蘭州大尾羊pparg基因的克隆和原核表達載體的構建方法
【專利摘要】本發明通過設計克隆PPARG基因全長cDNA的PCR引物，通過RACE技術，從綿羊尾部脂肪組織克隆綿羊PPARG基因全長cDNA，確定綿羊PPARG基因編碼區cDNA序列。將目的基因定向克隆于pET32a原核表達載體中，獲得pET32a（+）-PPARG重組原核表達載體，誘導表達重組PPARG蛋白。本發明生產的重組PPARG蛋白，用于綿羊前體脂肪細胞的誘導分化，為蘭州大尾羊等地方綿羊遺傳資源的保護和肉羊育種中優良性狀的利用提供參考，具有重要的實踐價值。
【專利說明】蘭州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表達載體的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物分子生物學領域，具體涉及一種蘭州大尾羊PPARG基因的克隆和原核表達載體的構建方法。
【背景技術】
[0002]過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activatedreceptor, PPAR)是調節目標基因表達的核內受體轉錄因子超家族成員，主要表達于免疫系統和脂肪組織，是胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥物作用的靶分子，與機體免疫、胰島素抵抗、脂肪細胞分化關系密切。PPAR按結構分為α、β、Y三種類型，PPARG基因(Y型)是脂肪細胞分化的主要候選基因。
[0003]1990年Issemann等首先發現這種脂肪酸樣化合物，因其能被過氧化物酶體增殖劑(peroxisome proliferators, PP)激活而被命名為 PP 激活受體。1997 年,Lehmann MJ等研究發現，PPARG在脂肪、巨噬細胞、肝、腎、肺、直腸中均有表達。哺乳動物中，PPARG在脂肪組織中表達量最高，其次為肝臟和肌肉。
[0004]以往的研究認為脂肪細胞數量在動物出生時就已固定不變，脂肪沉積只是其體積肥大的過程。但目前研究表明脂肪細胞的分化貫穿于機體的整個生命過程，表現在兩個方面，一方面是正常脂肪細胞的更新，另一方面是機體需要儲備更多能量時導致脂肪細胞的分化。Chuang S 石開究表明，ERK (extra-cellular signal regulated protein kinase)信號通路可以誘導白細胞介素表達，使其下游PPARG被磷酸化，導致PPARG下游生脂相關的靶基因表達水平降低，從而抑制了脂肪細胞分化。2011年，Pachakkil研究表明，香草精通過激活ERK通路，上調了前體脂肪細胞中PPARG基因的表達，增加了細胞葡萄糖的攝取量，促進了脂肪細胞分化。所以，PPARG基因是脂肪代謝過程中，尤其是在脂肪細胞分化過程中起重要作用。
[0005]蘭州大尾羊是清朝同治年間由陜西大荔一帶引進的同羊與蘭州當地蒙古羊雜交選育而成的地方綿羊品種，具有耐粗飼、抗病能力強、飼料利用率高、適應性強、肉質鮮美等優點的優良地方綿羊品種，因其尾部脂肪過度沉積，導致尾大、脂肪充實而得名，其尾部脂肪細胞分化與其它綿羊差異顯著，但是，國內外目前對于蘭州大尾羊脂肪細胞分化相關基因的研究甚少，PPARG基因研究未見報道。
[0006]因此，本發明利用RACE技術獲得蘭州大尾羊PPARG基因全長cDNA序列，進一步構建原核表達載體，獲得重組PPARG蛋白，進一步研究PPARG基因的結構和功能，以及對綿羊脂肪細胞分化過程中的作用。
【發明內容】
[0007]本發明提供蘭州大尾羊PPARG基因全長cDNA序列，并構建原核表達載體獲得重組PPARG蛋白，研究它的結構與功能以及對綿羊脂肪細胞分化過程中的作用。
[0008]蘭州大尾羊PPARG基因是一種調節目標基因表達的核內受體轉錄因子超家族成員，與脂肪細胞分化密切相關的基因，其cDNA序列全長1774bp，其⑶S區片段長1428bp，編碼475個氨基酸，首次提供綿羊編碼區兩側翼，分別具有5’ -UTR131bp (l_131nt)和3’ -UTR214bp (1560_1774nt)。
[0009]本發明進一步提供構建綿羊PPARG基因原核表達載體并獲得重組PPARG蛋白的方法。
[0010]更具體的，本發明提供一種蘭州大尾羊PPARG基因的全長CDNA，如SEQ ID NO:7所
/Jn ο
[0011]更具體的，本發明提供一種蘭州大尾羊PPARG基因全長cDNA的編碼蛋白，如SEQID NO:8 所示。
[0012]更具體的，本發明提供一種表達載體，包含上述的蘭州大尾羊PPARG基因的全長cDNA。
[0013]更具體的，本發明提供蘭州大尾羊PPARG基因全長cDNA的用途，用于綿羊前體脂肪細胞的誘導分化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1:PPARG基因5’ -RACE片段、3’ -RACE片段和CDS片段擴增產物電泳圖
[0015]Ml.DL2000DNAmarker;M2.1500bp DNAmarker; 1.5，-RACE cDNA 片段.,2.3，-RACEcDNA片段.；3.CDS片段.[0016]圖2PPARG基因同源性分析和系統發育樹
[0017]左圖:PPARG基因同`源性分析結果；右圖=PPARG基因系統發育樹
[0018]圖3蘭州大尾羊與其他物種PPARG基因序列間多序列對位排列
[0019]黑色部分表示氨基酸序列完全相同；紅色部分表示有一個以上氨基酸序列不同。
[0020]圖4重組質粒pET_32a ( + ) -PPARG的酶切鑒定
[0021]ΜΙ.λ-Hind III digest; 1.pDM_19T (+)-PPARG; 2.pDM_19T (+)-PPARG-HindIII /Xho I ; 3.pET-32a ( + )-PPARG-Hind III /Xho I ; 4.pET32a-Hind III /Xho I ;M2.DL2, OOODNAMarker
[0022]圖5重組菌株pET_32a ( + ) -PPARG表達產物的SDS-PAGE分析
[0023]Ml.蛋白質相對分子質量標準；1.pET_32a全細胞；2.pET_32a上清；3.pET_32a沉淀；4.pET-32a (+) -PPARG 全細胞；5.pET_32a ( + )-PPARG 上清；6.pET_32a (+) -PPARG 沉淀.[0024]圖6MTT比色法繪制生長曲線
【具體實施方式】
[0025]實施例1PPARG基因克隆
[0026]按照SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 要求，設計克隆 PPARG 基因全長cDNA 的嵌套 PCR 引物 GSPl (SEQ ID NO:1)、NGSPl (SEQ ID NO:2)、GSP2 (SEQ ID NO:3)和NGSP2 (SEQ ID NO:4)，確定綿羊PPARG基因編碼區序列，設計克隆綿羊PPARG編碼區的PCR引物，上游引物 CDSl (SEQ ID NO:5)，下游引物 CDS2(SEQ ID NO:6);
[0027]將克隆PPARG基因全長cDNA克隆于pET32a原核表達載體中，獲得pET32a_PPARG重組載體并轉入BL21感受態細胞中，對陽性克隆進行誘導表達，獲得PPARG基因原核表達系統，生產重組PPARG蛋白，通過SDS-PAGE方法鑒定重組蛋白表達。
[0028](I)實驗材料:選購正在育肥的6月齡蘭州大尾羊(羯羊)I只，頸靜脈放血后，快速切取尾部脂肪組織，切成小塊，用錫箔紙包裹后液氮速凍后帶回實驗室，80°C保存備用。
[0029](2)實驗過程:
[0030]脂肪組織總RNA的提取
[0031]由于脂肪組織含有大量油脂，RNA豐度低的特點，對RNAiso Plus試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)說明書關于脂肪組織中總RNA的提取部分操作進行了改進和完善，具體步驟如下:
[0032]①組織研磨:將超低溫凍結的150~200mg脂肪組織塊直接放入預冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀(無明顯的可見顆粒，如果沒有研磨徹底會影響RNA的收率和質量)。
[0033]②研磨成的粉末組織轉移至離心管中，然后加入適量的RNAiso Plus (約2ml)中，把離心管置于冰浴中進行混勻，直至均漿液呈無顆粒透明狀。
[0034]③冰上靜置5min，4°C 12，000r/min離心10min，除去上層油脂，取中間層勻漿液轉移至新的離心管中，切勿吸取沉淀。
[0035]④在離心管中加入氯仿(約1/5的RNAiso Plus，即400 μ I )，蓋緊離心管蓋，用手劇烈震蕩15s(氯仿沸點低，易揮發，震蕩時應小心離心管蓋突然彈開)。待溶液充分乳化(無分相現象)后，在冰上靜置IOmin。
[0036]⑤12，OOOr/minfC 離心 15min。
[0037]⑥從離心機中小心取出離心管，此時均漿液分為三層，即:無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉移至另一新的離心管中(切忌吸出白色中間層)。
[0038]⑦向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在冰上靜置15min。
[0039]⑧12，000r/min4°C離心10min。一般在離心后，試管底部會出現沉淀。
[0040]⑨棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇Iml (切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，8，000r/min4°C離心5min后小心棄去乙醇(為了更好地控制RNA中的鹽
離子含量，應盡量除凈乙醇)。
[0041]⑩室溫干燥沉淀5min左右(不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會很難溶解)，加入適量的RNAase-free水溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0042](3 ) cDNA 第一鏈合成
[0043]cDNA第一條鏈的合成根據SMARTerTM RACE cDNA擴增試劑盒(clonetech公司)說明書進行操作。操作步驟如下:
[0044]①為了所有的5'和3' race cDNA合成反應,準備足夠的下列Buffer Mix,并加額外的I反應以確保足夠的量。每次的cDNA合成反應總體積為10 μ I。混合以下試劑，短暫地離心混勻，然后直到⑦都放于冰上。
[0045]
【權利要求】
1.一種蘭州大尾羊PPARG基因的全長cDNA，如SEQ ID NO:7所示。
2.權利要求1所述的蘭州大尾羊PPARG基因全長cDNA的編碼蛋白，如SEQID N0:8所/Jn ο
3.一種表達載體，包含權利要求1所述的蘭州大尾羊PPARG基因的全長cDNA。
4.權利要求1所述的蘭州大尾羊PPARG基因全長cDNA的用途，用于綿羊前體脂肪細胞的誘導分化。·
【文檔編號】C07K14/47GK103849626SQ201410060174
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年2月21日 優先權日:2014年2月21日
【發明者】徐紅偉, 臧榮鑫, 楊具田, 蔡勇, 柏家林, 曹忻, 金方圓, 達小強 申請人:西北民族大學