日本沼蝦血紅蛋白基因及其克隆方法與重組蛋白制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種日本沼蝦血紅蛋白基因及其克隆方法與重組蛋白制備方法，利用表達序列標簽技術、3’和5’末端快速擴增技術（RACE）從日本沼蝦克隆得到血紅蛋白基因cDNA全長1201bp，有一個579bp的開放閱讀框，編碼193個氨基酸，5’非編碼區為199bp，3’非編碼區為420bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴，該基因在日本沼蝦免疫防御方面發揮重要作用。本發明利用體外重組表達技術獲得了日本沼蝦血紅蛋白，該重組蛋白不僅具有攜氧作用，而且具有抑菌作用，可為日本沼蝦病害防治、基因輔助育種和飼料添加劑的研制提供理論基礎。
【專利說明】日本沼蝦血紅蛋白基因及其克隆方法與重組蛋白制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學【技術領域】，涉及日本沼蝦血紅蛋白基因序列，依據RNA-Seq高通量測序手段構建的日本沼蝦轉錄組文庫中篩選出血紅蛋白基因序列，采用RACE PCE技術獲得血紅蛋白cDNA全序列，并進行了原核重組表達，還分析了該基因表達產物具有抗菌作用。
【背景技術】
[0002]動物的呼吸蛋白通常劃分為三大類:血紅蛋白(Hemoglobin, Hb)、血藍蛋白(Hemocyanin, He)和蟲丘蝴血紅蛋白(Hemerythreins, Hr) (TerwiIIiger, 1998) ? 其中，血紅蛋白分布最為廣泛，不僅存在于脊椎動物，還存在于無脊椎動物甲殼綱。鑒于高等動物中血紅蛋白參與氧的感受和運輸，基于血紅蛋白來揭示高等動物低氧應激調控機制一直是研究熱點；而蝦蟹類是否存在血紅蛋白一直存在爭論。傳統觀點認為，甲殼動物的呼吸蛋白是游離在血淋巴中的血藍蛋白，它在肝胰腺內被合成，負責氧氣的運輸，起著“分子肺”(即呼吸蛋白)的作用。有趣的是甲殼動物濱蟹體內同時存在血紅蛋白和血藍蛋白(Ertas etal.，2011)，基于日本沼蝦和濱蟹同屬于十足目種類，日本沼蝦鰓組織中也發現存在血紅蛋白。
[0003]日本沼蟲下(Macrobrachium nipponense)屬于甲殼綱、十足目、長臂蟲下科、沼蟲下屬，俗稱青蝦或河蝦，是我國重要的淡水經濟蝦類。其養殖分布較廣，在江蘇、浙江、上海等地的水產養殖中發揮舉足輕重的作用，已成為我國農業增效、農民增收的重要途徑之一。隨著養殖技術不斷推廣，養殖方式日趨多樣，我國的日本沼蝦產量不斷提升，截至2011年已達到23萬噸，產值超過100億元。然而，因受溫度、晝夜節律和季節變化以及富營養化作用的影響，再加上人為養殖管理不善，容易導致日本沼蝦疾病暴發甚至大規模死亡；尤其在高溫時節，養殖場所底層大量累積物(未消化飼料和排泄物)腐敗分解，底泥釋放大量致病細菌，致使具有底棲習性的日本沼蝦長期處于生理脅迫狀態，故此尋找有效的免疫增強劑來增強甲殼動物免疫機能是當前研究的熱點問題。迄今，不僅日本沼蝦血紅蛋白的研究尚屬空白，而且甲殼動物血紅蛋白在其免疫反應過程中作用也鮮有報道。
【發明內容】
[0004]解決的技術問題:本發明的目的在于從日本沼蝦中克隆到血紅蛋白，并對其進行原核表達及重組蛋白產物的抗菌功能鑒定，為日本沼蝦疾病防控提供理論基礎。
[0005]技術方案:
[0006]一種日本沼蝦血紅蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]一種編碼所述的日本沼蝦血紅蛋白的基因，其cDNA序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]所述的日本沼蝦血紅蛋白，其氨基酸序列具有SEQ ID N0.3所示的保守氨基酸殘基位點。
[0009]一種克隆所述的日本沼蝦血紅蛋白基因的方法，通過利用氮氣裝置模擬低氧脅迫環境，誘導并提高日本沼蝦血紅蛋白表達水平、提取總RNA并反轉錄成cDNA、設定引物、PCR擴增中間片段，利用RACE技術獲得3’與5’序列，然后拼接為全長cDNA序列。
[0010]所述的克隆日本沼蝦血紅蛋白基因的方法，通過利用氮氣裝置模擬低氧脅迫環境過程可以為將暫養在溶解氧含量為6.5mg/L水體中的日本沼蝦移至低溶解氧水槽中，通過調整空氣、氮氣比例來調節低溶解氧水槽中氧氣在水體中的含量，用溶解氧儀監測水槽中溶解氧含量的變化，直到測試值為2±0.2mg/L。
[0011]所述的克隆日本沼蝦血紅蛋白基因的方法，其中設定引物的正向引物為5’ AAGTTGTTCAGAGAGGAGCCTG3’，反向引物為 5’ TTCCTCTGAAACTCGATGACCG3’。
[0012]一種所述的日本沼蝦血紅蛋白基因的重組蛋白的制備方法，將cDNA與pET_23b載體相連接，轉化入克隆菌DH5a后進行陽性轉化子的篩選鑒定。
[0013]所述的日本沼蝦血紅蛋白在制備甲殼動物抗菌藥物和飼料添加劑中的應用。
[0014]本發明利用構建cDNA文庫，采用RACE技術以及體外重組表達等技術，對日本沼蝦血紅蛋白進行了研究，首次從淡水蝦類克隆出血紅蛋白，并進行了該基因重組蛋白的攜氧功能以抗菌作用的驗證。本發明從日本沼蝦中克隆到血紅蛋白基因cDNA全長l，201bp，有一個579bp的開放閱讀框，編碼193個氨基酸，5’非編碼區長199bp，3’非編碼區長420bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴，該基因在日本沼蝦攜氧功能方面發揮重要作用。利用PET30a(+)表達載體在大腸桿菌origami (DE3)重組表達了該蛋白，表達產物對具有攜氧功能。其編碼的蛋白具有血紅蛋白特有的氨基酸殘基位點，等電點為5.96。
[0015]所述日本沼蝦血紅蛋白與其他節肢動物血紅蛋白氨基酸序列比對圖如圖1所示，方框表示血紅蛋白的氨基酸殘基位點。
[0016]所述血紅蛋白的重組產物具有攜氧的作用，具有一定的殺菌活性，能夠應用于淡水蝦類相關疾病的治療、藥物生產和飼料添加劑的生產中。
[0017]有益效果
[0018]本發明提供了日本沼蝦血紅蛋白基因，首次發現日本沼蝦血紅蛋白不僅具有攜氧功能，也具有較強的抗菌作用，可廣泛應用于新型醫藥、獸藥、飼料添加劑、水產養殖的研發領域，特別對于解決目前日本沼蝦疾病防控提供了重要的思路。本發明提供的血紅蛋白基因的克隆方法也可借鑒應用到篩選其它甲殼動物血紅蛋白基因的研究之中。
[0019]本發明首次合成了一種日本沼蝦血紅蛋白，它是一種非游離的膜結合蛋白，非常便于用基因工程菌株表達，可用于水產添加劑的開發之中。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為日本沼蝦血紅蛋白與其他節肢動物血紅蛋白氨基酸序列比對圖；
[0021]圖2為實施例2中血紅蛋白N端肉?蓮酸基化圖；
[0022]圖3為實施例3中日本沼蝦血紅蛋白在不同氧環境中表達量對比圖；
[0023] 圖4為實施例4中日本沼蝦血紅蛋白原核表達試驗結果圖。
【具體實施方式】
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[0024]下面結合實施例對本發明進一步說明，但不構成對本發明的限制。
[0025]實施例1
[0026]血紅蛋白的cDNA全長序列的克隆
[0027]I)將10尾日本沼蝦放入玻璃鋼桶中，以蝦的鰓組織為研究對象提取RNA，試驗系統包括塑料水槽(50CmX40CmX30Cm)、充氣泵、氮氣罐等。試驗處理組的溶解氧含量主要通過充氣(調整空氣、氮氣比例)來調節氧氣在水體中含量為2mg/L，以充空氣組作為對照組。試驗時將暫養在溶解氧含量為6.5mg/L水體中的日本沼蝦分別移至各低溶解氧水槽中，每個水槽分別放養處于蛻皮間期健康日本沼蝦20尾，各梯度均設3個平行對照組，每隔2h用YS1-556MPS型溶解氧儀監測水槽中溶解氧含量的變化，實驗組實測值為(2±0.2)mg/L，低氧脅迫24h后取日本沼蝦鰓組織保存于液氮中，轉入_80°C超低溫冰箱。
[0028]2)總RNA的提取，采用RNAiso Plus (Total RNA提取試劑)試劑盒說明書操作，并用氯仿/酚混合抽提法去除痕量殘余蛋白。具體如下
[0029](I)取2個1.5ml離心管，分別加Iml Unizol RNA提取液，備用；
[0030](2)取鰓組織于液氮預冷研缽中，在液氮中迅速研磨成粉末；
[0031](3)將粉末以均等量轉移到上述含Iml Unizol的離心管內，迅速混勻，室溫放置5min ；
[0032](4)加100 μ I氯仿,迅速混勻,在鏇潤振蕩儀中振蕩45s, 14000rpm離心5min ；
[0033](5)將上清700 μ I轉移到一無RNase的1.5ml離心管內，加560 μ I RNA沉淀緩沖液(奧萊博生物)，混勻，冰浴1min ；
[0034](6) 1000g, 4°C離心 1min,棄上清；
[0035](7)分別用100 μ I去離子水溶解RNA，合并成一管；
[0036](8)加200 μ I氯仿/酹混合液,劇烈振蕩lmin, 14000rpm離心5min ；
[0037](9)將上清轉移到一無RNase的1.5ml離心管內，加200 μ I氯仿，劇烈振蕩lmin,14000rpm 離心 5min ；
[0038](10)將上清轉移到一無RNase的1.5ml離心管內，加600 μ I無水乙醇，混勻，冰浴1min ；
[0039](11) 14000rpm，4DC離心 lOmin，棄上清后加 lml70% 乙醇；
[0040](12) HOOOrpmdt:離心5min，棄乙醇，超凈臺中吹干1min后加6 μ I水溶解沉淀RNA ；
[0041](13)采用分子生物學方法提取鰓的mRNA并反轉錄成cDNA，第一鏈cDNA合成根據Primer ScriptIIlst Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書操作步驟進行,反轉錄過程如下:
[0042](I)在Microtube中配制下列混合液:
[0043]
【權利要求】
1.一種日本沼蝦血紅蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種編碼權利要求1所述的日本沼蝦血紅蛋白的基因，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID N0.2 所示。
3.根據權利要求1所述的日本沼蝦血紅蛋白，其特征在于，其氨基酸序列具有SEQIDN0.3所示的保守氨基酸殘基位點。
4.一種克隆權利要求2所述的日本沼蝦血紅蛋白基因的方法，其特征在于，通過利用氮氣裝置模擬低氧脅迫環境，誘導并提高日本沼蝦血紅蛋白表達水平、提取總RNA并反轉錄成cDNA、設定引物、PCR擴增中間片段，利用RACE技術獲得3’與5’序列，然后拼接為全長cDNA序列。
5.根據權利要求4所述的克隆日本沼蝦血紅蛋白基因的方法，其特征在于，通過利用氮氣裝置模擬低氧脅迫環境過程為將暫養在溶解氧含量為6.5 mg/L水體中的日本沼蝦移至低溶解氧水槽中，通過調整空氣、氮氣比例來調節低溶解氧水槽中氧氣在水體中的含量，用溶解氧儀監測水槽中溶解氧含量的變化，直到測試值為2±0.2mg/L。
6.根據權利要求4所述的克隆日本沼蝦血紅蛋白基因的方法，其特征在于，其中設定引物的正向引物為5’ AAGTTGTTCAGAGAGGAGCCTG3’，反向引物為5’ TTCCTCTGAAACTCGATGACCG3’。
7.—種權利要求2所述的日本沼蝦血紅蛋白基因的重組蛋白的制備方法，其特征在于，將cDNA與pET-23b載體相連接，轉化入克隆菌DH5a后進行陽性轉化子的篩選鑒定。
8.權利要求1所述的 日本沼蝦血紅蛋白在制備甲殼動物抗菌藥物和飼料添加劑中的應用。
【文檔編號】A61K38/42GK104073501SQ201410276188
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】孫盛明, 戈賢平, 傅洪拓, 朱健 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心