重組靈芝免疫調節蛋白在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及畢赤酵母（Pichiapastoris）所表達的重組靈芝免疫調節蛋白（rLZ-8）在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應用。rLZ-8能夠治療神經功能損傷，降低腦損傷引起的神經功能評分，減少ED-1陽性細胞數，從而降低炎性反應，并可抑制細胞凋亡。
【專利說明】重組靈芝免疫調節蛋白在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥領域,涉及使用畢赤酵母(Pichia pastoris)表達的重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]靈芝是中醫藥學中一種珍貴的藥用真菌，屬擔子菌綱多孔菌目靈芝科。靈芝免疫調節蛋白首次由Kino等從靈芝子實體提取物中分離純化得到的真菌免疫調節蛋白，由110個氨基酸所組成，N端絲氨酸乙酰化，蛋白分子質量為12.4kD，并命名為LZ-8。很多研究表明，LZ-8具有促進細胞有絲分裂和免疫調節的作用等多種活性。重組靈芝免疫調節蛋白(Recombinant Immunoregulatory Protein of Ganoderma Lucidium, rLZ_8)是經由rLZ-8真核表達載體PichiaPink?菌株，篩選出穩定高效分泌表達的工程菌株中提取，并驗證rLZ-8具有與LZ-8相同的免疫學活性與生物活性。
[0003]腦缺血是腦血管意外的一種，腦血管意外又稱腦卒中、中風，是中老年人的常見病、多發病，嚴重威脅著人類的健康與生活。近些年來，隨著科學技術的不斷發展，研究學者對腦缺血病發病機制、腦組織細胞損傷級聯反應等的深入研究，發現可通過抑制細胞凋亡、降低炎癥反應與自由基等多種途徑來緩解腦組織損傷。
[0004]本發明的重組靈芝免疫調節蛋白不僅可改善腦缺血損傷引起的行為功能障礙，而且可通過降低炎癥反應、抑制細胞凋亡緩解腦組織損傷，對應用重組靈芝免疫調節蛋白研制治療腦缺血損傷藥物有一定的積極作用。
【發明內容】
[0005]本發明涉及重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應用，通過一系列的實驗手段和結果表明rLZ-8對大鼠局灶性腦缺血具有顯著的治療作用，具體
【發明內容】
如下:
本發明以大鼠作為研究對象，采用改良的Zea Longa法制備大鼠局灶性腦缺血模型，設計了包括陰性對照組(假手術組)，陽性藥對照組(單唾液酸巳己糖神經節苷脂鈉注射液(GM-1))，模型組，rLZ-8 高劑量組(70 μ g.kg—lrLZ-S 中劑量組(35 μ g.kg—OjLZ-S 低劑量組(17.5μ g *kg -1)在內的6個實驗組。在給藥程序方面設計為:腹腔注射，每天給藥2次，假手術組與模型組注射等體積生理鹽水，連續給藥7天。首先，考察了 rLZ-8對神經功能損傷的治療作用，按改良的NSS評分標準對其進行評分(16分制)，各給藥組及模型組動物在造模后(當日，術后約5h)均出現不同程度神經功能障礙，rLZ-8高、低劑量組評分效果顯著(/7〈0.01)，說明rLZ-8可降低神經功能評分，改善神經功能。有力說明了，rLZ-8對局灶性腦缺血的治療作用；通過HE染色實驗，假手術組腦組織神經元及膠質細胞數量、形態分布正常，細胞膜完整，胞漿均勻，細胞核位于中央，染色質分布較均勻；模型組腦組織稀疏，可見大量壞死神經元，細胞結構消失，胞核固縮深染，細胞壞死崩解，細胞間隙增大，壞死面積較大；rLZ-8高劑量組動物腦組織較模型組有不同程度的改善，表現為胞核固縮、溶解等病理改變較輕，壞死面積較小。采用PV-6000 二步法免疫組化檢測試劑對實驗大鼠進行ED-1陽性細胞表達的檢測，結果表明與模型組比較，rLZ-8高劑量組ED-1陽性細胞數明顯減少，可降低腦缺血損傷引起的炎性反應。采用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡，按照試劑盒說明書指導步驟進行試驗，實驗結果表明rLZ-8劑量組凋亡細胞數明顯低于模型組，并且隨著rLZ-8濃度的增加，細胞凋亡數逐漸減少。進一步說明了，rLZ-8對局灶性腦缺血的治療作用。
[0006]經過上述重組靈芝免疫調節蛋白rLZ-8在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應用的一系列實驗結果表明，rLZ-8能夠治療和緩解實驗大鼠的神經損傷和生存狀態，抑制腦組織細胞凋亡而治療腦缺血損傷。
[0007]說明書【專利附圖】
【附圖說明】 圖1各組大鼠體重變化
其中，S為假手術組，M為模型組，GM-1為陽性藥對照組，H為rLZ-8高劑量組，Z為rLZ_8中劑量組，L為rLZ-8低劑量組
圖2各組大鼠腦組織形態學觀察(HE染色，40 X )
其中，A為假手術組，B為模型組，C為GM-1組，D為rLZ-8高劑量組，E為rLZ_8中劑量組，F為rLZ-8低劑量組
圖3造模8天后各組ED-1陽性細胞(40 X )
其中，A為假手術組，B為模 型組，C為GM-1組，D為rLZ-8高劑量組，E為rLZ_8中劑量組，F為rLZ-8低劑量組
圖4造模8天后各組凋亡細胞(4 0 X )
其中，A為假手術組，B為模型組，C為GM-1組，D為rLZ-8高劑量組，E為rLZ_8中劑量組，F為rLZ-8低劑量組具體實施方法
實施例1:rLZ-8對神經功能損傷的治療作用 1.實驗材料
大鼠，體重250-300g，雌雄各半，由吉林大學實驗動物中心提供。單唾液酸巳己糖神經節苷脂鈉注射液(GM-1 )，北京四環制藥有限公司，手術器械。
[0008]2.實驗方法
采用改良的Zea Longa法制備大鼠局灶性腦缺血模型，術后待大鼠完全清醒后，每天按改良的NSS評分標準對其進行評分(16分制)。實驗設假手術組，模型組，陽性藥對照組，rLZ-8 高劑量組(7(^8*1^1)、1^-8中劑量組(354 8*1^-1)、1^-8低劑量組(17.548.!^_0。腹腔注射，每天給藥2次，假手術組與模型組注射等體積生理鹽水，連續給藥7天。陽性對照藥為單唾液酸巳己糖神經節苷脂鈉注射液(GM-1)。
[0009]3.實驗結果
表1顯示，各給藥組及模型組動物在造模后(當日，術后約5h)均出現不同程度神經功能障礙，以模型組神經功能評分最高，rLZ-8高、低劑量組評分可明顯改善似)，說明rLZ-8可降低神經功能評分,改善神經功能。
[0010]表1各組大鼠NSS評分結果(X 土 s，n=12)
【權利要求】
1.重組靈芝免疫調節蛋白在制備治療局灶性腦缺血藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的治療局灶性腦缺血損傷的應用，其特征在于重組靈芝免疫調節蛋白可降低由腦缺血損傷引起的神經功能評分。
3.如權利要求1所述的治療局灶性腦缺血損傷的應用，其特征在于重組靈芝免疫調節蛋白可減少ED-1陽性細胞數，降低炎性反應，治療腦缺血損傷。
4.如權利要求1所述的治療局灶性腦缺血損傷的應用，其特征在于重組靈芝免疫調節蛋白可降低凋亡細胞數，抑制腦組織細胞凋亡。
5.如權利要求1所述的制備治療局灶性腦缺血藥物，其特征在于該藥物制劑核心成分是由權利要求1所述的重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)和任選的藥學可接受的輔劑組成。
6.如權利要求1所述的藥物制劑給藥途徑為口服和非腸道給藥，其中，口服包括口服液，片劑，丸劑和膠囊；非腸.道給藥包括外用藥和注射劑。
【文檔編號】A61P29/00GK103463618SQ201310402259
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】孫非, 梁重陽, 張喜田 申請人:張喜田, 孫非