專利名稱：一個能誘導植物抗病性的大豆疫霉基因PsIR1的應用的制作方法
一個能誘導植物抗病性的大豆疫霉基因PsIRI的應用技術領域
本發明屬于生物技術領域，公開了一個能誘導植物抗病性的大豆疫霉基因PsIRl 的應用。
背景技術：
隨著世界人口的急劇增長，可耕地面積的減少，世界糧食問題變得日趨嚴重，在有限的土地資源上耕作出更多的糧食，是解決人類生存的頭等大事。育種學家們不僅要提高作物的產量，還要減少作物的損失，其中植物病害一直是阻礙優良品種增產的最大瓶頸，因此，培育高產抗病的作物品質是近年來育種學家們追求的方向。常規的育種方法費時費力， 而隨著生物學的發展，利用基因工程的方法來培育的品種，不僅能縮短育種時間，而且可以讓多個優良的性狀集中到一個品種上，是目前育種領域的應用熱點。植物抗病基因工程是指采用遺傳轉化技術，將外緣的基因導入受體植株，從而獲得抗病的轉基因植物的方法。一般用于導入受體植物的外緣基因包括植物的抗病基因(即R基因)，病原菌無毒基因和抗病基因共轉形成的“雙組分系統”，植物的防衛反應基因以及一些生物的抗菌蛋白基因。通過將這些基因構建到合適的載體上，構成適于轉化的重組質粒，用不同的轉化方法向具有優良品質的受體植物中導入重組質粒，利用合適的抗性篩選并鑒定出轉基因植株，通過抗病性鑒定，從而獲得高抗優質的品種。生物體內基因眾多，例如人類基因組預測有3萬個基因以上，大豆疫霉接近2萬個基因，大多數基因的功能未知，而生物的生長、發育、遺傳、變異乃至生理平衡，無不與基因的表達和調控密切相關，因此，克隆并研究基因的功能對于基因工程來說是研究基礎。
本專利所涉及到的基因是一類由病原菌分泌，在侵染過程中可進入植物細胞并引起植物生理生化活性改變的蛋白。已經在細菌中發現大量的這種效應蛋白，而近年來隨著基因組的測序，卵菌中也發現大量的效應蛋白，除了大家廣為熟悉的RXLR效應蛋白外，還有一類具有保守FLAK序列元件的CRN效應蛋白。迄今為止，將CRN蛋白導入受體植物并能提高植物抗性未見報道。發明內容
為了克服常規育種費時費力、不能具有持久廣譜抗性的缺點，本發明提供一個大豆疫霉效應因子I3SlRl做為育種的候選材料，該蛋白可以誘導植物PRl基因的高度表達，引起煙草的抗病性。該基因將為植物抗病基因工程提供具有應用潛力的功能基因，進一步可為生產上提供一種具有持久抗病潛力的育種材料。
本發明的目的可通過如下技術方案實現
一種大豆疫霉PsIRl基因在構建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉基因植物中的應用，該大豆疫霉I3SlRl基因序列為GenBank :HQ231784. 1。
其中，所述的轉基因植物為轉大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
含有大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的重組表達載體在構建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉基因植物中的應用。
其中，所述的轉基因植物為轉大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。所述的重組表達載體的出發載體為PVX載體。
一種大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)在構建具有煙草疫霉抗性的轉基因植物中的應用。
所述的轉基因植物為轉大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
含有大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的重組表達載體在構建具有煙草疫霉抗性的轉基因植物中的應用。
所述的轉基因植物為轉大豆疫霉I3SlRl基因(GenBank :HQ231784. 1)的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。所述的重組表達載體的出發載體為PVX載體。
有益效果
本發明與現有的育種材料相比，其優點和積極效果表現在
1.可大大的增強植物抗性。卵菌是具有巨大破壞力的病原菌，自然條件下抗源材料較少。煙草疫霉侵染速度非常快，在發明中，提前在煙草上表達I3S^l (GenBank HQ231784. 1)后接種煙草疫霉，可讓煙草疫霉的侵染速度減緩25%以上。
2. PsIRl (GenBank :HQ231784. 1)能夠誘導PRl和PR2基因高表達，可為生產上提供具有持久抗性的育種材料。PRl和PR2基因是水楊酸通路的基因，而水楊酸的增加可提高植物的廣譜抗性，因此，雖然PsIRl是大豆疫霉的基因，但是在植物上瞬時表達后，能引起 PRl基因的高表達，這表明PsIRl可誘導水楊酸的積累，因而可增強煙草的抗病性。
圖IPsIRl可抑制煙草疫霉的侵染
A.葉片左邊及右邊均表達GFP后接種煙草疫霉菌的病斑酒精脫色后表型B.葉片左邊表達GFP，右邊表達I^sIRl后接種煙草疫霉菌的病斑酒精脫色后表型C.圖A和圖B中葉片右邊與左邊病斑直徑比值。*代表在的水平上差異顯著。
圖2PsIRl可引起水楊酸通路防衛反應基因PRl和PR2的高表達
A. PsIRl和GFP分別在煙草上表達5天后，檢測SA通路PRl基因相對于0天的表達量，設定Od的表達量為10，比值取IoglO ；
B. PsIRl和GFP分別在煙草上表達5天后，檢測SA通路PR2基因相對于0天的表達量，設定Od的表達量為10，比值取IoglO具體實施方式
實施例IPsIRl可抑制煙草疫霉的侵染
1.載體構建
根據 Liu, et al, Two host cytoplasmic effectors are required for pathogenesis of Phytophthora sojae by suppression ο f host defenses. Plant physiology, 2011,155,1 :490-501 文章中構建方法獲得 PVX:PsIRl 和 PVX:GFP 質粒。
2.農桿菌介導的瞬時表達
將PVX:PsIRl和PVX:GFP質粒通過電轉化技術轉入GV3101農桿菌(Biovector) 菌株中，將農桿菌的陽性轉化子于3ml添加kanamycin (50 μ g/ml)的LB培養液中，220rpm,培養48h，4000rpm離心％iin，收集菌體，用IOmM MgCl2重懸，重復三次后，用IOmM MgCl2定容至0D600 = 0. 4-0. 6。取生長6_8周的煙草，從上數第三至第六片完全展開的真葉被用于滲透接種農桿菌。用針頭在煙草下表皮造成一小傷口，用ImL無針頭的注射器將 30-50 μ 1農桿菌懸液滲透到本氏煙葉片中。
3.煙草疫霉接種和病斑長度測量
農桿菌表達5天后取下注射的煙草葉片，放在培養皿里面濾紙保濕，然后用培養 3-5天煙草疫霉菌絲塊接種處理過的煙草葉片，隨時觀察和記錄煙草葉片的表型變化，2天后，用酒精脫色后測量病斑直徑。與對照相比GFP相比，PsIRl可以顯著限制煙草疫霉的侵染，至少可使煙草疫霉的侵染速度減緩25%以上(圖1)。
實施例2PsIRl引起水楊酸通路防衛反應基因的高表達
將實施例1中獲得的PVX:PSIR1和PVX:GFP按照實施例1的方法在煙草上瞬時表達，分別在表達Od和5d時取樣，按照Total RNA Purification System試劑盒(Invitrogen)提供的ftOtocal進行。熒光定量PCR操作按照ABI 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA)軟件和指南進行。PCR 反應液使用 Real time PCR 試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM, TaKaRa, DaLian, China)來進行反應。以瞬時表達煙草葉片所提取的RNA進行逆轉錄，將獲得的cDNA為模板進行相對定量PCR擴增。 M 50ng 的 cDNA 禾口 0. 2 μ M 弓| 物，0. 4ul ROX Reference Dye 及 IOul SYBR Premix Ex TaqTM混合于20 μ 1的PCR反應體系中。PCR程序為95°C 30秒預變性，40個循環PCR反應(95°C 5秒，65°C 31秒)，引物的特異性通過融解曲線和電泳來判斷。本研究中所用到的引物見表1。
與Od未處理的煙草葉片相比，PsIRl可顯著提高SA通路基因ra2b和PRb-Ib基因的表達，分別引起ra2b和PRb-Ib的表達量提高約10000和20000倍，而GFP對照僅提高分別為1000倍和100多倍(圖2)。由此可見，PsIRl可以顯著引起SA通路防衛反應基因的表達。
表1本研究中所用到的熒光定量引物
權利要求
1.一種大豆疫霉I3SlRl基因GenBank :HQ231784. 1在構建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉基因植物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述的轉基因植物為轉大豆疫霉I3sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
3.含有大豆疫霉I^sIRl基因GenBank:HQ231784. 1的重組表達載體在構建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉基因植物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的轉基因植物為轉大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述的重組表達載體的出發載體為PVX載體。
6.一種大豆疫霉I3SlRl基因GenBank :HQ231784. 1在構建具有煙草疫霉抗性的轉基因植物中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述的轉基因植物為轉大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
8.含有大豆疫霉I^sIRl基因GenBank:HQ231784. 1的重組表達載體在構建具有煙草疫霉抗性的轉基因植物中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述的轉基因植物為轉大豆疫霉I^sIRl基因GenBank :HQ231784. 1的煙草，大豆，水稻，小麥或玉米。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述的重組表達載體的出發載體為PVX載體。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，公開了一個能誘導植物抗病性的大豆疫霉基因PsIR1的應用。一種大豆疫霉PsIR1基因(GenBankHQ231784.1)在構建具有抗植物病原菌的廣譜抗性的轉基因植物中的應用。本發明將大豆疫霉基因PsIR1插入PVX表達載體，并通過農桿菌介導的瞬時表達在煙草上對PsIR1的功能進行了分析。結果發現PsIR1可顯著提高煙草對疫霉的抗性，并且PsIR1可誘導水楊酸通路防衛反應基因PR1和PR2的高表達。因此，可認為PsIR1可引起了水楊酸的積累，而水楊酸的增加可提高植物的廣譜抗性，可見PsIR1可增強煙草的抗病性。
文檔編號C12N15/84GK102533852SQ20121004345
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月24日 優先權日2012年2月24日
發明者劉廷利, 劉沛菡, 劉莉, 竇道龍, 茹艷艷 申請人:南京農業大學