Afp和gm-csf雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和AFP基因；所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本發明所述的雙基因共表達重組載體，采用IRES序列來連接AFP基因和GM-CSF基因，能夠在同一載體中同時表達甲胎蛋白以及粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子，該重組載體可用于肝癌的基因免疫治療，既能發揮細胞因子的免疫調節作用，又能靶向性地針對肝癌產生特異性抗腫瘤效應。
【專利說明】AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種重組載體及其制備方法和應用，特別是涉及一種雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]原發性肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌的高發區，每年發生的肝癌占全世界的50%以上，肝癌死亡率己占全國腫瘤死亡率的第二位，是一種嚴重威脅人們生命健康的疾病。手術切除是目前療效最好的肝癌治療手段，目前肝移植技術亦相當成熟，但由于費用高、供體來源困難，術后使用抗排斥藥物會因免疫抑制而使殘癌生長更快和出現轉移等問題，對中晚期肝癌的療效欠佳。
[0003]近年來，隨著分子生物學和腫瘤免疫學等學科的飛速發展，腫瘤免疫治療已成為腫瘤治療研究的熱點，多種免疫治療方法已用于肝癌的臨床研究，比如細胞因子治療、自體完整的腫瘤細胞疫苗、效應細胞回輸治療、以樹突狀細胞為基礎的肝癌疫苗等。研究學者認為，肝癌特別適宜于免疫治療，原因如下:(I)肝癌化療效果不明顯，常規不應進行化療，因而免疫系統不會因為化療而受損；(2)肝癌腫瘤生長相對較慢，有足夠時間用以開展和加強有效的抗腫瘤免疫效應；(3)肝臟足多血供器官，免疫效應細胞容易浸潤并增殖；(4)肝癌病灶多局限于肝內，臨床隨訪時采用標準的影像學技術比較容易對腫瘤負荷進行定量評估，有利于治療效果的判斷。其中，細胞因子基因免疫治療是腫瘤免疫治療與基因治療的結合，其通過將具有抗腫瘤作用的細胞因子基因導入宿主體內，并使之穩定有效地表達，使體內持續存在一定水平的內源性細胞因子，以發揮抗腫瘤的作用。然而，目前的細胞因子基因免疫治療方法缺乏腫瘤靶向性，其抗腫瘤效果有待提高。
[0004]粒細胞一巨卩遼細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage ColonyStimulating Factor,GM-CSF)是一種重要的免疫調節分子,它不僅可誘導在T細胞免疫反應中起關鍵作用的DC細胞成熟、分化，而且在免疫治療過程中可增強主要和次要的抗體反應，以促進DC等APC分化、成熟和活化以及上調協同刺激分子(如CD86)的表達水平，增強中性粒細胞、單核巨噬細胞、嗜酸性粒細胞對腫瘤細胞的吞噬作用和ADCC效應等活性，促進Th、Tc、NK細胞在腫瘤部位浸潤，抑制腫瘤細胞的生長。GM-CSF目前已被廣泛應用于腫瘤的免疫治療，GM-CSF以其顯著的免疫調節作用和低毒性，成為腫瘤疫苗重要的免疫佐劑，轉染GM-CSF基因的腫瘤疫苗在黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤的免疫治療研究中均取得了顯著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治療方法只是局部地提高機體的GM-CSF蛋白表達水平，其免疫調節作用、抗腫瘤能力較小，而且缺乏免疫治療的靶向性。
[0005]甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein, AFP)是一個胚胎特異性的α-球蛋白，是哺乳動物早期胚胎血清中的一個重要的組份。正常情況下，AFP是由胎兒的肝臟和卵黃囊產生的，胎兒出生后，血清中的AFP含量迅速下降，在正常的成人體內是檢測不到或僅有極其微量的AFP。AFP是人類發現的第一個具有臨床應用價值的腫瘤標志物，一直以來被認為是診斷原發性肝細胞癌的重要標志物。在成人中，約有80%的原發性肝細胞癌患者的血清中，都可以檢測到AFP的表達，顯示AFP篩查是發現早期肝癌的一種高效的手段。AFP可以作為腫瘤標志物，作為腫瘤免疫治療的靶位，刺激機體產生體液免疫和細胞免疫，腫瘤細胞可以在其表面表達并遞呈AFP多肽與MHC復合物，進而刺激機體免疫系統，產生特異性殺傷性T細胞，殺傷腫瘤細胞。研究表明，AFP可以和多種抗癌藥物結合，并通過受體介導的胞吞作用選擇性地進入腫瘤細胞，從而靶向、高效地殺死腫瘤細胞。
【發明內容】
[0006]基于此，有必要針對現有技術存在的缺陷，提供一種AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體，該重組載體可用于肝癌的基因免疫治療，既能發揮細胞因子的的免疫調節作用，又能靶向性地針對肝癌產生特異性抗腫瘤效應。
[0007]本發明的另一個目的是，提供所述AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體的制備方法。
[0008]本發明的再一個目的是，提供所述AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體在肝癌的基因免疫治療中的應用。
[0009]AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和AFP基因；所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
[0010]在其中一個 實施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為PIRES2-AFP-GM-CSF重組載體；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。
[0011]在其中一個實施例中，所述PIRES2-EGFP質粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。
[0012]本發明所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0013]I)獲得含有特異性酶切位點的AFP基因片段；
[0014]2)將步驟I)得到的AFP基因片段連接于載體，構建含有AFP基因的重組載體；
[0015]3)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段；
[0016]4)將步驟3)得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構建所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體。
[0017]在其中一個實施例中，所述的pIRES2-AFP-GM-CSF重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0018]a)獲得含有特異性酶切位點的AFP基因片段:從肝癌細胞H印G2獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點序列的AFP特異性引物進行PCR擴增，得到含有BglII和EcoR I酶切位點的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0019]b)構建pIRES2-AFP-EGFP重組載體:用限制性內切酶Bgl I1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質粒以及步驟a)得到的AFP基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到 pIRES2-AFP-EGFP 重組載體；
[0020]c)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段:從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應產物再進行雜交PCR反應，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；
[0021]d)構建pIRES2-AFP-GM-CSF重組載體:用限制性內切酶BstX 1、Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-AFP-EGFP重組載體，將步驟c)得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-AFP-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到PIRES2-AFP-GM-CSF 重組載體。
[0022]在其中一個實施例中，步驟a)所述的AFP特異性引物為:
[0023]AFP 上游引物:5 ’ -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3，，
[0024]AFP 下游引物:5 ’ -TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3 ’。
[0025]在其中一個實施例中，步驟c)所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對和GM-CSF第二引物對，所述的GM-CSF第一引物對由GM-CSF上游長引物和GM-CSF下游長引物組成，所述的GM-CSF第二引物對由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成:
[0026]GM-CSF第一引物對為:
[0027]GM-CSF 上游長弓丨物:5’ -AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，
[0028]GM-CSF 下游長引物:5’-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’ ；
[0029]GM-CSF第二引物對為: [0030]GM-CSF 上游短引物:5’ -ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，
[0031]GM-CSF 下游短引物:5’ -GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’。
[0032]本發明所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體在肝癌基因免疫治療中的應用。
[0033]在其中一個實施例中，將所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體轉染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細胞后植入患者體內，進行肝癌基因免疫治療。
[0034]本發明所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體，采用IRES序列來連接AFP基因和GM-CSF基因，能夠在同一載體中同時表達甲胎蛋白(AFP)以及粒細胞一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，可減少基因載體的用量，減少非治療相關的外源基因序列的引入。其中，AFP是腫瘤靶向性的相關抗原，GM-CSF是發揮免疫調節作用的細胞因子，兩者聯合使用，既可以發揮細胞因子的的免疫調節作用，又可以靶向性地針對特定腫瘤產生特異性的抗腫瘤效應，從而能夠獲得更好的肝癌免疫治療效果。將雙基因共表達重組載體轉染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細胞后植入患者體內，AFP的大量表達，可刺激樹突狀細胞遞呈AFP多肽與MHC復合物，進而刺激機體免疫系統，產生特異性殺傷性T細胞，靶向性地殺傷表達AFP多肽的腫瘤細胞；而GM-CSF的大量表達，能進一步增強主要和次要的抗體反應，還能誘導DC細胞成熟、分化，促進T細胞免疫反應，一方面增強機體免疫調節能力，另一方面作為免疫佐劑，協同擴大抗腫瘤免疫效應。
[0035]IRES序列是來源于某些病毒和細胞mRNA5’端的一段非翻譯區，可以不依賴帽的方式啟動遠端的mRNA翻譯，可在上游啟動子的控制下和與之相連的基因共同轉錄，在同一轉錄本上翻譯出不同的蛋白。IRES連接多基因進行共表達時，多個基因的mRNA在同一條轉錄子上，但轉錄后的翻譯過程相互獨立，上游基因以傳統方式進行翻譯，下游基因依靠IRES序列以不依賴帽的方式進行翻譯，保證了各個基因的獨立結構及功能。利用IRES代替內部啟動子，不但可使多基因共表達載體大大縮小，而且還克服了傳統多基因表達載體中啟動子之間的相互抑制現象，避免融合蛋白的產生。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036]圖1為實施例一所得的含有特異性酶切位點序列的AFP基因片段的電泳圖，其中，I為AFP基因，M為標記；
[0037]圖2 為 pIRES2-EGFP 質粒圖譜；
[0038]圖3為實施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體圖譜；
[0039]圖4為實施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應產物，M為標記；
[0040]圖5為實施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應產物，M為標記；
[0041]圖6為實施例三所得的帶有限制性內切酶粘性末端的GM-CSF基因片段的電泳圖，其中，I為PCR擴增產物A，2為PCR擴增產物B，M為標記；
[0042]圖7為實施例三所述的雜交PCR反應的流程圖；
[0043]圖8為實施例四所得的PIRES2-AFP-GM-CSF重組載體圖譜；
[0044]圖9為實施例四所得的PIRES2-AFP-GM-CSF重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為Bgl II/EcoR I雙酶切反應產物，2為EcoR I/Not I雙酶切反應產物，3為Bgl I I/Not I雙酶切反應產物，M為標記。
【具體實施方式】
[0045]下述實施例中，所用到的實驗技術，例如PCR技術、引物設計技術、載體構建技術、檢測技術、電泳技術等均為基因工程中的常規技術，本領域技術人員可根據現有技術實現(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，科學出版社第三版；或者按照產品說明書進行)。在操作過程中所用到的設備、試劑、載體、菌株等，均為通過市場購買得到的常規產品。
[0046]實施例一:獲取含有特異性酶切位點的AFP基因片段
[0047]1、引物設計
[0048]根據AFP基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)以及pIRES2_EGFP質粒載體上預期插入的多克隆位點，設計特異性引物如下:
[0049]AFP上游引物(如序列表中SEQ ID N0:4所示):
[0050]5? -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3?(下劃線部分為 Bgl II 酶切位點序列)，
[0051]AFP下游引物(如序列表中SEQ ID NO: 5所示):
[0052]5，-TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3，(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點序列)。
[0053]2、獲取cDNA模板
[0054]TRIzon法從人肝癌細胞H印G2中提取RNA(TRIzon總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，產品編號為CW0580)，并反轉錄成cDNA (反轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，產品編號為RR019A)。
[0055]3、獲取含有特異性酶切位點的AFP基因片段[0056]以人肝癌細胞H印G2中提取的RNA所反轉錄的cDNA為模板，在上述含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，通過PCR反應獲得AFP基因片段，其上游含有Bgl II酶切位點序列，下游含有EcoR I酶切位點序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，電泳結果如圖1所示。
[0057]PCR反應體系如下(50 μ L):
[0058]
eDNA 模R (IOOngZpL)LOpL,
AFP 1:游引物(ΙΟμΜ)2.0pL,
AFP 下游引物(IΟμΜ)2.0μΙ,
2 X Prime STAR Max DNA Polymerase 25pL,
滅爾蒸餾水20μΙο
[0059]其中，2XPrime STAR Max DNA Polymerase為DNA聚合酶-緩沖液復合物，購自寶生物工程(大連)有限公司，產品編號為R045A。
[0060]PCR反應條件為:95°C預變性5min ;98°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸5s，30個循環；72°C最終延伸5min。
[0061]實施例二:pIRES2-AFP_EGFP重組載體的構建
[0062]使用限制性內切酶Bgl II和EcoR I，分別酶切pIRES2_EGFP質粒(該質粒的多克隆位點處含有Bgl II, EcoR I酶切位點)以及實施例一所得的AFP基因片段，得到酶切后線性化的PIRES2-EGFP載體以及酶切后的AFP基因序列；采用T4DNA連接酶體系進行連接反應，在22°C下孵育30分鐘，然后在70°C下滅活5分鐘，構建pIRES2_AFP_EGFP重組載體(如圖3所示)。
[0063]由pIRES2-EGFP質粒的結構特點(如圖2所示)可知，AFP基因插入pIRES2_EGFP質粒的多克隆位點后，位于質粒載體的自身序列IRES的上游(如圖3所示)，即在同一啟動子啟動下的AFP和EGFP序列分別表達。
[0064]1、雙酶切 pIRES2-EGFP 質粒
[0065]酶切反應體系如下(50 μ L):
[0066]
pIRES2-EGFP 質粒(IOOng^iL) 20μΙ,
Λ 切 _ Bgl 丨 I (I Ου/μ? )2 ,OpL,
內切ft EcoR I (15υ/μ?)2.0μ?,
10ΧΗ Buffer (丨馨切緩沖液)5.0pL?
無#?蒸鎦水21μ?ο
[0067]其中，內切酶Bgl II與10ΧΗ Buffer為Bgl II內切酶緩沖液體系，購自寶生物工程(大連)有限公司，產品編號為1021A ;內切酶EcoR I與IOXH Buffer為EcoR I內切酶緩沖液體系，購自寶生物工程(大連)有限公司，產品編號為1040A。
[0068]酶切反應條件:在37°C下反應6個小時。[0069]2、雙酶切AFP基因片段
[0070]酶切反應體系如下(50 μ L):
[0071]
【權利要求】
1.AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有AFP基因、IRES序列和GM-CSF基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和AFP基因； 所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
2.根據權利要求1所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其特征在于:所述的載體為pIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為pIRES2_AFP-GM_CSF重組載體；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。
3.根據權利要求2所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體，其特征在于:所述PIRES2-EGFP質粒載體中的EGFP序列被GM-CSF基因替代。
4.權利要求1所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟: 1)獲得含有特異性酶切位點的AFP基因片段； 2)將步驟I)得到的AFP基因片段連接于載體，構建含有AFP基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段； 4)將步驟3)得到的GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構建所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體。
5.權利要求2所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟:` a)獲得含有特異性酶切位點的AFP基因片段:從肝癌細胞H印G2獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點序列的AFP特異性引物進行PCR擴增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位點的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； b)構建pIRES2-AFP-EGFP重組載體:用限制性內切酶BglI1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質粒以及步驟a)得到的AFP基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到 pIRES2-AFP-EGFP 重組載體； c)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段:從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應產物再進行雜交PCR反應，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)構建pIRES2-AFP-GM-CSF重組載體:用限制性內切酶BstXI, Not I酶切步驟b )得到的PIRES2-AFP-EGFP重組載體，將步驟c )得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-AFP-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到PIRES2-AFP-GM-CSF 重組載體。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟a)所述的AFP特異性引物為: AFP 上游引物:5’ -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3’， AFP 下游引物:5’ -TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3’。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟c)所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對和GM-CSF第二引物對，所述的GM-CSF第一引物對由GM-CSF上游長弓丨物和GM-CSF下游長引物組成，所述的GM-CSF第二引物對由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成: GM-CSF第一引物對為: GM-CSF 上游長引物:5’ -AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’， GM-CSF 下游長引物:5’ -GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’ ； GM-CSF第二引物對為: GM-CSF 上游短引物:5’ -ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’， GM-CSF 下游短引物:5’ -GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’。
8.權利要求1或2所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體在肝癌基因免疫治療中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:將所述的AFP和GM-CSF雙基因共表達重組載體轉染肝癌患者自身或異體分離的樹突狀細胞后植入患者體內，進行肝癌基因免疫治療。
【文檔編號】A61P35/00GK103555762SQ201310571899
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】栗炳南, 豐慧根, 左百樂, 林俊堂, 曹毓林 申請人:新鄉醫學院