人白細胞介素7、0.5mg/L-1.5mg/L的植物血凝素、0.5μmol/L-1.5μmol/L的唑來膦酸。上述培養基中，所述核糖核苷可為腺嘌呤核糖核苷、鳥嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷。上述培養基中，所述脫氧核糖核苷可為腺嘌呤脫氧核糖核苷、鳥嘌呤脫氧核糖核苷、胞嘧啶脫氧核糖核苷和胸腺嘧啶脫氧核糖核苷。上述培養基中，所述核糖核苷中腺嘌呤核糖核苷、鳥嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷的質量比可為1：1：1：1。上述培養基中，所述脫氧核糖核苷中腺嘌呤脫氧核糖核苷、鳥嘌呤脫氧核糖核苷、胞嘧啶脫氧核糖核苷和胸腺嘧啶脫氧核糖核苷的質量可比為1：1：1：1。上述培養基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷、所述血漿、人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸的濃度可為下述1)或2)或3)：1)2.0mM的L-谷氨酰胺、7.0mg/L的核糖核苷、7.0mg/L的脫氧核糖核苷、0.4％(體積百分比)所述血漿、2.0×105IU/L的人白細胞介素2、10.0μg/L的人白細胞介素7、1.0mg/L的植物血凝素和1.0μmol/L的唑來膦酸；2)1.45mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L的脫氧核糖核苷、0.3％(體積百分比)的所述血漿、1.0×105IU/L的人白細胞介素2、5.0μg/L的人白細胞介素7、0.5mg/L的植物血凝素和0.5μmol/L的唑來膦酸；3)2.55mM的L-谷氨酰胺、9.5mg/L的核糖核苷、9.5mg/L的脫氧核糖核苷、0.5％(體積百分比)的所述血漿、3.0×105IU/L的人白細胞介素2、15.0μg/L的人白細胞介素7、1.5mg/L的植物血凝素和1.5μmol/L的唑來膦酸。上述培養基中，所述血漿與所述γδT細胞可來源于同一個動物個體。上述培養基可為向GT-T551H3培養基中添加L-谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷、所述血漿、人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸得到的培養基。為解決上述技術問題，本發明還提供了體外擴增γδT細胞的方法。本發明所提供的體外擴增γδT細胞的方法，包括利用所述培養基培養血液中細胞，完成γδT細胞的擴增。上述方法中，所述培養的溫度可為36℃-37℃。上述方法中，所述培養的空氣中CO2體積百分比含量可為4.0％-10.0％(如5.0％)。上述方法中，所述培養的空氣濕度可為飽和濕度。上述方法中，所述培養的體系中細胞的濃度可為(1.5-3)×106個/ml。所述培養的體系中細胞的濃度具體可為(1.5-2)×106個/ml或(2-3)×106個/ml。所述培養的體系中細胞的濃度具體是指γδT細胞的濃度，該細胞濃度可利用所述γδT細胞培養液進行調整。上述方法中，所述血漿與所述血液中細胞均可來源于同一個動物個體。上述方法中，所述血液中細胞可為外周血單個核細胞。上述方法中，所述動物可為下述a1)或a2)：a1)哺乳動物；a2)人。為解決上述技術問題，本發明還提供了下述1)或2)或3)：1)體外擴增γδT細胞的產品，包括所述培養基和人外周血單個核細胞；2)用于體外擴增γδT細胞的成套試劑，由GT-T551H3培養基、L-谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷、血漿、人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸中的至少兩種組成；3)治療和/或預防腫瘤產品，其活性成分為所述體外擴增γδT細胞的方法制備的γδT細胞。其中，所述人外周血單個核細胞與所述培養基中的所述血漿均可來源于同一動物個體。所述動物可為下述a1)或a2)：a1)哺乳動物；a2)人。為解決上述技術問題，本發明還提供了下述任一應用：X1)所述培養基在制備體外擴增γδT細胞產品中的應用；X2)所述培養基在體外擴增γδT細胞中的應用；X3)所述培養基在制備治療和/或預防腫瘤產品中的應用；X4)所述培養基在治療和/或預防腫瘤中的應用；X5)所述體外擴增γδT細胞的產品或所述成套試劑在制備體外擴增γδT細胞產品中的應用；X6)所述體外擴增γδT細胞的產品或所述成套試劑在體外擴增γδT細胞中的應用；X7)所述體外擴增γδT細胞的產品或所述成套試劑在制備治療和/或預防腫瘤產品中的應用；X8)所述體外擴增γδT細胞的產品或所述成套試劑在治療和/或預防腫瘤中的應用；X9)所述治療和/或預防腫瘤產品在制備治療和/或預防腫瘤產品中的應用；X10)所述治療和/或預防腫瘤產品在治療和/或預防腫瘤中的應用。本發明中，所述γδT細胞可為CD3+γδTCR+的T細胞(CD3+TCR+γδT細胞)。本發明中，所述腫瘤可為白血病、肺癌或卵巢癌。所述白血病具體可為慢性骨髓性白血病，如K562細胞引發的慢性骨髓性白血病。所述肺癌具體可為肺鱗癌，如SK-MES-1細胞引發的肺鱗癌。所述卵巢癌具體可為Ho8910細胞引發的卵巢癌。本發明中，所述GT-T551H3培養基具體可為寶日醫生物技術(北京)有限公司產品。核糖核苷、脫氧核糖核苷均可為BioBASic公司產品。L-谷氨酰胺和植物血凝素均可為Sigma公司產品。人白細胞介素2可為重組人白細胞介素-2，具體可為上海華新生物高科技有限公司產品。人白細胞介素7可為重組人白細胞介素7，具體可為Peprotech公司產品。唑來膦酸可為四川海蓉藥業有限公司產品。本發明建立體外擴增γδT細胞的方法，利用本發明的用于體外擴增γδT細胞的培養基培養的人γδT細胞，細胞生長速度快、數量多、純度高、對腫瘤細胞的殺傷力強，活性穩定：培養14-16天后，γδT細胞擴增倍數可達1000倍以上，細胞總數可達1.0×1010個以上，其中CD3+γδTCR+細胞占90％以上，并無細菌、真菌、支原體及病毒因子等的污染。利用殺傷實驗，檢測培養14-16天后的γδT細胞對Ho8910細胞、SK-MES-1細胞及K562細胞均具有較高的殺傷活性。本發明所建立的人γδT細胞的培養方法為γδT細胞進行臨床腫瘤患者體內抗腫瘤治療奠定了基礎。本發明的體外擴增γδT細胞的方法具有易于操作、質量可控、產量高等特點。應用本發明所建立的工藝對γδT細胞進行體外擴增培養，細胞數量、表型、純度、活性等均可保證達到臨床應用，可用于多種惡性腫瘤的臨床治療。因此，本發明的細胞培養方法在治療惡性腫瘤領域中有廣泛的應用價值。附圖說明圖1為培養過程中γδT細胞總數隨時間的變化。圖2為γδT細胞純度的檢測結果。圖3為γδT細胞殺傷活性的檢測結果。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的核糖核苷、脫氧核糖核苷均為BioBASic公司產品；L-谷氨酰胺和植物血凝素均為Sigma公司產品；人白細胞介素2為重組人白細胞介素-2，是上海華新生物高科技有限公司產品；人白細胞介素7為重組人白細胞介素7，是Peprotech公司產品；唑來膦酸為四川海蓉藥業有限公司產品。下述實施例中的人淋巴細胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限責任公司產品，GT-T551H3培養基和GT-T610培養袋為寶日醫生物技術(北京)有限公司產品；下述實施例中的培養箱為ThermoForma公司產品；1640液體培養基、胎牛血清為Hyclone公司產品；流式細胞抗體為BD公司產品；CellTraceFarRedCellProliferationkit為Invitrogen公司產品；0.22μm孔徑的無菌濾器為Millipore公司產品；二甲基亞砜、胰蛋白酶為上海生工生物工程有限公司產品；微量移液器為法國Gilson公司產品；低溫高速離心機為德國艾本德公司產品；超凈工作臺為上海智城分析儀器制造有限公司產品；ROTANTA460R型離心機為德國Hettich公司產品；超低溫冰箱為青島海爾醫用低溫科技有限公司產品；FACSCalibur流式細胞儀為BD公司產品；生物顯微鏡為日本奧林巴斯公司產品。實施例1、人γδT細胞的擴增一、外周血單個核細胞(PBMC細胞)的分離1.外周血標本：取健康人或腫瘤患者的外周血50ml，肝素抗凝，均經供血者知情同意。2.分離步驟：(1)于800g，25℃離心外周血標本10分鐘，吸取上清液(血漿)于50ml無菌離心管中，沉淀為外周血細胞，冰上放置，用于分離PBMC細胞。(2)將步驟(1)中得到的上清液于56℃水浴中，孵育30分鐘，滅活；然后800g，離心10分鐘，吸取上清液于50ml無菌離心管中，即為自體血漿，-20℃保存，備用。(3)使用無菌PBS溶液稀釋步驟(1)得到的外周血細胞至60ml，得到外周血細胞懸浮液；向2支50ml滅菌離心管分別加入20ml人淋巴細胞分離液，然后輕輕加入外周血細胞懸浮液30ml至人淋巴細胞分離液的上層，然后800g，25℃，離心20分鐘。(4)吸取中界層面的單個核細胞，使用PBS溶液洗滌3遍，離心條件為1500rpm，10分鐘，25℃；最后棄上清液，使用1.0mlGT-T551H3培養基重懸單個核細胞，計數，4℃放置，備用。二、使用用于體外擴增γδT細胞的培養基進行體外擴增培養一)用于體外擴增γδT細胞的培養基的配制向GT-T551H3培養基中添加L-谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷、血漿(即步驟一中得到的自體血漿)、人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸，得到用于體外擴增γδT細胞的培養基。本發明用到了三種用于體外擴增γδT細胞的培養基，其名稱分別為γδT細胞培養液I、γδT細胞培養液II和γδT細胞培養液III，γδT細胞培養液I、γδT細胞培養液II和γδT細胞培養液III中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷、血漿、人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸的濃度分別為如表1所示。這三種γδT細胞培養液中的血漿均為步驟一的血漿(即自體血漿)。表1、γδT細胞培養液的配制試劑γδT細胞培養液IγδT細胞培養液IIγδT細胞培養液IIIL-谷氨酰胺2.0mM1.45mM2.55mM核糖核苷7.0mg/L5.5mg/L9.5mg/L脫氧核糖核苷7.0mg/L5.5mg/L9.5mg/L自體血漿(v/v)0.4％0.3％0.5％人白細胞介素22.0×105IU/L1.0×105IU/L3.0×105IU/L人白細胞介素710.0μg/L5.0μg/L15.0μg/L植物血凝素1.0mg/L0.5mg/L1.5mg/L唑來膦酸1.0μmol/L0.5μmol/L1.5μmol/L二)γδT細胞的擴增培養分別利用步驟一)的三種γδT細胞培養液擴增γδT細胞，實驗重復三次，每次重復試驗的具體步驟如下：1.使用49mlγδT細胞培養液稀釋步驟一的PBMC細胞，得到PBMC細胞懸浮液，PBMC細胞懸浮液中的細胞濃度為(0.6-1.2)×106個/ml。2.轉移PBMC細胞懸浮液至175cm2培養瓶中，置于飽和濕度、37℃、5.0％(體積百分比)CO2的培養箱中進行培養。3.在培養第3-4天，根據細胞密度，加入γδT細胞培養液，使細胞密度保持在(1.5-2)×106個/ml，繼續置于飽和濕度、37℃、5.0％(體積百分比)CO2的培養箱內培養。4.在培養第6-7天，仔細觀察細胞生長狀態，用γδT細胞培養液將γδT細胞重懸到300ml，并將細胞轉移入GT-T610培養袋培養，培養過程中將細胞密度控制在(1.5-2)×106個/ml，置于飽和濕度、37℃、5.0％CO2的培養箱內繼續培養；同時抽樣1ml于15ml離心管中，進行細菌、真菌檢測。5.在培養第8-10天，仔細觀察細胞生長狀態，根據細胞生長情況，向細胞培養袋中添加γδT細胞培養液，培養過程中將細胞密度控制在(1.5-2)×106個/ml，置于飽和濕度、37℃、5.0％CO2的培養箱內繼續培養。6.在培養第11-12天，仔細觀察細胞生長狀態，根據細胞生長情況，并將1/2的細胞轉移入另一個GT-T610培養袋，向兩個細胞培養袋中均添加γδT細胞培養液，培養過程中將細胞密度控制在(1.5-2)×106個/ml，置于飽和濕度、37℃、5.0％CO2的培養箱內繼續培養。同時抽樣1ml于15ml離心管中，進行細菌、真菌檢測。7.在培養第13-14天，仔細觀察細胞生長狀態，根據細胞生長情況，并向兩個細胞培養袋中均添加γδT細胞培養液，培養過程中將細胞密度控制在(2-3)×106個/ml，置于飽和濕度、37℃、5.0％CO2的培養箱內繼續培養。8.在培養第15-16天，根據細胞生長情況，收集γδT細胞，將培養袋中的細胞轉移至250ml無菌離心杯中，800g，離心10min。9.棄上清液，將離心杯里的細胞沉淀用100ml注射用無菌生理鹽水重懸，洗滌2次，800g，離心10min。10.棄上清液，使用注射用無菌生理鹽水重懸細胞沉淀，并轉移至250ml無菌離心杯中，體積為200ml，即得到γδT細胞，冰上放置，備用。同時抽樣1ml于15ml離心管中，進行細菌、真菌檢測。三、γδT細胞的生物學特性及功能檢測1.γδT細胞增殖速度：在培養過程中的不同時間點取樣，檢測γδT細胞生長狀態，并用臺盼蘭染色法計數，結果顯示γδT細胞生長狀態良好，臺盼蘭染色著色細胞數均小于10％，表明本發明方法培養細胞的效果好。期間統計γδT細胞的生長速度，制作細胞的生長曲線(γδT細胞培養液I擴增γδT細胞的生長曲線如圖1)。結果表明，使用上述方法擴增γδT細胞時，細胞生長迅速，得到的細胞數量多(表2)。表2、培養過程中γδT細胞總數的平均值2.γδT細胞純度：取步驟二中步驟10得到的γδT細胞1×106個置于離心管中，使用100μl1×PBS溶液重懸細胞成單細胞懸液；每管加入mouseIgG(BD公司)溶液(0.1μg/μl)2μl，室溫，封閉15～30min；向相應樣品中管中加入BD公司熒光標記的抗體(PE-conjugatedanti-γδTCR(cloneB1)、APC-conjugatedanti-CD3e(cloneUCHT1))，4℃，避光，標記30min；每管加入1.0ml1×PBS溶液，混勻細胞，4℃，3000rpm，5min，離心，棄上清；重復洗滌2次；使用300μl1×PBS溶液重懸標記后的細胞，FACSCalibur儀器檢測，FlowJo7.6軟件分析所得數據。結果顯示，γδT細胞培養液I、II、III培養的γδT細胞中，CD3+γδTCR+的T細胞(CD3+TCR+γδT細胞)分別占總細胞的90.6％、93.5％、90.3％(圖2)，說明本發明方法所培養的γδT細胞純度均為90％以上。3.γδT細胞致瘤性檢測3.1體外軟瓊脂克隆試驗：利用GENMEDSCIENTIFICS公司的軟瓊脂克隆試劑盒進行實驗，其中低養液、中養液和克隆液均為試劑盒中試劑，具體步驟如下：用無菌生理鹽水將步驟二中步驟10得到的γδT細胞濃度調整至2.5×103個/ml，得到細胞懸液1；取3ml細胞懸液1于50ml無菌離心管中，800g25℃離心10min后棄上清液，向沉淀中加入3.375ml中養液重懸細胞，并加入1.125ml的克隆液及25μl的刺激劑混合液(刺激劑混合液由溶質和溶劑組成，溶劑為無菌生理鹽水，溶質為人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸)，混勻，得到細胞懸液2，細胞懸液2中的人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素和唑來膦酸的濃度與相應的擴增γδT細胞的γδT細胞培養液中的各試劑的濃度相同；將上述細胞懸液2加到已鋪有凝膠的12孔板中，1.5ml/孔，輕輕混勻，室溫放置2小時后，將12孔板放入孵箱，37℃、5.0％CO2培養12小時后每孔加入含人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素、唑來膦酸的低養液0.5ml，37℃、5.0％CO2培養，每72小時補加含人白細胞介素2、人白細胞介素7、植物血凝素、唑來膦酸的低養液；培養14天后，觀察12孔板中細胞克隆形成情況。結果表明，經γδT細胞培養液I、γδT細胞培養液II和γδT細胞培養液III培養得到的γδT細胞在按照上述方法經14天培養后各孔中均無細胞克隆形成。3.2裸鼠致瘤性試驗：按照《中國藥典》三部的要求檢測本發明三種方法制備的γδT細胞對裸鼠的致瘤性。用無菌生理鹽水調整步驟二中步驟10得到的γδT細胞濃度后背部皮下注射裸鼠(SPF級)(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，注射量為1.0×107細胞/鼠，注射體積0.2ml；使用Hep2細胞(美國標準生物品收藏中心(ATCC)，產品目錄號為CCL-23)作為陽性對照細胞，注射量為1.0×106細胞/鼠，背部皮下注射，注射體積0.2ml；使用WI-38細胞(美國標準生物品收藏中心(ATCC)，產品目錄號為CCL-75)作為陰性對照細胞，注射量為1.0×107細胞/鼠，背部皮下注射，注射體積0.2ml。接種后觀察小鼠背部結節形成情況，接種后第3周，陽性組12只裸鼠背部均出現腫瘤結節，并進行性增大，陰性組及實驗組各12只裸鼠直至接種后12周，背部均未出現結節。接種細胞12周后將裸鼠處死，使用流式細胞術檢測外周血中腫瘤細胞浸潤情況，病理組織學檢測肝、脾等臟器中腫瘤細胞浸潤情況。結果表明，實驗組小鼠外周血及各臟器中均未檢測到γδT細胞浸潤。實驗經3次重復，結果一致。以上結果表明，經γδT細胞培養液I、γδT細胞培養液II和γδT細胞培養液III培養得到的γδT細胞不存在致瘤性。4.γδT細胞對K562細胞、SK-MES-1細胞及Ho8910細胞的殺傷活性檢測本發明三種方法制備的γδT細胞對K562細胞、SK-MES-1細胞及Ho8910細胞的殺傷活性，實驗方法如下：使用紅色熒光染料(CellTraceFarRed，Invitrogen公司)標記靶細胞，即K562細胞(美國標準生物品收藏中心(ATCC)，產品目錄號為CCL-243)、SK-MES-1細胞(美國標準生物品收藏中心(ATCC)，產品目錄號為HTB-58)及Ho8910細胞(中國科學院細胞庫，產品目錄號為TCHu24)：將紅色熒光染料與靶細胞于37℃，避光，水浴20分鐘，每5～10分鐘搖晃1次，混勻細胞。之后使用含10％胎牛血清的1640培養液洗滌細胞，3000rpm，10分鐘，25℃，共3次。使用含10％胎牛血清的1640培養液將細胞濃度調整為1×105個/ml，備用。4小時殺傷實驗：在無菌FACs管中加入標記的靶細胞，每管加100μl。根據效應細胞與靶細胞的比例(效靶比)調整效應細胞(γδT細胞)的濃度，并向各管中加入γδT細胞懸液，體積為100μl/孔。對照靶細胞管不加效應細胞，只加100μl的含10％胎牛血清的1640培養液。每個實驗設置四個重復。輕輕混勻，37℃，5.0％CO2，培養4小時。流式細胞儀檢測靶細胞的熒光強度，區分熒光陽性/陰性的靶細胞。殺傷活性的計算：用細胞毒性百分比表示：細胞毒性(％)＝[(對照管靶細胞數－實驗管靶細胞數)/對照管靶細胞數]×100％。γδT細胞培養液I培養的γδT細胞的殺傷結果如圖3所示。γδT細胞培養液I、γδT細胞培養液II和γδT細胞培養液III的結果如表3所示。表3、γδT細胞的平均細胞毒性(％)結果表明，經γδT細胞培養液I、γδT細胞培養液II和γδT細胞培養液III培養得到的γδT細胞對K562細胞、SK-MES-1細胞及Ho8910細胞均有較強的殺傷活性。5.細菌、真菌、病毒及支原體等外源性因子檢測按照《中國藥典》三部要求，檢測本發明三種方法制備的γδT細胞中細菌、真菌、病毒及支原體等外源性因子污染情況，具體檢查方法如下：5.1細菌、真菌檢查：取γδT細胞培養上清液及γδT細胞懸液樣品，按《中國藥典》三部(2015年版)方法進行檢測。使用硫乙醇酸鹽流體培養基(細菌檢測)、胰酪大豆胨液體培養基(細菌、真菌檢測)進行培養，培養14天，觀察細菌及真菌生長情況。5.2支原體檢查：取γδT細胞培養上清液，分別接種于支原體瓊脂培養基、精氨酸支原體肉湯培養基、支原體半流體培養基中，按《中國藥典》三部(2015年版)方法進行培養，培養21天，觀察支原體污染情況。5.3病毒因子檢測(1)取γδT細胞懸液樣品2ml，接種于T175培養瓶中，并加入γδT細胞擴增培養液I48ml，維持培養14天后，將細胞懸液轉移至50ml無菌離心管中，3000rpm，10min，20℃，離心細胞；(2)將上清液轉移至另一離心管中，-20℃保存，備用；原離心管中剩余1ml上清，重懸細胞并轉移至1.5ml離心管中；(3)將裝有細胞溶液的1.5ml離心管置于液氮中反復凍融3次，3000rpm，10min，20℃，離心；取上清液進行病毒核酸抽提，之后使用乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)、人類免疫缺陷病毒1型核酸定量檢測試劑盒(巢式PCR-熒光法)、單純皰疹病毒Ⅱ型核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒、人巨細胞病毒核酸擴增熒光定量檢測及丙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進行DNA和RNA病毒的檢測。結果表明，γδT細胞培養液I、γδT細胞培養液II和γδT細胞培養液III培養得到的γδT細胞中細菌、真菌、病毒及支原體等外源性因子均為陰性。以上各項結果表明本發明方法制備的γδT細胞用于治療惡性腫瘤在安全性及有效性等方面均符合要求。當前第1頁1 2 3