一種粒毛盤菌黑色素作為抗腎衰藥物的用途的制作方法

本發明屬于粒毛盤菌黑色素在藥物制備中的應用技術領域，具體涉及菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌的胞內黑色素(簡稱LIM)作為抗腎衰藥物的用途。

背景技術：

黑色素一般存在動植物和微生物體內，它不僅是一類光保護劑、抗輻射劑、鰲合劑、生物抗氧化劑和免疫促進劑,具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒復制、治療帕金森癥等作用,因此黑色素在醫藥、化妝品、食品等方面有著廣泛的應用前景。如中國《食品科學》(2009,30(17):185-189)、《中國食品添加劑》(2007(2):116-119)及《中國食品學報》(2012,12(10):62-66)分別介紹了粒毛盤菌黑色素、葡萄皮色素以及烏賊墨黑色素作為抗氧化物質的用途。《微生物學通報》(2014,41(2):334-343)介紹了細菌黑色素具有抗紫外輻射、清除自由基等功能，對于生物的生長發育雖非必需，卻能極大提高生物體的生存競爭能力。據《公共科學圖書館》(Public Library of Science)(2013,8(2):181-182)文獻報道，慢性腎功能衰竭與腎組織的氧化應激反應有關。中國專利號ZL201110072469.2公開了本發明人課題組保藏日期2011年3月2日保藏在位于武漢市武昌珞珈山武漢大學生命科學學院的中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)的一種菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌(Lachnum)。該粒毛盤菌屬(Lachnum)隸屬于柔膜菌目(Helotiales)晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)，是一類腐生性真菌，其深層發酵可產生大量的黑色素。目前國內外未見有公開文獻提及將粒毛盤菌黑色素作為制備抗腎衰藥物的應用方面的報道。

目前國內外報道的關于慢性腎衰藥物的研究主要是中藥，未見對粒毛盤菌黑色素作為慢性腎衰治療藥物方面研究的報道。據《現代中西醫結合雜志》(2014,23(2):217-220)報道，近年來慢性腎衰的發病率呈逐年上升趨勢，增長速度加快，趨勢十分嚴峻。挖掘與開發天然、有效的抗腎衰藥物，對預防和治療慢性腎衰具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌的胞內黑色素(簡稱LIM)作為制備抗腎衰藥物的用途。

本發明的粒毛盤菌胞內黑色素(簡稱LIM)在制備抗腎衰藥物中的用途，其 特征在于：所述粒毛盤菌胞內黑色素，是將菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌接種于100L發酵罐，培養基成分為：酪氨酸濃度為1.0mmol/L，銅離子濃度為1.1mmol/L，葡萄糖質量為25.0g/L，酵母膏5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH 8.0，培養溫度為27℃，裝料系數體積比為0.7，接種量為5％(v/v)，通氣量為1.0L/min，攪拌轉速為180r/min，發酵12d后獲得發酵液；將發酵液抽濾，收集菌絲體，50℃烘干，按菌絲體的質量(g)與濃度為1mol/L的氫氧化鈉(mL)比為1:100混勻，室溫靜置12h，抽濾得浸提液；向上述浸提液加入1mol/LHCl調節pH為1～2，靜置12h后將上述懸浮液離心，所得到的沉淀經去離子水洗滌至pH為7后，真空冷凍干燥，即得黑色素粗品；再將該黑色素粗品加入7mol/L HCl于100℃酸解2h，除去與黑色素結合的蛋白質及碳水化合物，酸解后抽濾得到的沉淀經雙蒸水洗滌至上清液pH值為7時重新溶于1mol/L NH₃·H₂O溶液，采用旋轉蒸發儀蒸去NH₃至溶液pH為中性后，依次經乙酸乙酯、氯仿、無水乙醇萃取，除去脂類物質，萃取后旋轉蒸發除去有機相，水相調pH值為2，以4500r/min離心15min，分離得到的沉淀經去離子水反復洗滌至上清液Cl–定性檢測為陰性后，真空冷凍干燥，得到粒毛盤菌胞內黑色素LIM；通過將其對腺嘌呤誘導的慢性腎衰小鼠的藥理實驗，確立粒毛盤菌胞內黑色素LIM具有抗慢性腎衰作用；從而按藥劑學的常規制備方法，將有效量的該粒毛盤菌胞內黑色素LIM與藥用輔料混合加工制備成口服片劑或膠囊服用。

本發明的有益效果體現在：經藥效學證明，該粒毛盤菌胞內黑色素LIM可顯著降低腎衰小鼠血清肌酐(SCR)、尿素氮水平(BUN)，增加血清總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量，提高腎組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)的水平，降低丙二醛(MDA)含量以及降低炎性因子：腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)的表達以及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)水平，改善腎衰患者腎組織形態的病理改變，且呈一定的量效關系。粒毛盤菌胞內黑色素LIM表現出明顯的抗腎衰功能，且無毒副作用，因此可以用于制備抗腎衰藥物。可根據需要按藥劑學的常規制備方法，制成各類劑型，服用方便。

附圖說明

圖1為小鼠腎臟組織病理學檢查照片(400×)。

具體實施方式

實施例1：

(一)粒毛盤菌胞內黑色素(LIM)的制備

將菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌接種于100L發酵罐，培養基成分為：酪氨酸濃度為1.0mmol/L，銅離子濃度為1.1mmol/L，葡萄糖質量為25.0g/L，酵母膏5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，pH 8.0，培養溫度為27℃，裝料系數體積比為0.7，接種量為5％(v/v)，通氣量為1.0L/min，攪拌轉速為180r/min，發酵12d后獲得發酵液；將發酵液抽濾，收集菌絲體，50℃烘干，按菌絲體的質量(g)與濃度為1mol/L的氫氧化鈉(mL)比為1:100混勻，室溫靜置12h，抽濾得浸提液；向上述浸提液加入1mol/LHCl調節pH為1～2，靜置12h后將上述懸浮液離心，所得到的沉淀經去離子水洗滌至pH為7后，真空冷凍干燥，即得黑色素粗品；再將該黑色素粗品加入7mol/L HCl后于100℃酸解2h，除去與黑色素結合的蛋白質及碳水化合物。酸解后，抽濾得沉淀，沉淀經雙蒸水洗滌至上清液pH值為7時重新溶于1mol/L NH₃·H₂O溶液，采用旋轉蒸發儀蒸去NH₃至溶液pH為中性后，依次經乙酸乙酯、氯仿、無水乙醇萃取，以除去脂類物質，萃取后旋轉蒸發除去有機相，水相調pH值為2，以4500r/min離心15min，分離得到的沉淀經去離子水反復洗滌至上清液Cl–定性檢測為陰性后，真空冷凍干燥，即得到粒毛盤菌胞內黑色素LIM。

(二)粒毛盤菌胞內黑色素LIM的抗腎衰作用藥理實驗

動物：昆明小鼠100只，體重20±2g，生長環境：溫度23±2℃，濕度55±5％，12h的光照和12h的黑暗交替飼養。

試劑盒：血肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，為南京建成科技有限公司產品。

陽性藥物：海昆腎喜膠囊(HC)，為輝南長龍生化藥業股份有限公司產品。

方法：把100只昆明小鼠適應性喂養7d后，隨機取10只正常小鼠設為正常組，生理鹽水灌胃10mL/Kg，其余小鼠給予每公斤飼料含10克腺嘌呤的膳食，連續3個星期，檢測小鼠SCR和BUN含量。小鼠SCR含量高于115mM/L和BUN含量高于8.05mM/L時表示慢性腎衰動物模型建立成功。取建模成功小鼠隨 機分為6組，每組10只，分別為：模型組(生理鹽水10mL/kg)、陽性組(150mg/Kg)、LIM低劑量組(100mg/Kg)、LIM高劑量組(200mg/kg)，LIM+海昆腎喜膠囊低劑量組(100mg/Kg)、LIM+海昆腎喜膠囊高劑量組(200mg/Kg)，連續給藥28天。

灌胃結束后，摘眼球取血，3000rpm離心5min取血清，脫頸椎處死，取雙側腎臟，準確稱取小鼠腎組織重量，按重量(g):體積(mL)＝1:10的比例加入勻漿介質(0.9％的生理鹽水)，冰水浴條件下機械勻漿，3000r·min^-1離心10min，取上清得10％組織勻漿液，分別測定勻漿液中SOD、GSH-PX、CAT、GSH和MDA的含量。按照試劑盒說明書方法檢測。另取單側腎臟，置10％福爾馬林溶液中固定，O.C.T.包埋劑包埋、切片，蘇木精和伊紅染色，光學顯微鏡下觀察拍照。

利用試劑盒測定血清中生化指標以及腎組織勻漿中氧化酶及炎性因子活性，包括BUN、SCR、TP、ALB、SOD、GSH、GSH-PX、MDA、CAT、TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS，按試劑盒說明書方法檢測。

(三)結果

(1)LIM對小鼠血液生化指標的影響

與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清SCR和BUN的水平顯著升高，如前所述,表明慢性腎衰小鼠實驗模型建立成功。相比于模型對照組，治療組SCR和BUN水平不同程度降低。此外，在相同劑量下，海昆腎喜膠囊與LIM聯合組小鼠的SCR和BUN含量顯著高于LIM和海昆腎喜膠囊單獨治療組。

與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清中TP和ALB水平顯著降低，相比于模型對照組，治療組小鼠的TP和ALB水平均有不同程度增加。海昆腎喜膠囊和LIM聯合組小鼠的TP和ALB水平均高于LIM和海昆腎喜膠囊單獨組，相同劑量下，海昆腎喜膠囊與LIM聯合組小鼠的TP和ALB水平接近于正常小鼠。所有的結果都呈劑量依賴關系。

表1 LIM對小鼠血液生化指標的影響

注：與模型組相比，^ap<0.05，^bp<0.01。

(2)LIM對慢性腎衰小鼠體重的增長速度和腎臟指數的影響

正常對照組小鼠體重的增長速度權重增加了57.34％，模型對照組小鼠的增長速度遞增32.42％，這是增加最少的，相對于其他分組。這表明慢性腎衰小鼠模型已成功建立。然而，相對于正常對照組時，其他組小鼠體重的增長速度沒有表現出明顯的差異。相比于模型對照組，LIM單獨治療小鼠的體重增長速度明顯提高。LIM與陽性藥物聯合治療組的體重增長率幾乎與正常對照組相同，這可能是由于LIM增強了陽性藥物的治療效果。

與正常對照組相比，模型對照組腎臟指數均顯著增加，與模型對照組相比，治療組的腎臟指數均顯著減少，這證實了LIM對慢性腎衰有保護作用。而且，不同劑量的LIM單獨治療組和LIM與海昆腎喜膠囊聯合治療組處理的小鼠的腎臟指數呈劑量依賴性增加。此外，我們發現，LIM與陽性藥物聯合治療組的腎臟指數明顯低于LIM和陽性藥物單獨治療組。

表2 LIM對慢性腎衰小鼠體重的增長速度和腎臟指數的影響

注：與模型組相比，^ap<0.05，^bp<0.01。

(3)LIM對慢性腎衰小鼠腎組織勻漿氧化指標的影響

實驗研究發現腎臟疾病與生物體內氧化應激反應和活性氧的產生密切相關。SOD、GSH-PX、CAT、和GSH能清除自由基、抑制自由基脂質過氧化反應以及降低脂質過氧化水平，緩解小鼠慢性腎衰竭進程。MDA含量高低可間接反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。在小鼠腎組織勻漿中，與模型組相比，低、高劑量的LIM組小鼠的SOD、 GSH-PX、CAT和GSH含量均顯著增加，MDA含量明顯降低，同劑量的LIM與海昆腎喜膠囊聯合治療組小鼠的SOD、GSH-PX、CAT和GSH含量明顯高于LIM和海昆腎喜膠囊單獨治療組，而MDA含量低于LIM和海昆腎喜膠囊單獨治療組，表明LIM能顯著提高小鼠腎組織勻漿中的SOD、GSH-PX、CAT和GSH含量，降低MDA含量，且可增強海昆腎喜膠囊對慢性腎衰的治療效果。

表3 LIM對慢性腎衰小鼠腎組織勻漿氧化指標的影響

注：與模型組相比，^ap<0.05，^bp<0.01。

(4)LIM對慢性腎衰小鼠腎組織勻漿炎性因子水平的影響

與正常對照組相比，模型對照組小鼠腎組織勻漿的TNF-α，IL-1β，IL-6的水平以及iNOS活動顯著增加。與模型對照組相比，LIM及海昆腎喜膠囊治療組TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的活性均顯著降低，高劑量的LIM和海昆腎喜膠囊聯合治療組的治療效果明顯優于海昆腎喜膠囊和LIM單獨治療組，且都呈劑量依賴的關系，說明LIM具有緩解炎癥反應的生物活性。

表4 LIM對慢性腎衰小鼠腎組織勻漿炎性因子水平的影響

注：與模型組相比，^ap<0.05，^bp<0.01。

(5)小鼠腎臟組織病理學觀察

圖1為各組實驗小鼠腎臟組織病理學檢查照片(400×)。觀察圖1發現；正常組小鼠腎小球和腎小管的排列緊湊，無變性壞死。模型組小鼠腎臟組織中有大量氣泡，幾乎沒有正常的腎小球和腎小管。低、高劑量的LIM組小鼠腎臟組織中均可見到少量完整的腎小球和腎小管。低、高劑量的LIM和海昆腎喜膠囊聯合治療組小鼠腎臟組織中完整的腎小球和腎小管數目比同劑量的LIM和海昆腎喜膠囊單獨治療組多，且高劑量的LIM和海昆腎喜膠囊聯合治療組小鼠腎臟組織腎小管腫脹及官腔擴張程度最小，間質炎細胞的浸潤程度較輕。顯然，LIM能改善腎臟病理組織狀態，且能加強海昆腎喜膠囊腎臟組織的改善效果。

藥效學證明，菌種保藏編號為CCTCC No:M 2011054的粒毛盤菌所產生的胞內黑色素LIM可顯著降低小鼠的血清SCR、BUN、水平，升高TP和ALB含量，且呈一定的量效關系；且可提高其血清中SOD活性，降低MDA含量，減少炎性因子TNF-α等水平。表現出明顯的抗腎衰功能，因此它能用于制備抗腎衰藥物。粒毛盤菌胞內黑色素LIM幾乎無毒副作用，可根據需要制成各類劑型，服用方便。

(四)粒毛盤菌胞內黑色素LIM制劑的加工

1、片劑加工

取500g粒毛盤菌胞內黑色素LIM、稀釋劑糊精240g、助流劑滑石粉50g，混合均勻后加400mL乙醇混合均勻制得軟材，軟材過篩得到濕顆粒，干燥后整粒，最后加入潤滑劑硬脂酸鎂10g混勻后壓片，制成1000片，片重0.8g，黑色素含量0.5g/片。

2、膠囊劑加工

取稀釋劑干淀粉250g，助流劑滑石粉45g，潤濕劑十二烷基硫酸鈉5g混合均勻與500g粒毛盤菌胞內黑色素LIM混合均勻后裝1^#空心膠囊1000粒，黑色素含量0.5g/粒。加400mL乙醇混合均勻制得軟材，軟材過篩得到濕顆粒，干燥后整粒，最后加入潤滑劑硬脂酸鎂10g混勻后壓片，制成1000片，片重0.8g，黑色素含量0.5g/片。