鞣花酸在治療和預防人體真菌感染的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種鞣花酸在治療和預防人體真菌感染的藥物中的應用，本發明研究了鞣花酸對23株真菌的體外抑真菌活性，并測定了MIC值。鞣花酸對真菌的體外活性結果顯示，鞣花酸對6種皮膚癬菌的MIC值范圍為6.25-50μg/ml，鞣花酸對臨床常見的淺部致病真菌具有較強的抑制作用，尤其對紅色毛癬菌最為敏感。鞣花酸對6種臨床常見念珠菌的MIC值范圍為25-200μg/ml。本發明采用以鞣花酸內服、外用對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型進行治療，以注射方式對鞣花酸單一給藥或與氟康唑共同給藥對小鼠真菌感染模型的治療作用進行研究。其結果表明，鞣花酸內服、外用均對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型有一定療效。
【專利說明】鞣花酸在治療和預防人體真菌感染的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及鞣花酸在制備治療和預防人體真菌感染疾病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]鞋花酸的分子式C14H608,英文名:ellagicacid,化學名:2，3，7，8-tetrahydroxybenzopyrano-5, 4, 3_cde benzopyran-5, 10-dione。微溶于水、醇，溶于喊、吡卩定，不溶于醚。
[0003]鞣花酸可由地錦草、斑地錦、黑莓、覆盆子、草莓、蔓越莓、山核桃、石榴、枸杞等植物中提取制得，也可由化學合成制得。
[0004]隨著社會進步和人們生活水平的提高，人們愈來愈關注健康和生活的質量，真菌感染疾病是一種常見病、多發病，近年來呈逐漸上升的趨勢，然而隨著抗真菌劑的廣泛應用，臨床耐藥菌株不斷增多，加之致病真菌對現有藥物的耐藥性日趨嚴重，使得真菌感染易于發生并難于控制。目前臨床上應用的抗真菌藥物在一定程度上起到了控制致病真菌感染的作用，但還存在很多不足，如兩性霉素B具有嚴重的腎毒性；氮唑類藥物在抑制真菌的同時對哺乳動物的細胞色素P450系統也具有抑制作用，進而產生毒副反應，少數使用者還可出現嚴重的肝毒性；酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等均有引起肝壞死或肝毒性致死的報道。目前，在天然活性成分中尋找新的高效低毒抗真菌新藥物已成為近年來抗真菌藥物研究的熱點和趨勢。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種鞣花酸在治療和預防人體真菌和細菌感染的藥物中的應用，本發明采用美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的《產孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案》(M38-A)，以特比萘酚、氟康唑為陽性對照藥，研究了鞣花酸對23株真菌的體外抑真菌活性,并測定了 MIC值。鞣花酸對真菌的體外活性結果顯示，鞣花酸對6種皮膚癬菌的MIC值范圍為6.25~50 ii g/ml，鞣花酸對臨床常見的淺部致病真菌具有較強的抑制作用，尤其對紅色毛癬菌最為敏感。鞣花酸對6種臨床常見念珠菌的MIC值范圍為25~200 ii g/ml。本發明采用以鞣花酸內服、外用對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型進行治療，以注射方式對鞣花酸單一給藥或與氟康唑共同給藥對小鼠真菌感染模型的治療作用進行研究。其結果表明，鞣花酸內服、外用均對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型有一定療效，通過蘇木精-伊紅(HE)染色，碘酸-雪夫(PAS)染色及真菌鏡檢轉陰、治愈率可達88.90%。以注射方式對小鼠真菌感染模型的治療中鞣花酸單一給藥時小鼠死亡率最高為25.0%，最低為8.3%，當與氟康唑合用注射給藥時死亡率可控制在0%~16.7%以內。鞣花酸給藥方式適用于內服、外用、注射給藥，且鞣花酸可用于單一成分入藥或與其它藥物組合入藥，經體內外試驗均表明本品抗真菌作用顯著。本發明鞣花酸的開發對抗真菌藥物臨床前景更顯重要。`
[0006]本發明所述的一種鞣花酸在制備治療和預防人體真菌感染疾病的藥物中的應用。
[0007]鞣花酸用藥的純度為50-100%。[0008]鞣花酸為單一成分入藥或與其它藥物組合入藥。
[0009]鞣花酸入藥的臨床人日使用量為I U g-20g之間。
[0010]鞣花酸藥物的給藥方式為內服、外用和注射。
[0011]本發明通過研究鞣花酸對小鼠、豚鼠真菌感染模型的治療作用，并進行體外對臨床常見真菌的最低抑菌濃度(MIC)測定，證實了鞣花酸體內外抗真菌效果顯著。
[0012]本發明研究了鞣花酸對小鼠真菌感染模型的治療作用，通過建立小鼠真菌感染模型，采用腹腔注射給藥7天，進行一般狀況觀察、測定體重，計算死亡率，測定小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量。結果顯示，各給藥組對小鼠真菌感染模型均有一定治療作用，真菌感染小鼠死亡率最高為25.0%，最低為8.3%，且鞣花酸高劑量(8mg/mL)與模型組相比死亡率顯著降低，鞣花酸單用起效劑量為4mg/mL。鞣花酸與臨床常用抗真菌藥物氟康唑合用，當氟康唑:鞣花酸2:1時可明顯改善造模小鼠的一般癥狀，體重比模型組顯著增加，死亡率為0%，SOD活性及MDA含量與正常小鼠接近。鞣花酸與氟康唑合用起效劑量為氟康唑:鞋花酸=2mg/mL:2mg/mL,綜上,鞋花酸單用或與氟康唑合用均可顯著降低小鼠真菌感染死亡率、改善其癥狀。
[0013]另外，通過建立豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染模型，采用外用、口服給藥7天，以皮膚病變程度、治愈率和真菌鏡檢轉陰率為評價指標，觀察鞣花酸以與對豚鼠皮膚癬菌感染模型的治療作用。結果顯示，鞣花酸外用高劑量組(0.4g軟膏/cm2)治愈率為88.90%,中劑量(0.2g軟膏/cm2)為87.50%，低劑量(0.1g軟膏/cm2)為77.80%。鞣花酸灌胃高劑量組(15mg/kg)治愈率為 88.90%,中劑量(7.5mg/kg)為 77.78%，低劑量(3.75mg/kg)為 66.67%，病理觀察鞣花酸外用與灌胃高、中劑量可明顯改善感染組織皮膚毛囊生長情況，綜上，鞣花酸對豚鼠皮膚紅色毛癬菌感染治療效果顯著。
[0014]體外試驗采用美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的《產孢絲狀真菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感性試驗方案》(M38-A)，以特比萘酚、氟康唑為陽性對照藥，研究了鞣花酸對23株真菌的體外抑真菌活性`，并測定了最低抑菌濃度(MIC)值。鞣花酸對真菌的體外活性結果顯示，鞣花酸對6種皮膚癬菌的MIC值范圍為6.25~50 ii g/ml，而臨床常用抗真菌藥物氟康唑對這6種皮膚癬菌的MIC值范圍也為6.25~50 ii g/ml。由此可見，鞣花酸對臨床常見的淺部致病真菌具有較強的抑制作用，尤其對紅色毛癬菌最為敏感，作用于氟康唑相當。鞣花酸對6種臨床常見念珠菌的MIC值范圍為25~200 u g/ml，而氟康唑對念珠菌的MIC值范圍為12.5~50 ii g/ml，但氟康唑臨床在治療念珠菌感染時周期較長，副作用較大，臨床上有引起肝壞死或肝毒性致死的報道，該類抗生素很易出現耐藥性，天然耐藥菌株不斷增加，因此，鞣花酸的開發對抗真菌藥物臨床前景更顯重要。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為本發明各組豚鼠造模后一般觀察與皮膚鏡檢圖；
[0016]圖2為本發明各組膝鼠治療后光鏡下形態學圖(HE, X 400)圖；
[0017]圖3為本發明各組豚鼠治療后光鏡下形態學圖(PAS，X400)圖。
【具體實施方式】
[0018]實施例[0019]鞣花酸體內外抗真菌作用的實驗研究:
[0020](一)鞣花酸體外抗真菌實驗研究:
[0021]摘要目的:對鞣花酸進行體外抗真菌實驗，測定其最小抑菌濃度(MIC)值。方法:采用美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的《產孢絲狀真菌的液基稀釋抗真菌藥敏試驗參考方案》，即M38-A方案。在此方案的基礎上測定鞣花酸對17株臨床常見皮膚癬菌以及6株念珠菌的MIC值。結果:鞣花酸對皮膚癬菌中不同菌種的MIC值范圍為6.25-100 Ug/ml ;對念珠菌中不同菌種的MIC值范圍為25-200 ii g/ml。結論:鞣花酸體外具有顯著抗真菌作用。
[0022]關鍵詞:鞣花酸；體外抗真菌作用；最小抑菌濃度；
[0023]1.材料與儀器
[0024]1.1實驗菌種:菌種來源:本實驗所采用皮膚癬菌菌株均來自新疆醫科大學真菌與真菌病研究中心菌種保藏庫。念珠菌菌株均由新疆維吾爾自治區中醫院皮膚科檢驗室提供。
[0025]以上共計23株，菌株名稱、來源及編號見附錄A。
[0026]1.2實驗材料:鞣花酸(上海源葉生物科技有限公司，YY13933)。二甲基亞砜(DMSO)(天津永晟精細化工有限公司，20110330)。特比萘芬(TBF)由(上海誠優國際貿易有限公司，20090101)提供。氟康唑氯化鈉注射液(河北天成藥業股份有限公司，B12070605)。馬鈴薯培養基(PDA)(碧 迪醫療器械有限公司，2263097) ；RPM1-1640液基(Invitrogen公司，31800-022)。
[0027]1.3實驗儀器:DM2500顯微鏡(德國LEICA);FM型生化培養箱(上海福瑪實驗設備有限公司)；BHC-1300 II A型生物安全柜(蘇州安泰空氣技術有限公司)；LDZX-75KBS (內循環)立式蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)；BS224S型精密電子天平(德國Sartorious)。
[0028]菌種活化:皮膚癬菌:將來自菌種保藏庫的菌株挑取直徑約3mm菌絲體，以點接種法接種于新制備的馬鈴薯培養基(PDA)試管斜面中央，溫度28°C培養7-14d后進行藥敏實驗。實驗所需菌株:紅色毛癬菌6株，石膏樣毛癬菌6株，紫色毛癬菌I株，許蘭毛癬菌I株，疣狀毛癬菌I株，犬小孢子菌I株，須狀毛癬菌I株。均由新疆醫科大學真菌與真菌病研究中心囷種保減庫提供。
[0029]念珠菌:將來自菌種保藏庫的菌株挑取卜2個菌落，以劃線接種法接種于新制備的馬鈴薯培養基(PDA)試管斜面中央，溫度36°C培養，時間48h后進行藥敏實驗。白色念珠菌I株，光滑念珠菌I株，近平滑念珠菌I株，熱帶念珠菌3株。均由新疆維吾爾自治區中醫院皮膚科檢驗室提供。
[0030]2.實驗方法
[0031]根據NCCLS《產孢絲狀真菌的液基稀釋抗真菌藥敏試驗參考方案》(M38-P)方案在測定鞣花酸對17株臨床常見皮膚癬菌以及6株念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)值。
[0032]2.1抗真菌藥物儲備液、稀釋液的制備
[0033]稱取鞣花酸標準品50.0mg,用ImL DMSO溶解，制成濃度為50000 u g ? mL—1的儲備液，存于溫度_70°C冰箱備用；稱取TBF8mg，用ImL DMSO溶解，制成濃度為8000 u g -m^1的儲備液，存于溫度_70°C冰箱備用。
[0034]臨用前將鞣花酸和TBF儲備液，分別用RPM1-1640培養基倍比稀釋成2倍試驗終濃度，鞣花酸的2倍終濃度由高向低依次為:200、100、50、25、12.5,6.25,3.125、1.5625 u g/ml ；TBF 的 2 倍終濃度由高向低依次為 0.16,0.08,0.04,0.02,0.01,0.005、0.0025,0.000625 u g/ml,氟康唑的2倍終濃度由高向低依次為:200、100、50、25、12.5、
6.25、3.125、1.5625 u g/ml。
[0035]2.2菌接種液的制備:
[0036]皮膚癬菌:將受試的皮膚癬菌接種于馬鈴薯培養基斜面上，溫度28°C培養7-14d，吸取2mL無菌的0.85%的NaCl溶液，輕輕沖洗菌落表面的菌絲和孢子，吸取菌液轉移至無菌試管中，振蕩器上振蕩15s，將含有菌絲和孢子的沖洗液用血細胞計數板記數，將其濃度調至0.4X IO6~5X IO6Cfu ? mL-1之間，用RPM1-1640培養基稀釋50倍至2倍終濃度。
[0037]念珠菌:將受試的念珠菌接種于馬鈴薯培養基斜面上，溫度36°C培養48h,挑取菌落，加入2mL無菌的0.85%的NaCl溶液中，用0.5#McFarland standard比池管比池，用RPM1-1640液基稀釋100倍后再稀釋20倍至2倍終濃度。
[0038]2.3 接種:
[0039]將100 的2倍終濃度的藥液，由第I孔至第10孔分別由高濃度到低濃度加入無菌96孔細胞培養板中；
[0040]第11孔為生長對照孔(僅加菌接種液100 U I和RPM1-1640培養基100 yl);
[0041]第12孔為空白對照孔(只加RPM1-1640培養基200 yl);·[0042]將調好的菌接種液100 iil，分別加入相應的微孔內，這將使每一梯度的抗真菌藥物和菌接種液(2倍終濃度)分別被1:1稀釋到終濃度。
[0043]2.4培養條件和結果判定:
[0044]皮膚癬菌于溫度28°C孵育7-14天讀結果；念珠菌于溫度36°C孵育48小時讀結果。
[0045]讀取MIC值時，應在不攪動的情況下與對照孔按比較，溶液清晰透明視為真菌完全不生長，取完全不生長管最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。
[0046]3.實驗結果:
[0047]表1鞣花酸、氟康唑和TBF對23株真菌的藥物敏感性
【權利要求】
1.一種鞣花酸在制備治療和預防人體真菌感染疾病藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于鞣花酸用藥的純度為50-100%。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于鞣花酸為單一成分入藥或與其它藥物組合入藥。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于鞣花酸入藥的臨床人日使用量為IU g-20g之間。
5.根據權利要 求1所述的應用，其特征在于鞣花酸藥物的給藥方式為內服、外用、注射。
【文檔編號】A61P31/04GK103622955SQ201310660593
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】斯拉甫·艾白, 李治建, 古力娜·達吾提 申請人:新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所