人7型腺病毒的中和性單克隆抗體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備人7型腺病毒的中和性單克隆抗體的方法，將人3型腺病毒載體的六鄰體第5高變區替換為所述人7型腺病毒的六鄰體第5高變區基因，構建成嵌合病毒，將所述嵌合病毒作為所述免疫原。還提供了一種利用上述方法制備得到的鼠源人7型腺病毒中和性單克隆抗體和雜交瘤細胞株5MH5/3G5。還提供了利用上述方法制備得到的人源化和嵌合的單克隆抗體，以及一種藥物組合物，包含上述人源化或人-鼠嵌合的單克隆抗體作為有效成分。本發明將外源中和表位嵌入3型腺病毒載體的高變區內，構建成展示外源中和表位的重組腺病毒，并以此為免疫原，能有效的展示外源中和表位，并增強免疫應答效應，對研制感染性疾病治療性單抗具有重要意義。
【專利說明】人7型腺病毒的中和性單克隆抗體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于單克隆抗體制備【技術領域】，具體涉及人7型腺病毒的中和性單克隆抗 體及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 應用表位肽免疫來制備單克隆抗體，特別是治療性單克隆抗體，是很有吸引力的 途徑。表位肽代表著蛋白質抗原最小的免疫原性單位。因此表位肽免疫能使免疫反應精確 定位，能很好的控制產生所需的免疫應答。然而，應用表位肽免疫來制備單克隆抗體通常陽 性率很低。因為簡單肽通常免疫原性差，不能呈現良好的空間構象，而且不能有效激活T細 胞和免疫記憶細胞。正因為如此，很多改善表位肽免疫原性的方法被開發出來，例如聯合合 適佐劑應用、偶聯脂肽應用、直接呈遞至樹突狀細胞和應用微粒呈遞系統。然而，由于應用 的成分過于單一、未能從根本上改善抗原的免疫原性等原因，這些方法呈遞或展示表位肽 的效果差強人意，應用十分有限。
[0003] 治療性單克隆抗體是對抗感染性疾病的非常有希望的生物藥物。我們知道，有些 病毒不能在細胞系中培養或者在體外培養的產量很低。因此，用病原體顆粒免疫從而制備 針對這些病原體的中和單抗十分困難。基于表位肽的免疫方法是解決這一問題的一個方 法，但是很多病原體的中和表位是構象表位，而簡單的肽和應用上述方法呈遞或展示的肽 均難以呈現出空間構象。因此，仍需要開發出更有效的表位呈遞或展示系統，以增強免疫應 答，提高感染性疾病中和性單克隆抗體制備的陽性率。
【發明內容】
[0004] 為克服上述技術缺陷，本發明提供了一種人7型腺病毒中和性單克隆抗體及其制 備方法和應用，該人3型腺病毒抗原表位展示載體系統能有效的展示外源表位，并增強免 疫應答效應。
[0005] 本發明目的之一是提供一種制備針對人7型腺病毒的中和性單克隆抗體的方法， 所述方法包括如下步驟：
[0006] 構建免疫原：將人3型腺病毒載體的六鄰體第5高變區替換為所述人7型腺病毒 的六鄰體第5高變區基因，構建成嵌合病毒，將所述嵌合病毒作為所述免疫原。
[0007] 所述人7型腺病毒的六鄰體第5高變區的氨基酸序列如SEQ NO: 1所示序列，所述 氨基酸序列位于所述人7型腺病毒的六鄰體的第255位到269位。
[0008] 所述人3型腺病毒載體為E3區缺失并表達有增強型綠色熒光蛋白的人3型腺病 毒載體。
[0009] 所述人3型腺病毒載體的六鄰體第5高變區的氨基酸序列如SEQ N0:2所示序列， 所述氨基酸序列位于所述人3型腺病毒載體的六鄰體的第264位到279位。
[0010] 本發明的目的之二是提供了一種利用上述方法制備得到的鼠源的針對人7型腺 病毒的中和性單克隆抗體。 toon] 本發明的目的之三是提供了一種分泌上述鼠源單克隆抗體的雜交瘤細胞 株5MH5/3G5,所述雜交瘤細胞株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO. C2014104。
[0012] 本發明的目的之四是提供了一種利用上述方法制備得到的人源化的針對人7型 腺病毒的中和性單克隆抗體抗體。
[0013] 本發明的目的之五是提供了一種上述方法制備得到的針對人7型腺病毒的中和 性人-鼠嵌合單克隆抗體。
[0014] 本發明的目的之六是提供了一種藥物組合物，包含上述人源化或人-鼠嵌合的單 克隆抗體作為有效成分。
[0015] 本發明將人7型腺病毒六鄰體第5高變區（HAdv7HVR5)嵌入六鄰體第5高變區缺 失的人3型腺病毒載體，構建成嵌合病毒rAdMHE3 ;然后以嵌合病毒rAdMHE3為免疫原，免 疫小鼠，利用雜交瘤技術，首次成功制備了針對7型腺病毒六鄰體第5高變區（HAdv7HVR5) 的HAdv7中和性單抗。本發明將外源中和表位嵌入3型腺病毒載體的高變區內，構建成展 示外源中和表位的重組腺病毒，并以此為免疫原，制備針對外源表位的中和性單克隆抗體 是可行的，能有效的展示外源中和表位，并增強免疫應答效應，對研制感染性疾病治療性單 克隆抗體具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1是熒光顯微鏡下觀察3型腺病毒載體Ad3EGFP在HEp-2細胞中eGFP表達，圖 1A是pBRAd Λ E3GFP線性化片段轉染HEp-2細胞后24小時（100X)的圖像；圖1B是重組 腺病毒rAd_E3GFP感染HEp-2細胞后48小時（100X)的圖像；
[0017] 圖2是嵌合體病毒構建示意圖；
[0018] 圖3是嵌合體病毒的復制特性檢測結果圖；
[0019] 圖 4 是構建的嵌合病毒 rAdH7Rl、rAdH7R2、rAdH7R5(即 rAdH7R3)和 rAdH7R7(rAdH7R4)分別與3型腺病毒抗血清中和實驗，檢測中和滴度的實驗結果圖；
[0020] 圖5是用重組病毒rAdMHE3免疫小鼠后獲得的抗血清在體外與7型腺病毒進行中 和實驗的結果圖；
[0021] 圖6是間接ELISA法篩選針對免疫原rAdMHE3的陽性單抗的結果圖；
[0022] 圖7為腺病毒結合實驗結果圖；
[0023] 圖8為四株中和性單抗與人7型腺病毒HVR5被替換和未被替換的人7型腺病毒 與單抗的反應的活性測定實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0024] 為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規實驗方法進行。
[0025] 本說明書實施例中所述病毒株、細胞系和實驗動物術語及相關說明如下：
[0026] HAdv7 :人7型腺病毒。
[0027] HAdv3 :人3型腺病毒。
[0028] _:六鄰體高變區。
[0029] HVR5 :六鄰體第5高變區。
[0030] HAdv7GZ08 (GenBank登錄號：GQ478341)分離自急性呼吸道感染幼兒的鼻咽拭子， HEp-2細胞分離培養。
[0031] HAdv3GZ01 (GenBank登錄號：DQ099432)分離自急性呼吸道感染幼兒的鼻咽拭子， HEp-2細胞分離培養。
[0032] Ad3EGFP :用作3型腺病毒載體。本發明所構建的基于人HAdv3E3區缺失
[0033] 并表達有增強
[0034] 型綠色熒光蛋白的腺病毒載體，能表達HAdv3基因組和增強型綠色熒光蛋白的重 組腺病毒。
[0035] rAdMHE3 :用作免疫原。將Ad3EGFP的六鄰體高變區5 (HVR5)
[0036] (264FDGRDAVAGALAPEIV279)
[0037] 替換成 HAdv7 的 HVR5 (255FDGREAADAFSPEIV269)，成功拯救出的重組病毒 rAdMHE3。
[0038] rAdH7Rl、rAdH7R2、rAdH7R5 和 rAdH7R7 :做鑒定用。將 rAd3egf/H7 相應的 HVR基因 替換成HAdv3的HVR基因產生的嵌合病毒，其六鄰體只有一個HVR區（分別是HVRUHVR2、 HVR5、HVR7)為HAdv3序列，其余部分為7型腺病毒六鄰體的序列。rAd3egf/H7(Ad3/H7)是 將Ad3EGFP的六鄰體基因替換成HAdv7GZ08的六鄰體基因產生的嵌合體病毒。
[0039] HEd-2和AD293細朐：購自牛物咨源中心(ATCC)，用于培養上述腺病毒。
[0040] 細朐培養#用的培養某:含有100叨/1111盤尼西林，100叨/1111鏈霉素和10%胎牛 血清的DMEM培養基（Gibco, USA)。
[0041] BALB/c小鼠 :購自中山大學實驗動物中心，并在無特定病原體條件下飼養。
[0042] 腺病毒純化：采用標準的氯化銫梯度離心方法，純化后病毒粒子的含量桉每 260nm下的一個吸光值含有1. IX 1012個病毒粒子（VPs)計算。
[0043] 本發明應用基于人HAdv3、E3區缺失并表達有增強型綠色熒光蛋白的 重組腺病毒載體，命名為Ad3EGFP。并將Ad3EGFP的六鄰體第5高變區（HVR5) (264FDGRDAVAGALAPEIV279)替換成 HAdv7 的 HVR5 (255FDGREAADAFSPEIV269)，成功構建出 重組病毒，命名為rAdMHE3。用體外細胞培養擴增后氯化銫梯度離心純化的rAdMHE3病毒粒 子免疫BALB/c小鼠產生的血清對HAdv7有中和作用；隨后的研究也證實，HAdv7的主要的 血清型特異性中和表位位于HVR5。因此，本發明用體外細胞培養擴增后氯化銫梯度離心純 化的rAdMHE3病毒粒子免疫BALB/c小鼠，以期用雜交瘤技術制備出HAdv7中和性抗體，并 進行鑒定。
[0044] 實施例1 :3型腺病毒載體Ad3EGFP的構建
[0045] 本發明所構建的基于人HAdv3E3區缺失并表達有增強型綠色熒光蛋白的腺病 毒載體，能表達HAdv3基因組和增強型綠色熒光蛋白的重組腺病毒。具體構建步驟為： HAdv3GZ01病毒株在HEp-2細胞培養后，提取病毒基因組，與穿梭質粒pBRALR在BJ5183 細菌內同源重組，獲得帶HAdv3GZ01病毒全基因組的質粒pBRAdV ;RsrII酶切線性化質 粒pBRAdV后與穿梭質粒pSKE3LCMVeGFP-SV40R在BJ5183細菌內同源重組，獲得插入 EGFP基因表達框的重組質粒pBRAd Λ E3GFP，該質粒轉染細胞后拯救得到重組腺病毒 rAd Λ E3GFP。
[0046] 實驗結果見圖1，圖1是熒光顯微鏡下觀察Ad3EGFP在HEp-2細胞中eGFP的表達， 其中圖1A是pBRAdAE3GFP線性化片段轉染HEp-2細胞后24小時（100X)的圖像，圖1B 是重組腺病毒rAd_E3GFP感染HEp-2細胞后48小時（100X)的圖像。結果證明3型腺病 毒載體Ad3EGFP構建成功。
[0047] 實施例2 :免疫原rAdMHE3的構建
[0048] 將 Ad3EGFP 的六鄰體高變區 5 (HVR5) (264FDGRDAVAGALAPEIV279)(人 3 型腺病毒載體 的六鄰體第5高變區的氨基酸序列如SEQ N0:2所示序列，所述序列位于所述人3型腺病毒 載體的六鄰體的第264位到279位）替換成HAdv7的HVR5 (255FDGREAADAFSPEIV269)(人7型 腺病毒的六鄰體第5高變區的氨基酸序列如SEQN0:1所示序列，所述序列位于所述人7型 腺病毒的六鄰體的第255位到269位），搭橋PCR擴增HVR5區突變的人3型細胞六鄰體基 因，酶切連接至穿梭載體PBRLR，與載體pBRAd Λ E3GFP在BJ5183細菌內同源重組獲得六鄰 體突變的重組腺病毒質粒pBRAd-MHE3,轉染293細胞后拯救重組病毒rAdMHE3。
[0049] 圖2是嵌合體病毒構建示意圖。通過定量PCR測定病毒基因組拷貝數分析病毒復 制特性。結果見圖3,圖3是嵌合體病毒的復制特性檢測結果圖，結果表明，rAdMHE3的基因 組復制未受表位置換的影響。
[0050] 實施例3 :鑒定用嵌合病毒rAdH7Rl、rAdH7R2、rAdH7R5和rAdH7R7的構建
[0051] 首先構建rAd3egf/H7(Ad3/H7)嵌合體病毒，rAd3egf/H7(Ad3/H7)嵌合體病毒是 將Ad3EGFP的六鄰體基因替換成HAdv7GZ08的六鄰體基因產生的嵌合體病毒。構建方法： PCR擴增HAdv7GZ08病毒株的六鄰體片段，連接至穿梭質粒pBRALR上，與pBRAd Λ E3GFP骨 架質粒在BJ5183內同源重組，獲得重組質粒pAd3egf/H7,轉染293細胞后拯救得到重組病 毒rAd3egf/H7。對病毒免疫小鼠進行中和抗體滴度實驗，實驗結果見表1，表1是對腺病毒 免疫小鼠進行中和抗體滴度實驗的結果表。由表1數據可見，該病毒粒子中六鄰體為7型 腺病毒的六鄰體蛋白，而病毒穩定性等特性沒有改變。
[0052] 表 1
[0053]
【權利要求】
1. 一種制備針對人7型腺病毒的中和性單克隆抗體的方法，其特征在于，所述方法包 括如下步驟： 構建免疫原：將人3型腺病毒載體的六鄰體第5高變區替換為所述人7型腺病毒的六 鄰體第5高變區基因，構建成嵌合病毒，將所述嵌合病毒作為所述免疫原。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人7型腺病毒的六鄰體第5高變區 的氨基酸序列如SEQ NO: 1所示序列，所述氨基酸序列位于所述人7型腺病毒的六鄰體的第 255位到269位。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人3型腺病毒載體為E3區缺失并表 達有增強型綠色熒光蛋白的人3型腺病毒載體。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人3型腺病毒載體的六鄰體第5高變 區的氨基酸序列如SEQ NO: 2所示序列，所述氨基酸序列位于所述人3型腺病毒載體的六鄰 體的第264位到279位。
5. -種利用權利要求1-4之一所述的方法制備得到的鼠源的針對人7型腺病毒的中和 性單克隆抗體。
6. -種分泌權利要求5所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞株5MH5/3G5,其特征在于，所 述雜交瘤細胞株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO. C2014104。
7. -種利用權利要求1-4之一所述的方法制備得到的人源化的針對人7型腺病毒的中 和性單克隆抗體抗體。
8. -種利用權利要求1-4之一所述的方法制備得到的針對人7型腺病毒的中和性 人-鼠嵌合單克隆抗體。
9. 一種藥物組合物，其特征在于，包含權利要求7或8所述的單克隆抗體作為有效成 分。
【文檔編號】A61P31/20GK104086650SQ201410267112
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月16日 優先權日:2014年6月16日
【發明者】周榮, 李晨陽, 劉銘龍, 田新貴 申請人:廣州銳達生物科技有限公司