專利名稱：一種抗蓖麻毒素的中和性單克隆抗體4c13,其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13，還涉及該單克隆抗體的制備方法以及在制備蓖麻毒素疫苗和蓖麻毒素檢測、診斷、治療藥物中的應用。
背景技術：
蓖麻毒素(Ricin)是一種核糖體失活蛋白，它幾乎可以和所有真核細胞結合，呈細胞毒作用。一分子蓖麻毒素進入細胞內，就足以使整個細胞蛋白質合成停止而死亡。其毒性是氰化物的6000倍。蓖麻毒素氣溶膠進入體內，可引起嚴重的肺泡炎癥和肺水腫，最后因肺阻塞缺氧而導致死亡(1.GriffithsGD，Lindsay CD，Allenby AC，et al.Protection against inhalation toxicity of ricinand abrin by immunisation.Hum Exp Toxicol 1995；14155-64.2.Brown RFR，White DE.Ultrastructure of rat lung following inhalation of ricin aerosol.Int JExp Pathol 1997；78267-76.)。靜脈給藥每公斤體重3-5微克即可致命。迄今為止，國內外還沒有適用于人的、針對蓖麻毒素中毒的專用特效藥。蓖麻毒素生產原料蓖麻籽來源廣泛，提取制備方法簡便，很容易被恐怖分子利用，因此研究其拮抗劑具有重要的現實意義。
抗體自19世紀末報道可以用來治療疾病以來，一直用于治療毒蛇、毒蝎咬傷，具有良好的療效。大量研究表明用蓖麻毒素的中和抗體治療突發性蓖麻毒素中毒效果良好。Furukawa-Stofferdeng等報道給小鼠腹腔注射含蓖麻毒素中和抗體的培養上清并同時注射0.5g蓖麻毒素(致死劑量)，可保護受試小鼠抵抗毒素攻擊(T.Furukawa-Stoffer，D.C.W.Mah，J.Cherwonogrodzky etal.A novel biological-based assay for the screening of neutralizing antibodies toricin.Hybridoma，1999，18(6)505-511)。抗體治療的成敗依賴于蓖麻毒素被吸收的多少和進入體內的路徑(B.M.J.Foxwell，S.I.Detre，T.A.Donovan.et al.The useof anti-ricin antibotied to protect mice intoxicated with ricin.Toxicology，1985，3479-8834.)。在針對蓖麻毒素活性鏈的單克隆抗體與毒素的分子比為4∶1時，抗體在體外可中和蓖麻毒素對EL-4淋巴瘤細胞的細胞毒作用。甘露醇具有增加大分子物質通過血腦屏障的功能，使用甘露醇后蓖麻毒素的毒性作用比靜脈注射增加兩倍，針對Ricin的神經中毒，顱內注射抗體后具有和靜脈注射同樣的保護效果。
目前，國內外針對蓖麻毒素單克隆抗體的報道，主要為檢測用的單克隆抗體和具有中和活性的兩類。具有中和活性單克隆抗體的報道主要為抗蓖麻毒素A鏈、B鏈和A、B鏈三種形式(1.P.V.Lemley，P.Amanatides，D.C.Wright.Identification and characterization of a monoclonal antibody thatneutralizes ricin toxicity in vitro and in vivo.Hybridoma，1994，13(5)417-421.2.Maddaloni M，Cooke C，Wilkinson R，Stout AV，Eng L，Pincus SH.Immunological characteristics associated with the protective efficacy of antibodiesto ricin.J Immunol.2004，15；172(10)6221-8.)。我國對蓖麻毒素生物戰劑的偵檢和醫學防護等研究領域剛剛起步(1.宋云揚，劉娟，應天翼，等.夾心免疫PCR方法檢測蓖麻毒素.免疫學雜志，2002，18(3)229-231.2.郝蘭群，郭勝清，郭振泉，等.抗蓖麻毒素單克隆抗體的制備及應用.細胞與分子免疫學雜志，2003，19(5)517-518)，針對蓖麻毒素的恐怖襲擊尚無配套診斷試劑和有效免疫治療和防護手段，尚無針對蓖麻毒素的中和性單克隆抗體，因此迫切需要建立和發展具有自主知識產權的以抗體為基礎的檢測和防護用品。目前未見有同時識別蓖麻毒素A鏈和B鏈線性表位中和性單克隆抗體的報道。
發明內容
為了提供一種蓖麻毒素中毒的檢測或治療手段，本發明公開了一種抗蓖麻毒素的單克隆抗體4C13。
本發明公開的抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的輕、重鏈蛋白質分子，其氨基酸序列分別如序列表中序列3、序列4所示，其編碼基因分別如序列表中序列1、序列2所示。該單克隆抗體的輕、重鏈蛋白質分子可變區的氨基酸序列分別如序列表中序列5、序列6所示。該單克隆抗體的輕鏈蛋白質分子可變區的互補決定區CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中序列7、序列8、序列9所示。該單克隆抗體的重鏈蛋白質分子可變區的互補決定區CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分別如序列表中序列10、序列11、序列12所示。
本發明還公開了上述單克隆抗體4C13的制備方法，主要內容如下1.抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株4C13的構建首先對蓖麻毒素用甲醛進行減毒處理，然后免疫Balb/c小鼠，常規方法進行細胞融合。用間接ELISA法篩選，陽性細胞克隆再反復亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養上清檢測為100％陽性。對雜交瘤細胞4C13進行了染色體核型分析，雜交瘤細胞4C13染色體平均數目為102條，用雙相瓊脂擴散實驗證明4C13雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG1。
2.抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株4C13的篩選和鑒定用MTT法，就蓖麻毒素對小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行了細胞毒實驗，結果算出蓖麻毒素對Sp2/0細胞的半數致死劑量IC50＝0.31ng/ml。依照IC50，篩選出中和性抗體4C13，Western-blotting對特異性作了評價。結果顯示4C13為蓖麻毒素中和性抗體，可在體外實驗中，中和蓖麻毒素對SP2/0細胞的毒性作用，中和性單克隆抗體4C13可特異性識別蓖麻毒素的A、B鏈線性表位。
3.單克隆抗體4C13對BALB/C小鼠的保護作用親和柱純化Balb/c小鼠雜交瘤細胞腹水，紫外分光光度計測量，計算蛋白質含量。給小鼠注射不同劑量蓖麻毒素，計算半數致死劑量LD50。給小鼠注射不同劑量蓖麻毒素，不同時間段后，注射中和性單克隆抗體4C13記錄生長情況。結果顯示蓖麻毒素對小鼠的LD50為10.4μg/kg，蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13在小鼠注射10倍致死計量的蓖麻毒素30分鐘后仍對小鼠具有保護作用。
4.蓖麻毒素中和性單克隆抗體雜交瘤細胞4C13輕、重鏈基因的釣取取對數生長期的中和性單克隆抗體4C13細胞，提取RNA，經RT-PCR，用兩對特異性引物PHs1，PHs2；PLs1、PLs2釣取抗體的輕重鏈基因。常規法連接入載體，轉化感受態細菌，培養后挑取單個菌落，提取質粒PCR鑒定后進行DNA測序分析。通過本部分實驗，構建了含有蓖麻毒素中和抗體4C13輕、重鏈基因的載體，經序列分析、比對，編碼序列為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(序列表中序列1和序列2)。
5.單克隆抗體4C13輕、重鏈可變區基因序列和氨基酸序列的確定用www.expasy.org在線軟件將編碼蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13輕、重鏈可變區核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體4C13輕、重鏈氨基酸序列如序列表中序列3和序列4所示。根據Kabat數據庫(ElvinA.Kabat.《Sequences of Proteins of Immunological Interest》.1991)確定輕鏈可變區序列如序列表中序列5所示和重鏈可變區序列如序列表中序列6所示。根據Kabat數據庫確定輕鏈可變區序列中的互補決定區CDR1、CDR2和CDR3其氨基酸序列分別如序列表中序列7、序列8和序列9所示。重鏈可變區序列中的互補決定區CDR1、CDR2和CDR3其氨基酸序列分別如序列表中序列10、序列11和序列12所示。
6.基于蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的蓖麻毒素快速檢測法用另一株蓖麻毒素單克隆抗體3D74包被ELISA板，與蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13-HRP配伍，建立了蓖麻毒素快速ELISA檢測法。并對檢測方法的回收率和重復性進行了評價(圖9，圖10)。
本發明應用一套設計的引物成功地從培養的蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區基因。所得輕鏈和重鏈可變區基因可編碼正確的小鼠抗體可變區。本發明的單克隆抗體基于上述已克隆到的蓖麻毒素和中和性單克隆抗體4C13輕、重鏈可變區基因，可構建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質，可以交聯上多種生物活性分子，制備疫苗及用于蓖麻毒素檢測、蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物，具有非常廣闊的應用前景。
圖1為免疫用蓖麻毒素SDS-PAGE結果圖譜。其中泳道1為純化的非還原態蓖麻毒素；泳道2為經甲醛脫毒處理的非還原態蓖麻毒素；泳道3為純化的還原態蓖麻毒素；泳道4為經甲醛脫毒處理的還原態蓖麻毒素；泳道5為蛋白質Marker。
圖2為雜交瘤細胞染色體核型分析結果圖。
圖3為蓖麻毒素對Sp2/0細胞的細胞毒作用圖。其中橫坐標為蓖麻毒素的濃度，縱坐標為蓖麻毒素Sp2/0細胞的殺傷率，依照此結果算出蓖麻毒素對Sp2/0細胞的IC50＝0.31ng/mL。
圖4為蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的篩選圖譜。其中橫坐標為蓖麻毒素的濃度，縱坐標為各種單克隆抗體作用后蓖麻毒素對Sp2/0細胞的殺傷率，依照此結果篩選到中和性單克隆抗體4C13。
圖5為中和性單克隆抗體4C13培養上清中和活性檢測圖譜。其中橫坐標為中和性單克隆抗體4C13培養上清濃度，縱坐標為中和性單克隆抗體4C13作用后蓖麻毒素對Sp2/0細胞的殺傷率，由此結果可以看到，隨著4C13培養上清濃度的逐漸下降，其中和作用逐漸下降。
圖6為中和性單克隆抗體4C13的結合特性鑒定圖譜，其中泳道1為蓖麻毒素的SDS-PAGE結果，上面的為B鏈，下面的為A鏈，泳道2為蛋白質Marker，泳道3為中和性單克隆抗體4C13的Western-blot結果。結果顯示中和性單克隆抗體4C13可識別蓖麻毒素A、B鏈線性表位。
圖7為中和性單克隆抗體4C13經Protein A純化的層析結果圖。其中，峰1為上樣峰，峰2為純化的抗體峰。
圖8為中和性單克隆抗體4C13經Protein A純化后的SDS-PAGE結果圖譜，其中泳道1、2、3為經Protein A純化的中和性單克隆抗體4C13，泳道4為蛋白質Marker，A為重鏈，B為輕鏈。
圖9為蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細胞RNA提取結果。
圖10為蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細胞輕重鏈基因的PGR結果圖譜，其中泳道1為輕鏈基因；泳道2為DL2000；泳道3為重鏈基因。基因大小大約為660bp。
圖11為蓖麻毒素的快速ELISA檢測結果圖，其中橫坐標表示蓖麻毒素(ricin)濃度(μg/mL)，縱坐標表示A450。以實驗組的A值大于陰性對照A值的2.1倍作為判定陽性的標準，快速ELISA對ricin的最低檢出濃度為175ng/L；目視比色對蓖麻毒素的最低檢出濃度為625ng/L。
圖12為快速ELISA的準確性評價圖，橫坐標表示自來水中ricin添加濃度(μg/mL)，縱坐標表示自來水中ricin測定濃度(μg/mL)。r＝0.996，F＝1172.2，P＜0.0001。曲線和直線分別表示回歸前、后自來水中ricin的實際添加濃度和測定濃度之間的關系。
具體實施例方式
通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發明的內容，這些實施例只是為進一步說明，并不意味著限定本發明的范圍。
實施例一抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建一、材料福氏完全佐劑及不完全佐劑，TMB為Sigma公司產品，20％胎牛血清為北京元亨圣馬生物技術研究所產品，無血清RPMI 1640為Gibco公司產品，SP2/0細胞從ATCC引進，本實驗室保存，Balb/c小鼠、昆明小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心。其余試劑均為市購。
二、方法結果1.蓖麻毒素的減毒處理在純化后的蓖麻毒素(Nicolson，G.L.，Blaustein，J.，1972.The interaction of Ricinus com-munis agglutininwith normal and tumor cell surfaces.Biochim.Biophys.Acta 266，543-547.)2mg/ml中加入終濃度為1％的甲醛，37℃處理72h，PH7.20.01M PBS透析72h，SDS-PAGE檢測(圖1)。
2.Balb/c小鼠免疫 選用4-6周齡的雌性Balb/c小鼠6只，用100μgricin腹股溝皮下免疫，第一針加福氏完全佐劑，第2針加福氏不完全佐劑，每3周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾靜脈采血，間接ELISA檢測抗體產生情況，融合前3天，以100μg ricin腹腔加強免疫一次，第3天融合。
3.細胞融合將免疫的小鼠摘眼球后脫頸處死，無菌摘取小鼠脾細胞，按常規方法進行細胞融合。具體方法①將免疫的小鼠摘眼球放血后脫頸處死，75％酒精浸泡3min，無菌取出脾臟，用200目鋼網研磨單個細胞懸液，無血清RPMI 1640洗兩次并記數；②收集對數生長期的SP2/0細胞，用無血清RPMI1640洗兩次并記數；③按SP2/0細胞∶脾細胞＝1∶5的比例混合兩種細胞，用RPMI 1640洗1次，棄盡上清，輕輕將細胞打散；④在1min時間里緩慢加入1ml 50％PEG(MW 1500)溶液，置37℃水浴1min；⑤在1min、2min、2min、5min時間內加無血清RPMI1640 1ml、5ml、10ml、10ml；⑥800r/min離心7min，棄上清，盡可能輕輕將細胞懸起；⑦加含20％FCS的HAT(Sigma)-RPMI1640培養液，調整細胞濃度為2×106/ml，混勻后，滴加在鋪有滋養細胞(1×104細胞/孔)96孔培養板(Gibco)中，100μl/孔，37℃5％CO2孵箱中培養。
4.間接ELISA篩選抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞(1)用10μg/mlricin包被ELISA板，于4℃過夜并封閉。依次加入待測細胞培養上清液(37℃1h，PBST洗板4次)，及1∶500稀釋的50μl HRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB底物顯色后，于450nm波長測定A值。
5.雜交瘤細胞克隆化 間接ELISA法篩選為陽性的細胞克隆再反復亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養上清檢測為100％陽性。雜交瘤細胞的克隆化用有限稀釋法(1)在克隆化的當天或前1天制備滋養細胞脫頸處理昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮膚，無菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5ml 1640培養液注入小鼠腹腔，反復沖洗后吸出腹腔洗液，用20％胎牛血清1640培養液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.1ml。(2)取少許待作克隆化的雜交瘤細胞移至另一無菌試管中，并準確計數。(3)有限稀釋法進行亞克隆。(4)將培養板置于5％CO2，37℃孵箱中培養，5天左右在顯微鏡下可觀察到細胞克隆。適時換液，檢測，取陽性單克隆細胞株進行擴大培養，及時凍存細胞株。在第一批實驗中，篩選到了4株針對蓖麻毒素的單克隆抗體細胞株。
6.雜交瘤細胞的染色體核型分析在對數生長期的雜交瘤細胞中加入秋水仙素，終濃度為0.02μg/ml，在孵箱中繼續培養4小時后收集細胞，經低滲裂解(加入預溫至37℃的0.075M KCL8ml，輕輕打勻，37℃30-40分鐘)、預固定(甲醇∶冰醋酸＝3∶1新鮮配制，輕輕打勻，離心棄上清)和3次固定(第1次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫30分鐘，離心棄上清；第2次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清；第3次固定加入6ml固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清)處理后用少量固定液制備細胞懸液，滴于冰水浸泡的玻片上，文火烘干后10％Giemsa染色15-20分鐘，水洗鏡檢(圖2)。結果顯示經30個分裂相細胞的統計平均值，雜交瘤細胞染色體數目在85-112(n＝30)之間變動，平均數目為102條，且有1-2個中部著絲粒染色體。已知Balb/c小鼠脾細胞染色體數目為40條，Sp2/0細胞染色體數目為60-70條，融合后的雜交瘤細胞染色體數目應該為90-120條，由此提示所獲得的抗體分泌細胞為雜交瘤細胞。
7.雜交瘤細胞免疫球蛋白亞型的確定 用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，就雜交瘤細胞濃縮后的培養上清作雙相瓊脂擴散實驗，證明4C13雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG1。
通過本部分工作，篩選到蓖麻毒素單克隆抗體4C13。雜交瘤細胞4C13染色體數目平均為102條，所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG1。
實施例二抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選和鑒定一、材料同上。
二、方法結果1.ricin對小鼠骨髓瘤細胞SP2/0半數致死劑量(IC50)的確定用RPMI-1640稀釋ricin使其濃度分別為0ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL，分別加入96孔細胞培養板中，每一濃度3復孔，100μl/孔，調整對數生長期的SP2/0細胞濃度調整為5×105/ml，100μl/孔。37℃5％CO2孵箱中培養24h，每孔加入10μl MTT，37℃5％CO2孵箱中培養6h，2000r/min離心10min，棄上清，加100μl DMSO溶解結晶，于570nm波長測定A值。按公式細胞死亡率％＝[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100％評價細胞毒作用，并計算IC50(圖3)。用MTT法，就蓖麻毒素對小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行了細胞毒實驗，結果算出IC50＝0.31ng/ml。
2.蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的篩選用RPMI-1640稀釋ricin使其濃度分別為40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL，分別加入96孔細胞培養板中，每一濃度3復孔，100μL/孔。依次分別加入4種待測細胞培養上清液50μL/孔。調整對數生長期的SP2/0細胞濃度調整為1×106/ml，50μL/孔。37℃5％CO2孵箱中培養24h，每孔加入10μL MTT，37℃5％CO2孵箱中培養6h，2000r/min離心10min，棄上清，加100μL DMSO溶解結晶，于570nm波長測定A值。按公式細胞死亡率％＝[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100％評價細胞毒作用(圖4)。
3.蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13中和活性測定 用RPMI-1640倍比稀釋中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細胞培養上清，每一濃度3復孔，100μL/孔。用RPMI-1640稀釋ricin使其濃度為1.25ng/mL(IC50＝0.3125ng/mL)，50μL/孔。加于96孔細胞培養板中。調整對數生長期的SP2/0細胞濃度為1×106/ml，50μL/孔。37℃5％CO2孵箱中培養24h，每孔加入10μL MTT，37℃5％CO2孵箱中培養6h，2000r/min離心10min，棄上清，加100μL DMSO溶解結晶，于570nm波長測定A值。按公式細胞死亡率％＝[1-(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100％評價中和性單克隆抗體4C13的作用(圖5)。
4.蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13特異性鑒定 將Ricin經120g/L還原SDS-PAGE并轉移至硝酸纖維素膜上，滴加含5％奶粉的PBS于4℃封閉過夜，用含0.5ml/L Tween-20的PBS洗膜3次。將膜剪成相同寬度，依次滴加蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13交瘤細胞培養上清(37℃結合1h，PBST洗膜3次，再用含0.5ml/L Tween-20的TBS洗滌3次)及HRP-GAM IgG(37℃結合1h，洗膜3次)以DAB顯色后，觀察結果(圖6)。結果顯示4C13為蓖麻毒素中和性抗體。
5.動物體內誘生單克隆抗體制備蓖麻毒素單克隆抗體4C13接種雜交瘤細胞前10天，先給Balb/c小鼠(♂，8～12周)腹腔注射0.5ml液體石臘油。收集對數生長期的雜交瘤細胞，1500r/min離心7min，棄上清，生理鹽水洗2次，最后將細胞濃度調整為4×106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。7～10天后，可見小鼠腹部明顯膨大，碘酒和酒精棉球消毒腹部皮膚，抽取腹水。將抽取的腹水3000r/min離心10min，收集上清，加等量甘油，-20℃凍存備用。
通過本部分工作，獲得了命名為4C13的蓖麻毒素中和性單克隆抗體交瘤細胞，在體外實驗中，4C13可中和蓖麻毒素對SP2/0細胞的毒性作用，中和性單克隆抗體4C13可特異性識別蓖麻毒素A、B鏈線性表位。
實施例三單克隆抗體4C13的Protein A純化及對BALB/C小鼠的保護性實驗一、材料Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱北京本元正陽生物技術有限公司產品；余同上。
二、方法結果
1.在2毫升小鼠腹水中加入1毫升PH8.0，0.1moL/L磷酸緩沖液并用PH9.0，1moL/L TRIS-HCL調整PH為9。把小鼠腹水加入已經用0.1moL/L磷酸緩沖液PH 8.0平衡好的Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱中，用上述緩沖液洗柱子，直到流出液中測不到雜蛋白為止。用PH 3.0的檸檬酸緩沖液洗脫，收集流出液，并立即用1moL/L TRIS-HCL PH 8.5緩沖液中和，用PH7.2，0.01M PBS透析72h。取樣在紫外分光光度計上測OD260，OD280，計算蛋白質含量，凍干-20℃保存(圖7，圖8)。
2.選用4-6周齡、體重為20g左右的Balb/c小鼠38只，分為4組，雌雄各半，按每公斤體重分別于左測腹腔注射0μg、10μg、20μg、40μg蓖麻毒素，正常飼養，每1h觀察一次，記錄生長情況，觀察2周，計算半數致死劑量LD50，見表1。
3.選用4-6周齡、體重為20g左右的Balb/c小鼠，雌雄各半，分為抗體組、PBS組和正常對照3組，共計5批次。按每公斤體重分別于左測腹腔注射20μg、40μg、60μg、100μg、蓖麻毒素，分別于0min、10min、20min、30min后于右側腹腔注射純化的中和性單克隆抗體4C13 100μg，正常飼養，每1h觀察一次，記錄生長情況，觀察2周，結果見表2。
結果顯示蓖麻毒素對小鼠的LD50為10.4μg/kg，蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13在小鼠注射10倍致死計量的蓖麻毒素30分鐘后仍對小鼠具有保護作用。
表1.蓖麻毒素對Balb/c鼠的半數致死量確定
從結果可以計算出LD50為10.4μg/kg表2.蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13對小鼠的保護作用
實施例四蓖麻毒素中和性單克隆抗體雜交瘤細胞4C13輕、重鏈基因的釣取一、材料引物PHs1見序列表中序列13；PHs2見序列表中序列14；PLs1見序列表中序列15；PLa1見序列表中序列16；PHa1見序列表中序列17。DNA片段純化試劑盒OMEGA生物科技公司產品；T4 DNA連接酶New EnglandBiolabs產品；載體PGEM TeasyPromega公司產品；TRIzolInvitrogen公司產品；感受態細菌JM109購自Promega公司。余同上。
二、方法結果1.取對數生長期的中和性單克隆抗體4C13細胞5×106-107個，離心去除上清，將細胞均勻彈起。加1mlTRIzol反復吹打使細胞充分裂解，振蕩5分鐘后，加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘，2-8℃12000r/min，離心15分鐘，取上清于另一新管中，加500μl異丙醇混勻后室溫放置10分鐘，2-8℃12000r/min離心10分鐘。75％乙醇洗滌沉淀，干燥后，用20μl無RNA酶的去離子水溶解沉淀(圖9)。
2.取含1μg總RNA的溶液，依次加入AMV 5×緩沖液4μl，0ligo(dT)(500ng/μl)0.5μl，2.5mmol/L dNTP2μl，Rnasin(50U/μl)0.5μl，去離子水補至20μl、反轉錄酶2-5U，42℃延伸1小時。95℃變性5分鐘，置冰浴中，產物為cDNA第一鏈。用2對特異性引物PHs1、PHa1和PLs1、PLa1，在20μl PCR反應體系中，分別加入反轉錄產物2μl，Taq酶10×buffer 2μl，上下游引物各1μl，2.5mmol/L dNTP 1μl，加Taq酶1-2U，去離子水補至20μl。95℃變性2分鐘，循環參數為94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共30個循環，72℃后延伸10分鐘(圖10)。
3.用分離出欲回收的DNA片段，在長波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55℃水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒回收DNA片段并將純化的DNA片段在水溶液里，將回收的PCR產物在T4 DNA連接酶緩沖液中按2∶1的比例(摩爾比)和載體PGEMTeasy混合后，加入0.5U的T4 DNA連接酶于16℃連接過夜，連接反應的總體積為10μL。
4.取連接液10μl，加入200μl感受態細菌JM109中并輕柔混勻，冰浴30分鐘，42℃水浴熱休克90秒，迅速轉入冰浴2分鐘，加800μl LB培養基，轉入37℃恒溫搖床，以150轉/分鐘的速度搖動45分鐘，4000r/min離心1分鐘，棄去800μl上清，取沉淀涂布于含Amp(終濃度為100μg/ml)的固體LB平板，將平板倒置于37℃孵箱12～18小時。
5.在上述平板中挑取單個克隆，接種于含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培養基中。37℃恒溫搖床170rpm，震蕩培養過夜。取3ml菌液加入1.5mlEppendorf管中，10000rpm離心1min，棄上清。將沉淀菌體重懸于100μL溶液I中，加新鮮配制的溶液II 200μL，輕緩地上下顛倒數次，至液體變清澈為止。隨后，再加入150μL溶液III，輕柔地上下顛倒數次使液體混勻，此時出現大量白色絮狀沉淀。4℃，12000rpm離心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酚，劇烈震蕩后，12000rpm離心5min，將上層水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無水乙醇混勻，于-20℃放置3h。4℃，12000rpm離心10min，棄上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室溫干燥20min，以40μL無菌雙蒸水溶解，進行PCR鑒定及DNA測序分析。
構建了含有蓖麻毒素中和抗體4C13輕、重鏈基因的載體，經測序分析、序列比對為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(序列表中序列1、序列2)。
實施例六基于蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的蓖麻毒素快速檢測法一、材料mAb 3D74本實驗室構建的另一株蓖麻毒素中和性單克隆抗體，識別蓖麻毒素的空間表位。余同上。
二、方法結果用10μg/mL mAb 3D74包被ELISA板，于4℃過夜并封閉。同時加入PBS稀釋的不同濃度的ricin和50μL 1∶1 600 4C13-HRP(37℃30min，PBST洗板4次)，以TMB底物顯色后，于波長450nm測定A值(圖11)。
通過以上實驗得出的結論為快速ELISA對ricin的最低檢出濃度為175ng/L；目視比色對蓖麻毒素的最低檢出濃度為625ng/L。在準確性評價中，測得自來水中ricin的實際添加濃度和測定濃度之間的相關系數r＝0.996，F＝1172.2，P＜0.0001，實際添加濃度和測定濃度之間有非常顯著的相關性。自來水中ricin的添加濃度分別為312.5ng/L、625ng/L、1.25μg/L、2.5μg/L和5μg/L時，回收率依次為5.5％、21.6％、31.8％、36.4％和34.5％。在重復性評價中，用快速夾心ELISA檢測ricin濃度分別為125μg/L、1mg/L和5mg/L時的批內變異系數，依次為13.78％、6.8％和3.5％。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所<120>一種抗蓖麻毒素的中和性單克隆抗體4C13，其制備方法和用途<130>
<160>17<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>638<212>DNA<213>
<400>
ccagatgacc cagtctccag caatcatgtc tacatctcca ggggagaagg tcaccataac 60ctgcagtgcc agttcaagtg taaattacat acactggttc cagcagaagc caggctcttc120tcccaaactc tggatttata tcacatccaa cctggcttct ggagtccctg atcgcttcag180tggcagtgga tctgggacct cttactctct cacaatcagc cgaatggagg ctgcagatgc240tgccacttat tactgccagc aaaggagtag ttatccgctc acgttcggtg ctgggaccaa300gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc atcttcccac catccagtga360gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg aacaacttct accccaaaga420catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa aatggcgtcc tgaacagttg480gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc agcaccctca cgttgaccaa540ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc actcacaaga catcaacttc600acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaat638<210>2<211>690<212>DNA<213>
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Glu Glu Ala Asn Trp Asp Glu Arg Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ala115<210>7<211>10<212>PRT<213>
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<400>9Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr1 5<210>10<211>10<212>PRT<213>
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<400>16gcgccgtcta gaattaacac tcattcctgt tgaa 34<210>17<211>30<212>DNA<213>
<400>17aggcttacta gtacaatccc tgggcacaat30
權利要求
1.一種抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13，其特征在于輕、重鏈蛋白質分子分別具有如序列表中序列3、序列4所示的氨基酸序列。
2.權利要求1所述單克隆抗體4C13的輕、重鏈蛋白質分子編碼基因，其特征在于分別具有如序列表中序列1、序列2所示的核甘酸序列。
3.權利要求1所述單克隆抗體4C13的輕、重鏈蛋白質分子中的可變區，其特征在于分別具有如序列表中序列5、序列6所示的氨基酸序列。
4.權利要求3所述的單克隆抗體4C13的輕鏈蛋白質分子可變區的互補決定區CDR1、CDR2、CDR3，其特征在于分別具有如序列表中序列7、序列8、序列9所示的氨基酸序列。
5.權利要求3所述的單克隆抗體4C13的重鏈蛋白質分子可變區的互補決定區CDR1、CDR2、CDR3，其特征在于分別具有如序列表中序列10、序列11、序列12所示的氨基酸序列。
6.權利要求1所述抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13的制備方法，包括如下步驟(1)抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建；(2)抗蓖麻毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選和鑒定；(3)單克隆抗體4C13對小鼠的保護作用；(4)雜交瘤細胞4C13輕、重鏈基因的釣取；(5)單克隆抗體4C13輕、重鏈可變區基因序列和氨基酸序列的確定。
7.權利要求1所述抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13，在制備蓖麻毒素檢測、疫苗以及蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13，該單克隆抗體的制備方法及其在制備蓖麻毒素檢測試劑、疫苗以及診斷和治療蓖麻毒素或免疫毒素中毒藥物中的應用。本發明從制備的蓖麻毒素中和性單克隆抗體4C13雜交瘤細胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區基因，所得輕鏈和重鏈可變區基因可編碼正確的小鼠抗體可變區。基于上述單克隆抗體的輕、重鏈可變區基因，可構建和表達多種小分子基因工程抗體，基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質，可以交聯上多種生物活性分子，制備疫苗及用于蓖麻毒素檢測、蓖麻毒素和免疫毒素中毒的診斷或治療藥物，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N5/18GK1982338SQ20061008326
公開日2007年6月20日 申請日期2006年6月1日 優先權日2005年11月24日
發明者郭建巍, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所